酿酒酵母菌株及筛选表达有活性的木糖转运蛋白的酿酒酵母菌株的方法

技术领域

本发明涉及一株能胞内表达β-木糖苷酶的酿酒酵母菌株和一株表达高效木糖转运蛋白的 酿酒酵母菌株，以及用于筛选表达了有活性的木糖转运蛋白的酿酒酵母菌株的方法。

背景技术

目前，资源、能源形势问题已经受到世界范围的关注，寻找有发展前景的环境友好的资 源、能源是满足未来社会可持续发展的必要条件。木质纤维素资源年产量巨大，可以作为潜 在的燃料和化工产品生产原料，各种相关的生产技术的研究极为广泛，并且在近几年取得了 很多技术上的突破。木质纤维素的主要成分为：纤维素(cellulose)、半纤维素(hemicellulose) 及木质素(lignin)三部分。纤维素是由葡萄糖残基经β-1，4糖苷键连接成的不分支结晶状多 聚体；半纤维素是包括木糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖等多种糖分的非结晶异质多聚体。 木质纤维素原料水解后，木糖在水解液中含量可达到总糖的30％，其有效利用是提高木质素 原料利用率，降低产品生产成本的关键之一。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是广泛使 用于食品及化工工业的生产菌株，具有抗逆性强、发酵条件易控制、遗传背景清楚、食品级 安全等许多优良特性，是良好的工业生产菌株。尽管酿酒酵母能够有效发酵木质纤维素水解 液中的葡萄糖，但是天然的菌株并不能发酵在木质纤维素中含量仅次于葡萄糖的木糖，必需 对酿酒酵母进行进一步的遗传改造。木糖代谢途径的引入可以使酿酒酵母利用木糖，但是， 木糖摄取效率较低且摄取过程受葡萄糖抑制，使摄取过程成为限制酿酒酵母对木糖利用的主 要障碍之一。天然的酿酒酵母通过非特异性己糖转运蛋白(主要有Hxt1、Hxt2、Hxt4、Hxt5 和HXt7)和半乳糖透性酶(Gal2)摄取木糖，这些转运蛋白都属于Major Facilitator Superfamily (MFS)转运蛋白，对木糖的亲和性较低，其Km值是相对于葡萄糖的10～100倍。部分外源 的木糖转运蛋白在酿酒酵母中的表达，可以促进菌株对木糖的利用，例如，来源于间型假丝 酵母(Candida intermedia)的Gxf1、树干毕赤酵母(Pichia stipitis)的Sut1和拟南芥(Arabidopsis  thaliana)中的At5g5920等，但它们对木糖的亲和力仍远小于对葡萄糖的亲和力，不能满足 构建高效木糖利用重组酿酒酵母的需求。筛选在酿酒酵母中高亲和性木糖专一性转运蛋白， 并在酿酒酵母中表达相应蛋白，仍旧是提高酿酒酵母木糖利用的重要实施手段之一。

此前主要有两种方式筛选和研究在酿酒酵母中有功能的木糖转运蛋白。一种方法是将转 运蛋白库引入带有木糖代谢途径的酿酒酵母菌株中，通过菌株在木糖上生长能力是否有改进， 判断转运蛋白的功能强弱，但是，这种方法获得的假阳性结果过多，且无法定量。另一种方 法是将引入转运蛋白库的菌株在同位素标记的木糖中孵育，测定菌株对木糖的运输能力，这 种方法有潜在危险性，操作复杂，对操作人员和设备的要求都很高。因此，建立一种可以定 量检测的高通量木糖转运蛋白筛选方法是十分必要的。

对硝基酚木糖苷(p-nitrophenyl-β-D-xylopyranoside，pNPX)是一种木糖结构类似物。β- 木糖苷酶可以将pNPX水解，产生等摩尔的对硝基苯酚(pNP)和木糖分子。pNP在碱性条 件下显示黄色，并在405nm处表现最大吸收峰。由于β-木糖苷酶催化的反应速率以及pNP 扩散出细胞的速率都远远高于细胞运输木糖或者pNPX的能力，因此pNP的生成速率反映了 进入细胞的pNPX的摄取速率。通过在大肠杆菌中表达β-木糖苷酶，这种筛选木糖转运蛋白 的方法已经在大肠杆菌中建立。但是由于表达体系的不同以及细胞结构的不同，在酿酒酵母 中相关工作存在一定难度：酿酒酵母为真菌，其细胞壁和细胞膜成分比细菌复杂，可能会造 成分子的出入胞困难；酿酒酵母和大肠杆菌的木糖转运机制不同；酿酒酵母细胞要比大肠杆 菌大一个数量级，沉降系数较大，对读值干扰大，造成难以带菌体实时监测；野生型酿酒酵 母不存在有效的木糖代谢下游基因，其对木糖的转运和利用速率明显低于大肠杆菌，造成 pNPX微量检测的困难，对操作人员和设备的要求较为苛刻，此方法在酵母中的成功建立至 今未见报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一株能表达β-木糖苷酶的酿酒酵母菌株，并提供了一 种用于筛选表达了有活性的木糖转运蛋白的酿酒酵母菌株的方法，还提供了一株经该方法筛 选得到的表达有高活性的木糖转运蛋白的酿酒酵母菌株。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一株表达β-木糖苷酶的酿酒酵母菌株，该菌株为BSW2AB，分类命名为酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae，已于2011年11月17日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心”，保藏编号为CGMCC No.5465。其菌学特征为：CEN.PK102-3A derivative， MATa，leu2-3，ura3-52，pYX242-PGKt-TEFp TPIp-xynB-PGKt，该酵母菌株是单细胞真核微生 物，椭圆形，不运动，固体或液体的全合成营养缺陷型培养基(SC-Leu，该培养基是现有 技术中已有的)的培养条件下为出芽生殖，液体培养条件下以单细胞形式存在，固体培养 时，呈菌落存在，菌落表面光滑、湿润、粘稠，呈乳白色。

该菌株能够高水平的胞内表达有活性的β-木糖苷酶，与普通的酿酒酵母菌株相比较，其 为leu和ura双缺陷型单倍体菌株，可以实现leu^-和ura^-标记的附加体质粒的共表达，本菌株 用pYX242(leu^-)附加体质粒高效表达了木糖苷酶基因，可以与克隆了转运蛋白基因的ura^- 标记的附加体质粒共表达，达到筛选转运蛋白基因的目的。该菌株是发明人通过重组构建并 筛选得到的。

一种筛选能表达有活性的木糖转运蛋白的酿酒酵母菌株的方法，步骤如下：

(1)菌株培养：将待检测菌株和常规菌株分别进行常规培养，得菌液；

(2)将上述培养得到的菌液离心去掉培养基，然后用磷酸盐缓冲液重悬，得细胞重悬液；

(3)向上述细胞重悬液中加入木糖结构类似物pNPX(对硝基苯-β-D-木糖苷)，孵育后 离心取上清，加入等体积的Na₂CO₃溶液，测定405nm处光吸收值OD_405nm；

(4)建立pNP在405nm处光吸收值-pNP含量标准曲线以及菌液OD_600nm值-细胞干重标 准曲线，结合步骤(3)测得的OD_405nm，计算得到转运蛋白对pNPX的转运速率(用完整细 胞测得的酶活)；

(5)判断：对比待检测菌株的转运速率与常规菌株的转运速率，若待检测菌株的转运速 率高于常规菌株的转运速率，则证明该待检测菌株表达的木糖转运蛋白为能提高酿酒酵母菌 株木糖转运能力的蛋白，差值越大，说明该待检测菌株表达的木糖转运蛋白转运木糖的能力 越高；若待检测菌株的转运速率不高于常规菌株的转运速率，则证明该待检测菌株没有表达 能提高酿酒酵母木糖转运能力的蛋白。

所述待检测菌株可以是通过以下方法构建的：

(1)表达载体构建：建立包含有待筛选转运蛋白基因的重组载体；

(2)重组菌株构建：将步骤(1)中建立的重组载体转化到胞内表达β-木糖苷酶的酿酒 酵母菌株中，并通过筛选得到转化成功的转化子，即为待检测菌株。

所述待筛选转运蛋白基因可以来自各种来源，比如：来自植物乳杆菌(Lactobacillus  plantarum)的转运蛋白基因AraT。

所述构建表达载体所用的质粒为pJFE3(YEplac195，TEFp-PGKt，Ura^-，Amp⁺)空质粒(该质 粒是现有技术中已有的)。

所述转化方法为醋酸锂转化法。

所述筛选成功转化子的方式为：用添加2％葡萄糖(质量分数)的全合成营养缺陷型培养 基SC-Leu-Ura(该培养基是现有技术中已有的)筛选正确的转化子。

所述常规菌株为不含有待筛选转运蛋白基因的胞内表达β-木糖苷酶的酿酒酵母菌株。

所述建立pNP在405nm处光吸收值-pNP含量标准曲线的方法为：根据pH6.5的PBS液 配制梯度浓度的pNP，并测定405nm处光吸收值OD_405nm，建立标准曲线；所得标准曲线方 程为：y_(OD405nm)＝0.0916x_(pNP/nmol)+0.0735，x取值范围优选在1.5-7.5。

所述建立菌液OD_600nm值-细胞干重标准曲线的方法为：取培养的菌液，离心水洗，抽滤、 烘干后测定干重；稀释六个水平，根据稀释倍数计算干重并测量相应OD₆₀₀；在实验中直接 测定的是菌液的OD₆₀₀，根据此公式可以具体算出每毫克干重细胞的转运速率；所得标准曲 线方程为：y_(mgdw/ml)＝0.2365x_(oD600nm)+0.1149，x取值范围优选在1-22。

所述“待检测菌株的转运速率高于常规菌株的转运速率”是指待检测菌株转运速率高出 常规菌株转运速率的18.5％，此时为显著高于。

上述筛选能表达有活性的木糖转运蛋白的酿酒酵母菌株的方法，也可以用于筛选能在酿 酒酵母中高活性运输木糖的转运蛋白。

通过上述方法，本发明还获得一株高木糖转运能力的重组酿酒酵母菌株，该菌株为 BSW2ABT，分类命名为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，已于2011年11月17日保藏于 “中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCC No.5464。该菌株 表达了克隆自植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的转运蛋白基因AraT，其木糖转运能 力较普通酿酒酵母菌株提高了一倍以上。可以预见，该菌株在利用含木糖原料生产其他产品 领域中具有广阔的用途，比如以该菌株为出发菌株，引入木糖代谢途径，可以构建具有高水 平利用木糖能力的重组菌株。

本发明的方法中，用于筛选转运蛋白的反应底物是木糖结构类似物——对硝基苯-β-D-木 糖苷(p-nitrophenyl-β-D-xylopyranoside，pNPX)，如图1所示；待筛选转运蛋白基因是通过 酿酒酵母表达载体引入酿酒酵母菌株的；转运蛋白对pNPX的转运速率由pNPX被β-木糖苷 酶水解获得的产物硝基苯酚(p-nitrophenol，pNP)生成速率来界定；pNP生成速率由pNP引 起的反应液吸光度变化速率来计算；转运蛋白对木糖的运输能力通过转运蛋白对pNPX运输 效率来间接界定。本发明的方法可有效避免假阳性情况的出现，并且可以定量描述菌株转运 木糖的能力，操作不存在危险性，操作步骤简便，对操作人员和设备的要求不苛刻，具有通 用性。

附图说明

菌株BSW2AB，分类命名为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，已于2011年11月17日 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5465，保藏 地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。

菌株BSW2ABT，分类命名为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，已于2011年11月17 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5464，保 藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。

图1是酿酒酵母木糖转运蛋白的高通量筛选方法原理示意图。本方法将木糖转运蛋白的 活性和在胞内表达的木糖苷酶相关联，利用木糖结构类似物对硝基酚木糖苷 (p-nitrophenyl-β-D-xylopyranoside，pNPX)代替木糖进行定量分析。与酿酒酵母完整细胞进 行孵育的pNPX在木糖转运蛋白的作用下进入胞内，被木糖苷酶迅速水解为对硝基苯酚(pNP) 和木糖，pNP可以快速扩散至胞外，在碱性条件下显示黄色，并在405nm处表现最大吸收峰。

图2是酿酒酵母附加体穿梭质粒pYX242-PGKt-TEFp-xynB示意图。其中木糖苷酶基因 (xynB)克隆自短小芽胞杆菌(Bacilluspumilus)，在酿酒酵母TPIp启动子控制下表达。

图3是酿酒酵母附加体穿梭质粒pJFE3-araT示意图。其中，转运蛋白araT克隆自植物乳 杆菌(Lactobacillus plantarum)，在酿酒酵母TEFp启动子控制下表达。

图4是BSW2ABP(CEN.PK102-3A derivative，MATa，leu2-3，ura3-52，pYX242-PGKt-TEFp TPIp-xynB-PGKt，pJFE3)基因工程改造菌株的胞内外和完整细胞状态下测定的木糖苷酶酶活。 其中□代表BSW2ABP菌株；1、2、3分别代表培养10小时(初始OD_600nm为0.5)时细胞破 碎液中测得的木糖苷酶酶活(即，细胞内木糖苷酶活性)；和细胞分离后，培养液中的木糖苷 酶酶活(即，细胞分泌到细胞外的木糖苷酶活性)；和培养液分离后，未经破碎的细胞能够测 定到的木糖苷酶酶活(即，利用完整细胞测定时可以测到的木糖苷酶活性)。木糖苷酶酶活： 1U定义为1min内分解pNPX生成的pNP的微摩尔数(μmol)。细胞内木糖苷酶活性较高， 证明木糖苷酶在酿酒酵母中的高效表达；细胞分泌到细胞外的木糖苷酶活性很低，几乎检测 不到，证明此木糖苷酶是胞内酶；利用完整细胞测定时可以检测到木糖苷酶酶活，证明了此 种检测方法的可操作性，同时，其结果远小于(相差100倍以上)细胞内的木糖苷酶活性， 证明进入细胞的pNPX可以被木糖苷酶迅速水解，酶解过程是非限速步骤。

图5是菌株BSW2ABP在完整细胞状态下，所测定的OD_405nm读值与孵育时间之间的对 应关系。证明取两个时间点的数据来间接表征整个动力学过程趋势的合理性。其中，BSW2ABP 菌株培养15h。

图6是菌株BSW2ABP在完整细胞状态下，不同孵育时间的pNP生成速率(即转运蛋白 的转运速率)。不同孵育时间(60min以内)下所得的pNP生成速率基本一致，证明可以用某 个时间点的pNP生成速率来表征初速率。其中，BSW2ABP菌株培养15h。

图7是菌株BSW2ABP在完整细胞状态下，胞内的和扩散至胞外的pNP含量的测定结果。 其中，1、2分别代表BSW2ABP菌株孵育10min和30min的实验结果；□代表胞内的pNP量， ■代表扩散至胞外的pNP量；BSW2ABP菌株培养15h。胞内的pNP量远小于(相差近20倍) 扩散至胞外的pNP量，证明胞内生成的pNP可以迅速出胞，此步骤是非限速步骤。

图8是菌株BSW2ABT(CEN.PK102-3A derivative，MATa，leu2-3，ura3-52， pYX242-PGKt-TEFp TPIp-xynB-PGKt，pJFE3-araT)的pNPX运输能力测定结果。其中，□代 表BSW2ABP菌株，■代表BSW2ABT菌株；菌株培养时间为10h。超表达araT的菌株其木 糖运输能力显著增强，比对照菌株提高了1.06倍。

图9是检测菌株BSW2ABP和BSW2ABT转运pNPX和不同浓度木糖之间的竞争关系。 其中，□代表BSW2ABP菌株，■代表BSW2ABT菌株；菌株培养时间为10h。随着胞外木糖 浓度的提高，两株菌的pNPX的利用速率呈下降趋势，而且BSW2ABT菌株下降趋势更明显， 证明无论对于酿酒酵母内源性木糖转运蛋白还是AraT而言，pNPX和木糖之间均存在竞争关 系，是底物类似物，因此，转运蛋白转运pNPX的效率可以反应其转运木糖的效率。

图10是在两菌株BSW2ABP和BSW2ABT竞争关系测定实验中，转运pNPX初速率倒数 和不同浓度木糖之间的线性关系。在竞争性关系的米氏方程中，特定底物的初速率倒数和竞 争性底物浓度之间存在线性关系。实验中测定的BSW2ABP和BSW2ABT菌株转运pNPX初 速率倒数和不同浓度木糖之间的线性关系拟合均较好，R²＝0.925和0.942，进一步证明了pNPX 是木糖的竞争性底物。

其中，▲代表BSW2ABT菌株；◆代表BSW2ABP菌株；菌株培养时间为10h。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1：表达木糖苷酶的菌株BSW2ABP的构建和木糖苷酶酶活测定

方法如下：

(1)菌种选择：选用构建的胞内异源表达有木糖苷酶的实验室菌株BSW2AB (CEN.PK102-3A derivative，MATa，leu2-3，ura3-52，pYX242-PGKt-TEFp TPIp-xynB-PGKt)做 受体株菌，该菌株分类命名为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，，已于2011年11月17日保 藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCC No.5465。其 菌学特征为：CEN.PK102-3A derivative，MATa，leu2-3，ura3-52，pYX242-PGKt-TEFp TPIp-xynB-PGKt，该酵母菌株是单细胞真核微生物，椭圆形，不运动，固体或液体的全合 成营养缺陷型培养基(SC-Leu，该培养基是现有技术中已有的)的培养条件下为出芽生殖， 液体培养条件下以单细胞形式存在，固体培养时，呈菌落存在，菌落表面光滑、湿润、 粘稠，呈乳白色。该菌株的构建方法简述如下：木糖苷酶基因(基因序列和氨基酸序列为现 有技术中已有的，基因序列在NCBI上blast之后，一致性与其最接近的为96％；氨基酸序列 在NCBI上blast之后，一致性与其最接近的为97％，序列见序列表)为Bp-xynB，克隆自Bacillus pumilus AS1.940，构建重组载体所用上游引物XynBWup为： 5’-CGGCAATTGATGAAGATTATCAATCCAGTGC-3’，下游引物XynBWdown为： 5’-CATGCCATGGTTATTCGTCTGTTTCCTCATAG-3’。构建的重组载体为： pYX242-PGKt-TEFp TPIp-xynB-PGKt异源表达载体，如图2所示；

(2)载体选择：采用实验室前期构建的pJFE3(YEplac195，TEFp-PGKt，Ura^-，Amp⁺)空质粒；

(3)菌株构建：质粒pJFE3用醋酸锂转化法转化BSW2AB菌株，用添加2％葡萄糖的 全合成营养缺陷型培养基SC-Leu-Ura筛选正确转化子；

(4)菌株培养：将步骤(3)中验证正确的转化子单菌落用添加2％葡萄糖的全合成营养 缺陷型培养基SC-Leu-Ura，转接40ml于100ml小三角瓶中，培养1天后再转接一次，初始 OD₆₀₀接为0.5，培养条件均为30℃，200r·min^-1；

(5)完整细胞悬液制备：取步骤(4)中培养10小时的菌液，离心(3000r·min^-1，5min) 去掉原培养基后用pH6.5的50mmol/L PBS液重悬；

(6)完整细胞状态下测定木糖苷酶酶活：用96孔平板或EP管取适量步骤(5)中的完 整细胞悬液，加入终浓度为6mmol/L的pNPX，两者总体系为120μl，随后置于30℃，200r·min^-1摇床中孵育30分钟，离心取上清100μl加入96孔平板中，再加入等体积的0.4mol/L的Na₂CO₃水溶液，混匀后，用酶标仪于OD_405nm下测定孵育30分钟后生成的对硝基酚(pNP)的光吸 收值。孵育初始值测定时，先不加pNPX，只加菌悬液与实验组共同孵育，离心取适量体积 上清后加入终浓度6mmol/L的pNPX，两者总体系为100μl，再加入100μl的0.4M的碳酸钠 水溶液，混匀后，用酶标仪于OD_405nm下测定光吸收值；根据pH6.5的PBS液配制的pNP标 准曲线y_(OD405nm)＝0.0916x_(pNP/nmol)+0.0735和实验室菌株的菌液OD_600nm值和细胞干重的对应 关系y_(mgdw/ml)＝0.2365x_(OD600nm)+0.1149，计算得到完整细胞状态下的木糖苷酶酶活，1U定义 为1min内分解pNPX生成的pNP的微摩尔数(μmol)，见图4；

(7)胞内、外木糖苷酶酶活的测定：取培养10小时的菌悬液4ml，离心上清液即为胞 外粗酶液；用1ml pH6.5的50mmol/L PBS悬浮沉淀细胞，加入0.6g玻璃珠，用组织匀浆器 破碎细胞：5500rmin^-1，20s，8次，每两次破碎之间样品冰浴4min；13000rmin^-1，离心10min， 上清即为胞内粗酶液；96孔平板中的测定体系：取适量胞内外酶液配置含6mmol/LpNPX的 pH6.5磷酸盐缓冲液，共100μl，30℃静置孵育10min后加入100μl的0.4mol/L的碳酸钠混匀 后测定；对照组和实验组采取相同处理，只是先不加pNPX，预留体积，终止后再加入pNPX 测定；用在405nm处的净光吸收值，根据pH6.5的PBS液配制的pNP标准曲线y_(OD405nm)＝0.0916x_(pNP/nmol)+0.0735和实验室菌株的菌液OD_600nm值和细胞干重的对应关系y_(mg dw/ml)＝0.2365x_(OD600nm)+0.1149，计算得到胞内、外木糖苷酶的酶活，1U定义为1min内分解pNPX 生成的pNP的微摩尔数(μmol)，见图4。

所述建立pNP在405nm处光吸收值-pNP含量标准曲线的方法为：根据pH6.5的PBS液 配制梯度浓度的pNP，并测定405nm处光吸收值OD_405nm，建立标准曲线；所得标准曲线方 程为：y_(OD405nm)＝0.0916x_(pNP/nmol)+0.0735，x取值范围在1.5-7.5。

所述建立菌液OD_600nm值-细胞干重标准曲线的方法为：取培养的菌液，离心水洗，抽滤、 烘干后测定干重；稀释六个水平，根据稀释倍数计算干重并测量相应OD₆₀₀；在实验中直接 测定的是菌液的OD₆₀₀，根据此公式可以具体算出每毫克干重细胞的转运速率；所得标准曲 线方程为：y_(mg dw/ml)＝0.2365x_(OD600nm)+0.1149，x取值范围在1-22。

实施例2：孵育时间和转运速率测定值之间的关系测定

方法如下：

(1)选用实施例1步骤(4)中培养15小时的菌液，离心(3000r·min^-1，5min)去掉原 培养基后用pH6.5的50mmol/L PBS液重悬；

(2)孵育时间和转运速率测定值之间的关系测定：用96孔平板或EP管取适量步骤(1) 中的完整细胞悬液，加入终浓度为6mmol/L的pNPX，随后置于30℃，200r·min^-1摇床中， 分别孵育10min、20min、30min、40min、50min和60min，离心取上清100μl加入96孔平板 中，再加入等体积的0.4mol/L的Na₂CO₃水溶液，混匀后，用酶标仪于OD_405nm下测定孵育后 生成的对硝基酚(pNP)的光吸收值。孵育初始值测定时，加入pNPX后立即离心取适量体 积上清后加入终浓度6mmol/L的pNPX，两者总体系为100μl，再加入100μl的0.4mol/L的碳 酸钠水溶液，混匀后，用酶标仪于OD_405nm下测定光吸收值。测定得到OD_405nm读值和孵育时 间之间的对应关系，见图5；根据pH6.5的PBS液配制的pNP标准曲线y_(OD405nm)＝0.0916x _(pNP/nmol)+0.0735和实验室菌株的菌液OD_600nm值和细胞干重的对应关系y_(mgdw/ml)＝0.2365x_(OD600nm)+0.1149，计算得到，在60分钟内，孵育时间不影响转运速率值，见图6。

实施例3：完整细胞测定状态下，pNP胞内外含量的测定

方法如下：

(1)选用实施例1步骤(4)中培养15小时的菌液，离心(3000r·min^-1，5min)去掉原 培养基后用pH6.5的50mmol/L PBS液重悬；

(2)完整细胞测定状态下，pNP胞外含量的测定：用96孔平板或EP管取适量步骤(1) 中的完整细胞悬液，加入终浓度为6mmol/L的pNPX，随后置于30℃，200r·min^-1摇床中， 分别孵育10min和30min；离心取上清100μl加入96孔平板中，再加入等体积的0.4mol/L的 Na₂CO₃水溶液，混匀后，用酶标仪于OD_405nm下测定孵育后生成的对硝基酚(pNP)的光吸 收值。孵育初始值测定时，先不加pNPX，只加菌悬液与实验组共同孵育，离心取适量体积 上清后加入终浓度6mmol/L的pNPX，两者总体系为100μl，再加入100μl的0.4M的碳酸钠 水溶液，混匀后，用酶标仪于OD_405nm下测定光吸收值；根据pH6.5的PBS液配制的pNP标 准曲线y_(OD405nm)＝0.0916x_(pNP/nmol)+0.0735和实验室菌株的菌液OD_600nm值和细胞干重的对应 关系y_(mg dw/ml)＝0.2365x_(OD600nm)+0.1149，计算得到胞外pNP的含量，见图7；

(3)完整细胞测定状态下，pNP胞内含量的测定：取(2)中孵育10min和30min的完 整细胞测定后的菌泥，经1ml的PBS快速洗后加入408μl的0.2mol/L的碳酸钠溶液，0.2g 玻璃珠，6000rpm，30s，用组织匀浆器破碎细胞4次，离心，用96孔平板取200μl在405nm 处测定读值，根据pH6.5的PBS液配制的pNP标准曲线y_(OD405nm)＝0.0916x_(pNP/nmol)+0.0735 和实验室菌株的菌液OD_600nm值和细胞干重的对应关系y_(mg dw/ml)＝0.2365x_(OD600nm)+0.1149，计 算得到胞内的pNP含量，见图7。

实施例4：AraT的克隆和菌株BSW2ABT的pNPX运输能力的测定

方法如下：

(1)菌种选择：选用构建的胞内异源表达有木糖苷酶(Bp-xynB)的实验室菌株BSW2AB (CEN.PK102-3A derivative，MATa，leu2-3，ura3-52，pYX242-PGKt-TEFp TPIp-xynB-PGKt)做受 体株菌；

(2)表达载体构建：用上下游引物AraTup： 5’-CGCGGATCCATGAATAAGCAGAAAAAGGTTT-3’和AraTdown： 5’-ACGCGTCGACTTAATGACTCGCTTGTTGTACG-3’从植物乳杆菌(Lactobacillus  plantarum)DNA上克隆转运蛋白基因AraT，利用BamH I和SalI两酶切位点构建酿酒酵母 附加体穿梭质粒pJFE3-araT，如图3所示；

(3)菌株构建：质粒pJFE3-araT用醋酸锂转化法转化BSW2AB菌株，用添加2％葡萄 糖的全合成营养缺陷型培养基SC-Leu-Ura筛选正确转化子；

(4)菌株培养：将步骤(3)中验证正确的转化子单菌落用添加2％葡萄糖的全合成营养 缺陷型培养基SC-Leu-Ura，转接40ml于100ml小三角瓶中，培养1天后再转接一次，初始 OD₆₀₀接为0.5，培养条件均为30℃，200r·min^-1；

(5)完整细胞悬液制备：取步骤(4)中培养10小时的菌液，离心(3000r·min^-1，5min) 去掉原培养基后用pH6.5的50mmol/L PBS液重悬；

(6)完整细胞状态下测定木糖苷酶酶活：用96孔平板或EP管取适量步骤(5)中的完 整细胞悬液，加入终浓度为6mmol/L的pNPX，两者总体系为120μl，随后置于30℃，200r·min^-1摇床中孵育30分钟，离心取上清100μl加入96孔平板中，再加入等体积的0.4mol/L的Na₂CO₃水溶液，混匀后，用酶标仪于OD_405nm下测定孵育30分钟后生成的对硝基酚(pNP)的光吸 收值。孵育初始值测定时，先不加pNPX，只加菌悬液与实验组共同孵育，离心取适量体积 上清后加入终浓度6mmol/L的pNPX，两者总体系为100μl，再加入100μl的0.4mol/L的碳酸 钠水溶液终止反应，混匀后，用酶标仪于OD_405nm下测定光吸收值；根据pH6.5的PBS液配 制的pNP标准曲线y_(OD405nm)＝0.0916x_(pNP/nmol)+0.0735和实验室菌株的菌液OD_600nm值和细 胞干重的对应关系y_(mgdw/ml)＝0.2365x_(OD600nm)+0.1149，计算得到完整细胞状态下的木糖苷酶 酶活，见图4；

实施例5：菌株BSW2ABP和BSW2ABT的pNPX和木糖的竞争关系测定

方法如下：

(1)选用实施例4步骤(4)中培养10小时的菌液，离心(3000r·min^-1，5min)去掉原 培养基后用pH6.5的50mmol/L PBS液重悬；

(2)竞争关系验证：用96孔平板或EP管取适量步骤(1)中的完整细胞悬液，加入终 浓度为6mmol/L的pNPX，另外加入终浓度分别为50mmol/L、100mmol/L、150mmol/L、 200mmol/L、250mmol/L的木糖，三者总体系为120μl，随后置于30℃，200r·min^-1摇床中孵 育30分钟，离心取上清100μl加入96孔平板中，再加入等体积的0.4mol/L的Na₂CO₃水溶 液，混匀后，用酶标仪于OD_405nm下测定孵育30分钟后生成的对硝基酚(pNP)的光吸收值。 孵育初始值测定时，先不加pNPX，只加菌悬液与实验组共同孵育，离心取适量体积上清后 加入终浓度6mmol/L的pNPX，两者总体系为100μl，再加入100μl的0.4mol/L的碳酸钠水溶 液，混匀后，用酶标仪于OD_405nm下测定光吸收值；根据pH6.5的PBS液配制的pNP标准曲 线y_(OD405nm)＝0.0916x_(pNP/nmol)+0.0735和实验室菌株的菌液OD_600nm值和细胞干重的对应关系 y_(mg dw/ml)＝0.2365x_(OD600nm)+0.1149，计算得到该转运蛋白对pNPX的转运速率；在两菌株中验 证不同浓度的木糖对pNPX的竞争关系，证明可以用pNPX的转运速率来反映木糖的转运速 率，见图8和图9。

实施例6：AraT高活性木糖转运蛋白突变体的高通量筛选

通过上述实施例4的方法，本发明获得了一株高木糖转运能力的重组酿酒酵母菌株，该 菌株为BSW2ABT，分类命名为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，已于2011年11月17日 保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCC No.5464。 其菌学特征为：该酵母菌株是单细胞真核微生物，椭圆形，不运动，固体或液体的全合成 营养缺陷型培养基(SC-Leu，该培养基是现有技术中已有的)的培养条件下为出芽生殖， 液体培养条件下以单细胞形式存在，固体培养时，呈菌落存在，菌落表面光滑、湿润、 粘稠，呈乳白色。CEN.PK102-3A derivative，MATa，leu2-3，ura3-52，pYX242-PGKt-TEFp TPIp-xynB-PGKt，pJFE3-AraT。该菌株表达了克隆自植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的 糖转运蛋白基因AraT，其木糖转运能力较普通酿酒酵母菌株提高了一倍以上(1.06倍，见图 8)。可以预见，该菌株在利用含木糖原料生产其他产品领域中具有广阔的用途，如以该菌株 为出发菌株，引入木糖代谢途径，可以构建具有高水平利用木糖能力的重组菌株。高通量筛 选方法如下：

(1)菌种选择：选用构建的胞内异源表达有木糖苷酶(Bp-xynB)的实验室菌株BSW2AB (CEN.PK102-3A derivative，MATa，leu2-3，ura3-52，pYX242-PGKt-TEFp TPIp-xynB-PGKt)做受 体株菌；

(2)表达载体构建：用上下游引物AraTup： 5’-CGCGGATCCATGAATAAGCAGAAAAAGGTTT-3’和AraTdown： 5’-ACGCGTCGACTTAATGACTCGCTTGTTGTACG-3’，用植物乳杆菌(Lactobacillus  plantarum)DNA上克隆的转运蛋白基因AraT为模板，采用易错PCR的方式获得AraT的突 变库，利用BamH I和Sal I两酶切位点在pJFE3酿酒酵母附加体穿梭质粒上构建突变库表达 载体；

(3)菌株构建：构建的质粒用醋酸锂转化法转化BSW2AB菌株，用添加2％葡萄糖的全 合成营养缺陷型培养基SC-Leu-Ura筛选转化子；

(4)菌株培养：将步骤(3)中生长的转化子单菌落点种在含200μl培养基的96孔平 板中，每板同时点种3孔BSW2ABT未突变菌株作为对照，培养基为含2％葡萄糖的全合成 营养缺陷型培养基SC-Leu-Ura，培养1-2天(长至稳定期，保证各孔的OD_600nm值基本一致) 后，再各孔对应转接10μl于190μl新鲜培养基中，培养10h；培养条件均为30℃，200r·min^-1；

(5)完整细胞悬液制备：取步骤(4)中培养10小时的菌液，离心(3000r·min^-1，5min) 去掉原培养基后用102μl pH6.5的50mmol/L PBS液重悬；

(6)完整细胞状态下测定30分钟后生成的对硝基酚产生的光吸收(初筛)：向步骤(5) 的完整细胞测定酶液中，加入40mmol/L的pNPX 18μl，随后置于30℃，200r·min^-1摇床中孵 育30分钟，离心(3000r·min^-1，5min)取上清100μl加入96孔平板中，再加入等体积的0.4mol/L 的Na₂CO₃水溶液，混匀后，用酶标仪于OD_405nm下测定孵育30分钟后生成的对硝基酚(pNP) 的光吸收值。筛选光吸收值比BSW2ABT未突变株高的菌株；

(7)高突变株的木糖转运速率的测定(复筛)：按步骤(4)和(5)制备步骤(6)中得 到的高突变株的完整细胞悬液，按照步骤(6)的方法重新测定生成的对硝基酚(pNP)的光 吸收值，并测定OD_600nm读值。根据pH6.5的PBS液配制的pNP标准曲线y_(OD405nm)＝0.0916x _(pNP/nmol)+0.0735和实验室菌株的菌液OD_600nm值和细胞干重的对应关系y_(mg dw/ml)＝0.2365x_(OD600nm)+0.1149，计算得到转运蛋白对pNPX的转运速率(即利用完整细胞测得的酶 活)，筛选木糖转运速率比BSW2ABT未突变株提高的菌株；

(8)转接(7)中筛选得到的高活性菌株，反提质粒后，转化大肠杆菌扩培，测序，得 到高活性的转运蛋白基因序列。