ALC1在制备白血病耐药逆转剂及作为耐药性白血病诊断试剂方面的应用

技术领域

本发明涉及白血病耐药性领域，具体涉及ALC1基因对耐药性白血病的诊断、敏感性 化疗剂的筛选及制备白血病耐药性逆转剂的用途。

背景技术

白血病是造血干细胞克隆性疾病，其特征为克隆中的白血病细胞胞增殖失控分化障碍， 凋亡受阻，而停滞在细胞发育的不同阶段。白血病的治疗主要是化学治疗、靶向治疗及骨 髓移植，其中骨髓移植受供体来源、患者年龄等多因素的限制，所以实际能接受骨髓移植的 患者仅为少数，大部分患者需进行化学治疗及靶向药物治疗。在白血病的药物治疗过程中， 联合化疗已取得长足的进展，绝大部分患者可以缓解，然而大都以化疗失败而告终，白血病 细胞会产生多药耐药，即细胞对一种抗肿瘤药物出现耐药的同时，对其它结构各异、作用机 制不同的抗肿瘤药物产生交叉耐药现象，此为白血病化疗失败和复发的主要原因，是临床 上亟待解决的问题。当前治疗白血病的药物种类不断增多，根据白血病细胞的耐药分子表型 及其对药物的反应特征选择最佳化疗方案，将直接改善疗效，并使患者免受无效药物的毒 副作用，提高病患生存率，因此，个体化药物敏感性检测及耐药性逆转治疗非常关键。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可用于诊断耐药性白血病的试剂盒，以及白血病耐药性逆 转剂。

本发明的第一个方面在于克服白血病患者常规药物治疗不能有效预测其化疗剂耐受的 缺点，利用患者外周血或骨髓样本，进行体外培养及药物作用效果测定，以用药前后ALC1 基因的表达水平变化作为药物耐受性评估指标，并结合药物处理后白血病细胞的生长特性 筛选出敏感性化学治疗或靶向治疗药物。发明提供了ALC1基因在作为耐药性白血病诊断试 剂方面的应用，以及一种诊断耐药性白血病的试剂盒，该试剂盒包括：Oligo(dT)₁₅、反转 录酶(M-MLV)、M-MLV RT酶反应缓冲液、RNase抑制剂、PCR缓冲液、dNTPs、MgCl₂、 特异性引物、Taq酶，用以进行ALC1基因的定性及定量检测。所述特异性引物序列为：SEQ  ID NO：5：5′-CCTCCTTCTATGATCATGTTG-3′和SEQ ID NO：6：5′-TGTTCTCATCCCA GGCCTTG-3′。优选的试剂盒中还含有对照品，其中阳性对照是正常细胞的ALC1 cDNA 样品，阴性对照为无ALC1的灭菌双蒸水。

利用上述试剂盒所设计的引物进行反转录PCR，对ALC1基因进行定性及半定量分析。

本发明的第二个方面是ALC1在制备白血病耐药逆转剂的用途。所述ALC1基因抑制剂 可逆转药物耐受性，提高各类药物的细胞增殖抑制作用及促凋亡作用，故可用于制备急、 慢性白血病多药耐药逆转剂。该ALC1基因抑制剂可以是调节ALC1编码基因表达的反义核 酸、RNA干扰(RNAi)分子(可以是siRNA、shRNA、ddRNAi构建体或其转录模板，如编 码shRNA的DNA)、ALC1特异性抗体等。本发明的ALC1抑制剂和/或复合物可以通过任 何适合的途径给药。优选地，本发明的ALC1基因抑制剂是ALC1 siRNA。各类商品化的或 者合成的ALC1 siRNA均可实现本发明。优选地，该ALC1 siRNA的序列为：

正义链SEQ ID NO：1：5’-GGAUUCACCUACGCUCUUATT-3’，反义链SEQ ID NO：2： 5’-UAAGAGCGUAGGUGAAUCCCT-3’；或者：

正义链SEQ ID NO：3：5’-GCAUCGUGAUCGUUCCAAUTT-3’，反义链SEQ ID  NO：4：5’-AUUGGAACGAUCACGAUGCTG-3’。

发明同时提供了一种用于治疗耐药性白血病的药物复合物，所述该复合物包含ALC1 抑制剂、化疗剂、药物相关赋形剂、稀释剂或载体。所述化疗剂可以是任何一种临床常用 化疗剂。

ALC1(Amplified in Liver Cancer 1)是我们应用染色体切割及筛选杂交技术在人肝癌细 胞的染色体1q21区分离并克隆出的新癌基因，在正常肝细胞中无表达，但肝癌细胞中高度 扩增，与肝癌的发生、发展密切相关，同源性比较和功能域分析结果显示其编码的蛋白含 有保守的SNF2_N功能域、解旋酶功能域及Macro功能域，属SWI2/SNF2相关的ATP酶 超家族，与染色质解链有关。ALC1能快速而短暂地定位于DNA损伤部位，依赖聚腺苷二 磷酸核糖聚合酶[poly(ADP ribose)polymerase，PARP](一种DNA结合蛋白酶)，选择性识 别并结合DNA缺口，调控染色质结构，ALC1的异常表达，将显著提高DNA对损伤的敏 感性^[2-3]。

在研究ALC1基因生理作用的实验中我们发现从胚胎正常发育到成年时期，ALC1始终 在造血组织内表达，提示其与造血功能有关，成年小鼠骨髓内有ALC1的基础表达，通过外 周血可检测到微弱的ALC1 mRNA表达信号。鉴于ALC1在肝癌发生中的重要作用，促使 我们进一步探究ALC1与人类血液肿瘤的关系。通过对各类急、慢性白血病患者骨髓及外周 血RT-PCR检测发现普遍存在ALC1异常扩增及表达，其中产生耐药的白血病患者其骨髓及 外周血中ALC1的表达水平高于非耐药性白血病患者；体外实验结果显示耐药性白血病细 胞株在化疗药物作用下其ALC1表达水平、细胞增殖能力明显高于非耐药性亲本细胞株， 敲减ALC1的表达可逆转白血病细胞的耐药性，提高化疗药物对细胞增殖的抑制作用及促 凋亡作用。ALC1的异常表达在白血病耐药性形成的作用及相关机制迄今尚无报道。发明首 次发现ALC1可作为耐药性白血病标志分子。

发明运用RT-PCR方法检测到正常人、感染致白血球升高患者及各类急、慢性白血病患 者外周血均有ALC1表达，但白血病患者外周血ALC1表达水平显著高于感染性白血球升 高患者与正常人，后两者呈微弱表达且无明显差异。各类急、慢性白血病患者骨髓ALC1 表达明显高于正常人骨髓。

体外实验比较人慢性粒细胞白血病急性红白血病细胞株K562与耐药细胞株K562/ADR (阿霉素耐药细胞株，1.0μg/ml阿霉素培养体系)、人急性髓细胞白血病细胞株HL-60及其 多药耐药细胞株HL-60/ADR(阿霉素耐药细胞株，0.5μg/ml阿霉素培养体系)ALC1表达 水平，结果显示耐药株ALC1表达明显高于非耐药亲本细胞株，基因表达量相差达3倍以 上，表明ALC1基因在不同类别白血病细胞药物耐受机制中发挥重要作用，故ALC1异常表 达可作为白血病标志基因用于临床筛查及耐药诊断。

对K562/ADR细胞及HL-60/ADR细胞进行ALC1 siRNA干扰后使用化疗药物，MTT 检测结果显示K562/ADR及HL-60/ADR细胞对各种化疗药的敏感性显著提高，表明抑制 ALC1表达可逆转白血病细胞的耐药性，ALC1抑制剂可作为临床耐药性白血病的耐药逆转 剂进行化疗药物的辅助治疗。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

耐药性白血病诊断试剂盒所检测的基因ALC1为造血细胞异常增殖的特异性标志分子， 可用外周血或骨髓样本直接检测，其检测时间周期短、效率高，能对ALC1转录本进行准确 定性及半定量分析，操作简便且成本较低，易于在临床推广使用。应用ALC1制备耐药性白 血病逆转剂的作用效果显著，能明显提高耐药性白血病细胞对药物的敏感性，对各类白血 病均有效，可作为广谱的耐药逆转剂，故有广阔的临床应用前景。

附图说明

图1.ALC1在人外周血及骨髓内的表达

a：人外周血ALC1表达。N为正常人血液(n＝10)；F为普通外科术后感染患者血液(n＝6)； AML：急性髓性白血病(n＝8)；ALL：急性淋巴细胞白血病(n＝6)；CML：慢性粒细胞白 血病(n＝5)；CLL：慢性淋巴细胞白血病(n＝5)。b：人外周血ALC1表达相对值，示与感 染性白血球升高患者差异有显著性意义(**P＜0.01)，与正常人相比差异有显著性意义(Δ P＜0.01)。感染性白血球升高患者与正常人相比差异无显著性意义(P＞0.05)。c：骨髓内 ALC1表达。各类急、慢性白血病患者骨髓ALC1表达明显高于正常人骨髓(**P＜0.01)。

图2.急、慢性白血病耐药细胞及非耐药亲本细胞ALC1表达

a：K562/ADR，K562，HL-60/ADR，HL-60细胞ALC1mRNA表达水平；b：ALC1表达相对 值，K562/ADR耐药细胞ALC1 mRNA相对值高于非耐药亲本细胞3.76倍(P＜0.05)； HL-60/ADR耐药细胞ALC1 mRNA相对值高于非耐药亲本HL-60细胞1.87倍(P＜0.05)。

图3.ALC1 siRNA对急、慢性白血病耐药细胞耐药逆转作用

a：HL-60/ADR和HL-60细胞，K562/ADR，K562单纯给予ADR或ALC1 siRNA联合ADR 对ALC1表达的影响；b：ALC1 siRNA对各细胞耐药性的逆转效果。

图4.ALC1试剂盒对临床外周血样本的检测

a：外周血样本ALC1检测。N为正常人血液(n＝10)；AML：急性髓性白血病(n＝8)；ALL： 急性淋巴细胞白血病(n＝6)；CML：慢性粒细胞白血病(n＝5)；CLL：慢性淋巴细胞白血 病(n＝5)；b：急、慢性白血病患者用药前后ALC1水平比较。

具体实施方式

实施例1外周血及骨髓样本中ALC1的检测

取正常人及各类急、慢性白血病患者外周血及骨髓(正常人骨髓取自骨髓捐赠配型者)， 为比较白细胞正常增殖与异常增殖情况下的ALC1表达，实验另选用普通外科术后感染患 者外周血(白血球总数＞10×109/L)作对照，提取总RNA，总RNA定量、逆转录合成cDNA 等均按试剂盒说明书进行，cDNA产物-20℃保存或即用。PCR引物由上海生工公司合成： ALC1(800bp)Sence：5′-CCTCCTTCTATGATCATGTTG-3′，Antisence：5′-TGTTCTCATC CCAGGCCTTG-3′；GAPDH(310bp)Sence：5′-GCCTCAAGATCAGCAAT-3′，Antisence： 5′-AGGTCCACCACTG ACACGTT-3′。PCR反应采用50μl反应体系，95℃变性5分 钟，94℃变性30秒，60℃退火60秒，72℃延伸60秒，28个循环，72℃10分钟。1％琼脂 糖凝胶电泳，用软件Genesnap拍摄凝胶电泳条带图像，软件Genetools进行灰度值分析， 以目的条带与内参照条带的比值(ALC1/GAPDH)代表目的基因ALC1 mRNA相对水平(图 1)。

结论：如图1所示，各类人群外周血均有ALC1表达，但白血病患者外周血ALC1表 达水平显著高于感染性白血球升高患者及正常人(P＜0.01)，后两种人群外周血ALC1均呈 微弱表达，其表达强度差异无显著性意义(P＞0.05)(图1a，1b)。各类急、慢性白血病患者骨髓 内ALC1表达明显高于正常人骨髓(P＜0.01)(图1c，1d)。说明ALC1异常表达是各类急、 慢性白血病的一种表征，代表骨髓细胞的异常增殖。

实施例2急慢性白血病耐药细胞及非耐药亲本细胞ALC1表达的半定量分析

人慢性粒细胞白血病急性红白血变细胞株K562与其耐药细胞株K562/ADR(阿霉素耐 药细胞株，1.0μg/ml阿霉素培养体系维持耐药性)、人急性髓细胞白血病细胞株HL-60及多 药耐药细胞株HL-60/ADR(阿霉素耐药细胞株，0.5μg/ml阿霉素培养体系维持耐药性)在 含15％胎牛血清的RPMI1640培养液中，于37℃、含5％CO₂及饱和湿度的孵箱内培养，2-3 天传代1次，于实验前脱药培养4代，所有实验均取指数生长期细胞进行。用RNA提取试 剂盒(Qigen公司RNeasy mini columns)提取对数生长期细胞(K562及K562/ADR细胞、 HL-60及HL-60/ADR细胞}总RNA，总RNA定量、逆转录合成cDNA及PCR等方法与实 施例1相同，比较两对细胞ALC1的表达水平。

结论：ALC1基因在耐药细胞株中表达明显高于非耐药亲本细胞株，灰度扫描分析表明 K562/ADR细胞与K562细胞相比，ALC1 mRNA相对值分别为2.18±0.24及0.76±0.15 (P＜0.01)，耐药细胞株细胞比亲本细胞株ALC1 mRNA相对值高3.76倍(图2a，2b)， HL-60/ADR细胞与HL-60细胞相比，ALC1 mRNA相对值分别为1.24±0.13及0.66±0.1 (P＜0.01)，耐药细胞株细胞比亲本细胞株ALC1 mRNA相对值增加1.87倍(图2a，2b)， 提示ALC1表达增强可做为产生耐药性的标志，，据此特性，对ALC1进行定性、定量测定 可以对各类急、慢性白血病的疗效、耐药特性等特征做出判断。

实施例3  ALC1 siRNA干扰对白血病细胞药物耐受性的逆转作用

选用K562细胞及K562/ADR细胞、HL-60细胞及HL-60/ADR细胞进行配对验证。

(1)MTT检测法检测阿霉素(ADR)的半数抑制浓度(IC₅₀)：取对数生长期的K562细 胞及K562/ADR细胞(1×10⁵/ml)、HL-60细胞及HL-60/ADR细胞(2×10⁵/ml)接种于96 孔培养板，每株细胞均设4组：对照组(未加药的空白组)、药物组、ALC1 siRNA干扰组、 (siRNA+药物)组。siRNA干扰优选已成功构建的携带ALC1 siRNA片段的腺病毒载体 (ad-ALC1 siRNA)，各组细胞分别加入用无血清RPMI-1640稀释的Ad-mock(MOI 100， 空白组、ADR组)及ad-ALC1 siRNA(MOI 100，siRNA干扰组、siRNA+药物组)，每孔 加入的液体总量为0.1ml。轻轻晃动培养板，使液体均匀覆盖细胞，2h后吸出培养液，加入 0.2ml RPMI-1640+10％FBS的正常培养液，药物组及siRNA+药物组分别加入相应浓度的 药物(半数抑制浓度)，于37℃、5％CO₂培养箱中培养72h后每孔加入MTT溶液(5mg/ml) 20μl继续培养4h，弃上清，加入150μl二甲基亚砜，混匀后于酶标仪测定570nm波长的吸光度 值(A570)，计算细胞生长抑制率，抑制率＝[1-(给药组A570-空白对照A570/对照组A570- 空白对照A570)]100％。IC₅₀为抑制细胞生长达50％时的药物浓度，采用直线回归法。计 算阿霉素对K562/ADR细胞转染前后的半数抑制浓度(IC₅₀)，并计算耐药倍数和耐药逆 转倍数：耐药倍数＝耐药细胞IC₅₀/亲本细胞IC₅₀，逆转倍数＝耐药株IC₅₀/耐药株加逆 转剂IC₅₀。重复实验3次，数据采用配对t检验及方差分析。

结论：由HL-60/ADR和HL-60细胞的IC₅₀值得出HL-60/ADR对ADR的耐药倍数为 20.4倍，经ALC1 siRNA孵育后再加入ADR时，HL-60/ADR对ADR的敏感性显著提高，其耐 药性逆转倍数为2.55倍；由K562/ADR和K562细胞的IC₅₀值得出K562/ADR对ADR的 耐药倍数为42倍，经ALC1 siRNA孵育后再加入化疗药物时，K562/ADR对化疗药物的敏 感性显著提高，耐药性逆转倍数为3.25倍(表1，图3)。相同的实验方法检测结果显示ALC1  siRNA对其它多种化疗药(长春新碱、长春花碱、高三尖杉酯碱、柔红霉素)同样具有耐 药逆转作用(IC₅₀值、耐药倍数及逆转倍数见表2、表3)，故ALC1可用于耐药性白血病治 疗，其抑制剂可用于耐药性白血病逆转剂的制备。

表1 ADR及ALC1 siRNA作用下耐药及非耐药亲本细胞IC₅₀值(μmol/L)

表2 HL-60/ADR对不同药物的耐药倍数及siRNA作用下的逆转倍数(mean±s)

注：VCR：长春新碱；VBL：长春花碱；HHT：高三尖杉酯碱；DNR：柔红霉素。 各药物所用剂量均系通过MTT法计算IC₅₀所得浓度。

表3 K562/ADR细胞对不同药物的耐药倍数及siRNA作用下的逆转倍数(mean±s)

注：VCR：长春新碱；VBL：长春花碱；HHT：高三尖杉酯碱；DNR：柔红霉素。

各药物所用剂量均系通过MTT法计算IC₅₀所得浓度。

实施例4  ALC1试剂盒在临床检测中的应用：

(1)外周血或骨髓RNA的抽提：采用BD公司2.5ml采血管(含RNA酶抑制剂及红细胞裂 解成份)，采集待测个体外周血或骨髓2.5ml，来回轻晃采血管，使血液或骨髓与管内液体 充分混匀。采用Qiagen公司血液RNA抽提试剂盒(PAXgene Blood RNA Kit)快速提取总 RNA，取99ul的DEPC水加1ul的RNA，分光光度计计测RNA浓度及质量，OD260/OD280比 值在1.6-1.8之间，EB胶电泳检测RNA质量，-70℃保存。

(2)ALC1特异性逆转录：逆转录20μl反应体系为

逆转录反应程序：42℃50分钟，70℃15分钟。

(3)ALC1特异性PCR：

执行PCR程序：94℃，5min；94℃变性30秒，60℃退火60秒，72℃延伸60秒，25-30 循环；72℃，10分钟，4℃，持续。

ALC1特异性引物为：

Sence：5′-CCTCCTTCTATGATCATGTT G-3’

Antisence：5′-TGTTCTCATCCCAGGCCTTG-3′；

以GAPDH做为内参基因，其序列为：

Sence：5′-GCCTCAAGATCAGCAAT-3′，

Antisence：5′-AGGTCCACCACTGACACGTT-3′

(4)表达水平分析测定；行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果，采用凝胶图像处理软件测 量灰度值，计算mRNA表达的相对值。计算方法：ALC1 mRNA表达相对值＝ALC1灰度值/GAPDH 灰度值。

结论：本发明中正常人外周血ALC1/GAPDH平均值为0.2097，而各类白血病患者外周血 ALC1/GAPDH值均明显超过正常人ALC1/GAPDH平均值，故超高水平的ALC1/GAPDH值预示有 血液肿瘤的发生(图4a)，对同一病人用化疗药前后血液样本进行比较，结果显示临床症状 缓解患者ALC1/GAPDH值下降，而临床症状未缓解患者其ALC1/GAPDH值保持在用药前水平， 故根据用药前后外周血或骨髓ALC1/GAPDH值可判断是否产生耐药(图4b)。

                         SEQUENCE LISTING

<110>  广州医学院

<120>  ALC1在制备白血病耐药逆转剂及作为耐药性白血病诊断试剂方面的应用

<130> 

<160>  6    

<170>  PatentIn version 3.2

<210>  1

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  1

ggauucaccu acgcucuuat t                                               21

<210>  2

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  2

uaagagcgua ggugaauccc t                                               21

<210>  3

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  3

gcaucgugau cguuccaaut t                                               21

<210>  4

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  4

auuggaacga ucacgaugct g                                               21

<210>  5

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  5

cctccttcta tgatcatgtt g                                               21

<210>  6

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  6

tgttctcatc ccaggccttg                                                 20