用于检测新德里金属β内酰胺酶-1基因的靶序列与试剂盒

技术领域

本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一种应用荧光PCR技术检测新德 里金属β内酰胺酶-1(NDM-1)基因的靶序列与试剂盒。

背景技术

2010年，在印度、巴基斯坦等南亚国家出现的一种新型细菌变种基因有可 能在全球蔓延，拥有这种基因的细菌对包括头孢类、碳青霉烯类、氨基糖苷类 等绝大部分抗生素都有耐药性(目前仅对替家环素和多粘菌素两种抗生素敏 感)，因此医学专家将这种基因命名为新德里金属β内酰胺酶-1(New Delhi metallo-β-lactamase 1，简称NDM-1)基因，它起初存在于大肠杆菌等细菌的质 粒上，表达产生的酶能分解上述抗生素，NDM-1基因能随着质粒在细菌间的转 移而传播，造成获得该基因的细菌对大部分抗生素的耐药性(Yong D，et al. Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2009，53(12)：5046-5054.Rolain JM，et al， Clinical Microbiology and Infection，2010，16(12)：1699-1701.)。迄今，含有NDM-1 这一超级耐药基因的抗生素多重耐药菌已经从南亚地区蔓延向全球传播，先后 在英国、美国、加拿大、澳大利亚、荷兰等国家以及国内发现，对人类的健康 形成了新的威胁(www.theLancet.com/Infection，published online August 11，2010 DOI：10.1016/S1473-3099(10)70143-2)。

临床上对这种抗生素多重耐药菌的传统检测是分离培养结合药敏鉴定方 法，最快需一个多星期出检测结果，远不能满足临床上对病原微生物鉴定和用 药指导的需要。因此采用分子生物学方法鉴定含有NDM-1基因的多重耐药菌是 临床上的必然选择，其中荧光PCR方法更是由于灵敏、快速的特点而具有优势。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用荧光PCR技术检测新德里金属β内酰胺酶 -1(NDM-1)基因的靶序列与试剂盒，试剂盒含有根据靶序列SEQ ID NO：1设计 的引物和探针，从而可以提高实时荧光PCR检测NDM-1基因的准确性，适合 用于临床快速鉴定含NDM-1基因的抗生素多重耐药病原细菌。

1.实时荧光PCR引物探针的设计与合成

通过对GenBank中对新德里金属β内酰胺酶-1基因序列查询，用分子生物 学专业软件对各种来源的基因序列进行比对，选择高度保守并具有很好的同源 性的序列SEQ ID No：1作为检测靶序列，按照TaqMan荧光PCR设计的原则， 根据该靶序列设计了一对NDM-1基因特异性引物扩增该基因上的保守区域，并 用5’端FAM标记的特异性TaqMan探针实时检测。引物和探针碱基序列如下：

上游引物为5’-ggCggggATT gCgACTTATg-3’，如SEQ ID NO：2所示；

下游引物为5’-AATACCTTgA gCgggCCAAA g-3’，如SEQ ID NO：3所示；

荧光探针为5’-AATgCgTTgT CgAACCAgCT TgCC-3’(5’标记FAM，3’标 记TAMRA或BHQ-1)，如SEQ ID NO：4所示。

通过上述设计，获得的一对引物和探针序列为NDM-1基因所特异，上述引 物探针由商业序列合成公司(上海生工生物工程技术服务有限公司等)合成后 用无菌双蒸水溶解至浓度为25μM，-20℃保存。

2.试剂盒的制备

针对靶序列SEQ ID NO：1设计的NDM-1基因荧光PCR检测试剂盒(32人 份)主要组分如下：

(1)PCR缓冲液672μl，主要成分有Tris-HCl(pH8.3)、KCl、明胶、dATP、 dGTP、dCTP、dUTP、MgCl₂、上下游引物(SEQ ID No：2和3)。

(2)荧光探针96μl，含荧光探针(SEQ ID No：4)。

(3)Taq酶64μl，含Taq DNA聚合酶40U和尿嘧啶-DNA糖基化酶(UNG酶) 16U。

(4)阴性对照200μl，为大肠杆菌培养物，10⁴个菌/ml。

(5)阳性对照200μl，为人工构建含有SEQ ID No：1序列质粒的大肠杆菌培 养物，10³个菌/ml。

(6)DNA提取液1.5ml，主要成分为50mmol/LNaOH、5mM EDTA、1％Triton X-100、1％NP-40。

由上述试剂盒组分PCR缓冲液21μl、荧光探针3μl、Taq酶2μl混合后加 入模板4μl后组成的30μl反应体系，含有Tris-HCl(pH8.3)10mM、KCl 50mM、 明胶0.1mg/ml、dATP、dGTP、dCTP、dUTP各0.2-0.4mM、MgCl₂ 1.5-5mM、 引物各0.2-0.5μM、荧光探针0.1-0.5μM、Taq DNA聚合酶1-5U、UNG酶0.1-1 U，在荧光PCR仪器上进行扩增反应。

更具体地，上述组分配制成的反应体系中含有Tris-HCl(pH8.3)10mM、 KCl 50mM、明胶0.1mg/ml、dATP、dGTP、dCTP、dUTP各0.2mM、MgCl₂ 3.5 mM、引物各0.35μM、荧光探针0.2μM、Taq DNA聚合酶1.25U、UNG酶0.5 U，在荧光PCR仪器上进行扩增反应。

上述组分组装成的试剂盒在-20℃保存和运输。

3.试剂盒使用方法

本发明试剂盒在含NDM-1基因抗生素多重耐药病原细菌检测过程中的使用 步骤之一为：

(1)样品处理

取采集的临床样本或增菌液，置于离心管13,000rpm离心6分钟，用移液 器小心吸弃上清(为防止吸走沉淀，可保留5μl残液)，在沉淀中加入1ml生理 盐水，漩涡振荡混匀后重复离心吸弃上清。在沉淀中加入50μl DNA提取液， 旋涡振荡混匀后100℃保持10分钟，13,000rpm离心2分钟取上清进行荧光PCR 扩增检测。试剂盒阴性和阳性对照处理方法和样品液相同。

(2)扩增检测

按照待检测样品数n+2，取试剂盒PCR缓冲液21μl×(n+2)、荧光探针3 μl×(n+2)、Taq酶2μl×(n+2)组分，混匀后每个扩增管分装26μl，分别加 入处理好的试剂盒阴性对照、阳性对照以及上述处理好的n个样本模板各4μl。 每个反应管体积为30μl，将上述扩增管放到双通道实时荧光PCR仪器上按照 50℃2min、94℃2min后94℃10sec、60℃45sec循环40次的程序运行。

(3)结果判断

荧光PCR仪运行结束后使用自带软件分析结果，试剂盒阴性对照应无Ct 值为阴性、阳性对照Ct值＜30为阳性。样品扩增Ct值＜38者为含有NDM-1基 因阳性，样品感染有NDM-1基因耐药病原菌；检测结果无Ct值者为NDM-1基 因阴性；若38＜Ct值＜40者为检测灰区，需重复检测2次，如检测结果至少1 次Ct值＜40判断该管为NDM-1基因阳性，否则，判断该管为阴性。

4.有益效果

本发明根据上述设计的引物探针和技术方案，通过优化反应体系和扩增条 件研制成NDM-1基因荧光PCR检测试剂盒，其主要特点如下：

(1)试剂盒采用特异性引物探针检测高度保守的NDM-1基因靶序列，保证了 检测特异性和灵敏度；

(2)试剂盒闭管检测，操作简便快速，可在2小时内报告检测结果；

(3)扩增体系中的dUTP-UNG酶系统更进一步避免了因扩增产物污染导致 的结果假阳性。

试剂盒的上述特点，均为采用根据优选的靶序列设计的引物探针并结合荧 光PCR技术组合应用而直接引起。从原理上说，本发明试剂盒在NDM-1基因 病原体临床样本检测中通过对实时荧光PCR扩增信号的分析，判断NDM-1基 因核酸特异性片段的存在，作为一种NDM-1基因核酸快速检测的手段，本发明 的技术方案设计合理，可以广泛应用于临床中含有NDM-1超级耐药基因病原细 菌的快速鉴定。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内 容之后，本领域技术人员可以通过技术常识对本发明作各种技术性改动或修改， 这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

本发明中所涉及的主要试剂说明：

Taq DNA聚合酶、尿嘧啶-DNA糖基化酶(UNG酶)、dNTPs(dATP、dUTP、 dCTP、dGTP)均为上海宏谊公司生产，引物探针以及其它化学试剂购自上海 生工生物工程技术服务有限公司。

实施例1：NDM-1基因荧光PCR检测试剂盒的制备

(1)引物探针合成

委托商业序列合成公司(上海生工生物工程技术服务有限公司)合成以下 序列：

上游引物为5’-ggCggggATT gCgACTTATg-3’，如SEQ ID No：2所示；

下游引物为5’-AATACCTTgA gCgggCCAAA g-3’，如SEQ ID NO：3所示；

荧光探针为5’-AATgCgTTgT CgAACCAgCT TgCC-3’(5’标记FAM，3’标 记TAMRA或BHQ-1)，如SEQ ID No：4所示。

分别用无菌双蒸水溶解至浓度为25μM，-20℃保存。

(2)配制NDM-1基因PCR缓冲液

含有Tris-HCl(pH8.3)14.2mM、KCl 71.4mM、明胶0.14mg/ml、dATP、 dGTP、dCTP、dUTP各0.29mM、MgCl₂5mM、上下游引物(SEQ ID No：2 和3)各5μM，按照672μl/管分装。

(3)配制荧光探针

含NDM-1基因荧光探针(SEQ ID No：4)2μM，按照96μl/管分装。

(4)配制Taq酶

含Taq DNA聚合酶40U和尿嘧啶-DNA糖基化酶(UNG酶)16U，按照 64μl/管分装。

(5)配制DNA提取液

含有50mmol/L NaOH、5mM EDTA、1％Triton X-100、1％NP-40。按照 1.5ml/管分装。

(6)制备试剂盒阴性、阳性对照品

分别培养大肠杆菌、含有SEQ ID NO：1人工序列质粒的大肠杆菌，并用平 板活菌计数法测定培养液浓度，稀释至1×10⁴个菌/ml与1×10³个菌/ml，分 别作为试剂盒阴性对照和阳性对照。按照200μl/管分装。

(7)将上述分装后的5种组分置于同一容器中，组装成试剂盒，封装。

制备工艺简述如下：

(1)合成的引物探针定量配制、浓度检测、抽样质检。

(2)将PCR缓冲液、荧光探针、Taq酶、DNA提取液无菌分装，抽样质检。

(3)将阴性、阳性对照品进行浓度测定、分装，抽样质检。

(4)组装成品试剂盒，保存于-20℃。

实施例2：NDM-1基因荧光PCR检测试剂盒的应用

(1)样品处理

取采集的临床样本或增菌液20例，置于离心管13,000rpm离心6分钟，用 移液器小心吸弃上清(为防止吸走沉淀，可保留5μl残液)，在沉淀中加入1ml 生理盐水，漩涡振荡混匀后重复离心吸弃上清。在沉淀中加入50μl DNA提取 液，旋涡振荡混匀后100℃保持10分钟，13,000rpm离心2分钟取上清进行荧 光PCR扩增检测。试剂盒阴性和阳性对照处理方法和样品液相同。

(2)扩增检测

按照待检测样品数n+2(n＝20)，取试剂盒PCR缓冲液21μl×(n+2)、荧 光探针3μl×(n+2)、Taq酶2μl×(n+2)组分，混匀后每个扩增管分装26μl， 分别加入按照样本处理方法处理的试剂盒阴性对照、阳性对照以及上述处理好 的n个样本模板各4μl。每个反应管体积为30μl，将上述扩增管放到ABI7500 荧光PCR仪器上按照50℃2min、94℃2min后94℃10sec、60℃45sec循环 40次的程序运行。

(3)结果判断

荧光PCR仪运行结束后使用自带软件分析结果，试剂盒阴性对照应无Ct 值判断为阴性、阳性对照Ct值＜30判断为阳性。样品扩增Ct值＜38者为NDM-1 基因阳性，样本中含有NDM-1基因耐药病原菌；样品扩增无Ct值者为NDM-1 基因耐药菌阴性；若38＜Ct值＜40则判断为检测灰区，需重复检测2次，如检测 结果至少1次Ct值＜40判断该管为NDM-1基因阳性，否则，判断该管为阴性。

按照上述结果判断方法，实验检测的20例样本中有1例检测Ct值＜38，判 断为NDM-1基因耐药病原菌阳性，其余19例为NDM-1基因耐药病原菌阴性。