一株具有治疗腹泻作用的丁酸梭菌及其作为丁酸钠替代品的应用

技术领域

本发明涉及一株具有治疗腹泻作用的丁酸梭菌及其作为丁酸钠替代品的应用。 

背景技术

目前，随着经济的不断发展和生活水平的不断提高，人们已经越来越认识到“绿色”的基本含义。但是由于经济利益的驱动，抗主素的使用已经开始泛滥，特别是在饲料中大量使用，致使动物体内正常菌群失调以及抑制机体免疫反应的形成，严重的导致二重感染，甚至可引起死亡；其次，抗主素在畜禽体内及其肉、蛋、奶等食品中的残留，经加热处理并不能完全使其灭活，人长期食用这类食品，可能导致慢性中毒等。另外，现代医疗技术、农药、化肥、激素、同位素和其它化工制品，以及物理因素常会直接或间接对体内的微生态平衡产生不利影响，引起多种疾病。如果在饲料中使用微生态制剂，将大大降低抗生素的用量，解决抗生素解决不了的问题，提高生产效率，向绿色农业的方向前进。 

微生态学是近年来发展很快的一门生命科学，也是理论与实践结合得相当紧密的一门科学。随着微生态理论的进展，它的实践产物一一微生态制剂不断涌现，并引起临床医学工作者的高度重视。丁酸梭菌(Clostridium butyricum)又名酪酸菌，它是梭状芽孢菌属中的一个种，是1933年由日本千叶医科大学宫入近治博士首先发现并报告的，因此又叫宫入菌。1935年，Kingimiyairi博士从人的粪便和土壤中分离出丁酸梭菌，随后发现其厌氧培养的过滤物中含有较少的脂肪酸，具有极强的整肠作用，它可抑制肠道中的致病菌，促进肠道中有益菌如双歧杆菌和乳杆菌的生长。 

丁酸梭菌作为微生态制剂主要的特点是：(1)促进肠道内有益菌群(双歧杆菌、乳酸菌、粪杆菌等)的增殖和发育，抑制肠道内葡萄球菌、念珠菌、克雷伯氏菌、变形杆菌、弯曲杆菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、痢疾杆菌、伤寒沙门氏菌等有害菌和腐败菌的生长繁殖，减少胺类、吲哚类物质的产生，而丁酸梭菌本身由于不能分解蛋白质，会减少氨、吲哚、硫化氢等有害物质的产生；(2)在肠道内产生维生素B族、维生素K、淀粉酶，有良好的保健作用；(3)丁酸梭菌的代谢物——丁酸是肠上皮组织细胞再生和修复的主要营养物质；(4)对多种抗生素有较强的耐受性，与抗生素并用时不会影响其生物作用，并能大幅度降低伪膜性肠炎的发病率；(5)丁酸梭菌是厌氧梭状芽孢杆菌，在体内不受胃酸、消化酶、胆汁酸等影响其生物作用，在体外室温下能长期保存；(6)丁酸梭菌是人体肠道内正常菌群之一，在肠道内阻止有害菌的定植和入侵、纠正肠道内菌群紊乱。 

目前，国内对于丁酸菌的研究近两年才开始，至今还没有生产厂家。目前市场上的丁酸梭状芽孢杆菌活菌制剂全部从日本进口，价格较高。 

丁酸钠，又名正丁酸钠盐，产品呈白色至类白色，似绒毛状，可吸湿性粉末，具有特殊的奶酪酸败样气味，易溶于水，水溶液pH呈碱性。因丁酸具有游离性和挥发性的特点，饲料生产中将其制成相对稳定的钠盐——丁酸钠。丁酸钠在我国是允许使用的饲料添加剂品种之一，于2006年被农业部列入《饲料添加剂品种目录》。在动物生产上的应用方式主要是在动物饲料中添加丁酸钠产品(丁壮素、佳宝育、肠益健)，起到肠黏膜营养剂、电解质平衡调节剂、胃肠道微生态调节剂、复合酸化剂、香味剂、诱食剂等作用。目前，国内对丁酸钠在畜牧生产中的应用研究大部分针对幼龄动物。但实际应用发现，丁酸钠产品效果并不稳定，分析其原因有以下几点： 

(1)饲料原料对丁酸钠有一定的缓冲能力：饲料原料的缓冲能力，是影响胃内游离酸量的主要因素。缓冲能力越大，能吸附胃内的游离酸就越多，这使得采食后胃内的游离酸减少，胃内pH值升高，进而影响胃蛋白酶的活性和蛋白质的消化分解。一般来说，蛋白质、钙、磷和矿物质的含量越高，饲料的缓冲能力越高。 

(2)丁酸钠用量不好掌握：丁酸钠作为有机酸，一方面它的解离度小，酸性较弱，达到同样的酸化能力添加量比无机酸要大得多，添加成本高。另一方面丁酸钠作为酸化剂，在饲料日料中的添加是直接性的，添加的酸容易被碱中和，失去酸化作用；或者在胃中吸收过快，又会反射性抑制胃酸分泌，影响胃功能的正常发育；如果无法到达小肠，则不能有效降低小肠中的pH值，无法达到抑制有害微生物生长、促进有益菌生长的目的。此外，饲料日粮的种类、动物的年龄、体重以及饲养环境都会影响丁酸钠的使用量。 

(3)贮存运输条件受限：丁酸钠产品在常规贮存和搬运条件下，处于低温和密封状态下稳定，但不能与性质相反的物质、粉尘、过热物品、强氧化剂混合保存，贮存过程中容易发生稀释结块或造成饲料受潮。 

(4)技术成本高：核素示踪法研究SCFA(短链脂肪酸)吸收的结果表明，机体结肠中SCFA的吸收和代谢能力很强，其中又以丁酸为最快。由于丁酸代谢速度很快，使得机体内丁酸的血清半衰期仅仅只有6分钟。 

(5)存在不良应激：动物口腔黏膜细柔，感受能力强，若用低价、低质的化工级丁酸钠作为诱食剂时，本想起到诱食和保持动物机体健康的作用，但是往往能引起动物黏膜灼伤，导致采食量下降，甚至拒食。此外，丁酸钠可能产生的有害分解产物有一氧化碳、二氧化碳、氧化钠、过敏性和有毒的烟尘与气体，也有可能导致中枢神经系统抑制、眼和皮肤过敏、消 化道和呼吸道应激。 

综上所述，寻求一种有效的丁酸钠的替代品，是畜牧业和饲料业领域急需解决的一大难题。 

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一株具有治疗腹泻作用的丁酸梭菌，并提供了其作为丁酸钠替代品的应用。 

本发明是通过以下技术方案实现的： 

一株具有治疗腹泻作用的丁酸梭菌，该菌株命名为丁酸梭菌(Clostridium butyricum)Cb-2，已于2011年11月09日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC M2011384。 

所述菌株的特征为：为专性厌氧的革兰氏阳性芽孢杆菌，其直径为0.6μm～1.2μm×3.0μm～7.0μm，两端钝圆，中间部分轻度膨胀，细菌呈直杆状或稍有弯曲，单个或成对，短链，偶见有丝状菌体，周身鞭毛，能运动。该菌株能产酸产气，能分解蔗糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖、蜜二糖、淀粉，不能分解松三糖、木糖，不能使明胶液化，还原石蕊，凝固牛乳，凝块碎裂不消化，最佳生长温度为37℃，最佳生长pH值为7.0。该菌株具有耐酸、耐胆汁、耐高温的性能；同时具有一定的抑菌能力。 

经试验证明，本发明的丁酸梭菌产酸能力强，尤其是产丁酸能力。经试验证明，本发明的丁酸梭菌对各种原因所致的肠道菌群紊乱、急慢性腹泻、肠易激综合症、非溃疡性消化不良等疾病有显著的效果，且无毒无害。因此，可以以本发明的丁酸梭菌或丁酸梭菌粉剂为原料，用于制备微生态制剂，用于替代丁酸钠进行应用。 

所述丁酸梭菌粉剂是通过培养上述丁酸梭菌得到的，其培养方式可以为常规培养方式。其最佳的培养生产工艺流程如下： 

(i)菌种：选用丁酸梭菌Clostridium butyricum Cb-2，CCTCC M 2011384； 

(ii)实验室培养：将上述丁酸梭菌的冻干粉菌种一环接种于培养基上，无菌操作，封上石蜡凡士林(1∶1 v/v)，35～42℃下厌氧培养24～38h； 

(iii)制备液体种子：采用5000mL三角瓶，培养基装量1000mL/5000mL三角瓶，115℃灭菌20min，冷却后接种，接种量3％～8％(v/v)，在35～42℃条件下，厌氧培养14～38h，即为液体种子； 

(iv)种子罐发酵：采用50L种子罐，培养基装量为30L；实消温度115～121℃，时间15～30min；待培养基温度降为40℃时接种，接种量3％～8％(v/v)，罐压0.05MPa，在35～ 42℃条件下，厌氧培养12～38h，转入发酵罐培养； 

(v)发酵罐培养：采用0.5T发酵罐，培养基装量为350L；实消温度115～121℃，时间15～30min；待培养基温度降为40℃时接种，接种量3％～8％(v/v)，罐压0.05MPa，厌氧培养16～32h； 

(vi)发酵结束后，立即将发酵液离心并用清水清洗，如此反复2～3遍后冷冻干燥，粉碎，即为菌粉成品；或：发酵结束后，立即喷雾干燥，即得菌粉成品； 

上述步骤(ii)(iii)、(iv)中所述培养基配方为：葡萄糖10g/L、胰蛋白胨5g/L、酵母膏3g/L、牛肉浸膏5g/L、碳酸钙10g/L，使用时，调节pH至6.5～7.5，115℃条件下灭菌20min；步骤(v)中所述培养基配方为：葡萄糖10g/L、蛋白胨20g/L、酵母膏15g/L、碳酸钙10g/L、硫酸镁0.2g/L、磷酸氢二钾2g/L，硫酸锰0.2g/L，使用时，调节pH至6.5～7.5。 

所述具有治疗腹泻作用的丁酸梭菌制剂，可以用于制备微生态制剂，具体应用时，丁酸梭菌制剂可以单独作为有效成分(如饲料添加剂)与玉米淀粉制成微生态制剂，或者：丁酸梭菌制剂与其它至少一种菌制剂以及玉米淀粉混合制成复合微生态制剂。 

所述其它菌制剂为乳酸菌、芽孢菌或/和双歧杆菌等益生菌的常规菌制剂；复配后，各菌制剂之间据有协同作用，能增强产品的功效，促进肠道微生态平衡，提高畜禽免疫力和抗病力，促进其健康快速生长，提高饲料转化率，降低粪便臭味，解决抗生素残留超标等问题。 

本发明的丁酸梭菌作为新一代饲料添加剂，具有“酸化肠道、修复黏膜、对抗耐药菌、优于丁酸钠”的显著特点，有着广阔的应用前景，必将对整个畜牧业和饲料业产生深远的意义。 

附图说明

本发明提供的菌株丁酸梭菌Cb-2 Clostridium butyricum Cb-2，已于2011年11月09日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC NO：M 2011384，保藏地址为：中国武汉武汉大学。 

图1为丁酸梭菌平板划线分离示意图。 

图2为丁酸梭菌革兰氏染色的显微照片(菌体中未染色的部分为芽孢)。 

图3为丁酸梭菌耐酸性试验结果示意图。 

图4为丁酸梭菌耐胆汁试验结果示意图。 

图5为丁酸梭菌Cb-2株pH变化曲线图。 

图6为健康小鼠与腹泻模型小鼠肠道菌群对比图。 

图7为治疗后第4天各组肠道内菌群对比图。 

图8为治疗后第6天各组肠道内菌群对比图。 

图9为治疗后第8天各组肠道内菌群对比图。 

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。 

实施例1  1菌种的分离鉴定及培养特性 

1材料与方法 

1.1样品采集山东省泰安市宁阳生态牧场健康母猪粪便。 

1.2培养基 

梭菌增殖培养基：胰蛋白胨5g/L，牛肉浸膏5g/L，酵母膏3g/L，葡萄糖10g/L，K₂HPO₄ 2g/L、MgSO₄ 0.2g/L、CaCO₃ 10g/L、MnSO₄ 0.2g/L；pH 7.0，121℃，15min杀菌。 

梭菌计数培养基：胰蛋白胨5g/L，牛肉浸膏5g/L，酵母膏3g/L，葡萄糖10g/L，K₂HPO₄ 2g/L、MgSO₄ 0.2g/L、CaCO₃ 10g/L、MnSO₄ 0.2g/L，琼脂15g/L；pH 7.0，121℃，15min杀菌。 

梭菌分离培养基：在增殖培养基中加入：牛胆酸盐5g/L，琼脂15g/L，调pH到7.0，15min杀菌。 

1.3分离方法 

1)取粪便样品10g加到90mL无菌水中，放入80℃水浴10min，杀死非芽孢菌，然后放入增殖培养基，于37℃培养36h。 

2)梯度稀释培养液，涂布于梭菌分离培养基，放入厌氧罐中，置换3次气体(体积分数分别为10％的H2、10％CO₂和80％N₂)，并用铂粒作为催化剂，在0.01MPa的气体压力下37℃厌氧培养36h。 

3)采用影印平板法分离菌种，分别进行好氧和厌氧培养，选取厌氧生长良好的菌株，镜检。 

4)选取培养特征、菌落形态和显微形态均符合丁酸梭菌培养特征的菌株进行生理生化鉴定。 

1.4属及群的初步鉴定 

按《伯杰氏细菌鉴定手册》和《细菌属的鉴定指导》对分离到的纯菌株进行属的相关试验，以及群、种的相关生理生化试验，分别包括：明胶液化试验，蜜二糖、松三糖、淀粉水解试验和石蕊牛乳试验。 

1.5产酸能力和抑菌能力测定 

对新分离的丁酸梭菌Cb-2与试验室保存的一株丁酸梭菌Cb-1分别做产酸能力和抑菌能力测定，步骤为：两株菌分别接种于梭菌增殖培养基，在盐水瓶中静置培养，在16h和26h 取样，4000rpm离心10min，上清液测定丁酸和乙酸含量；同时16h样品进行抑菌试验，管碟法比较两者抑菌能力。 

2结果与讨论 

2.1菌种的鉴定结果 

对15个样品处理培养后，以影印平板进行厌氧和好氧培养，得到严格厌氧菌株10株，选择性培养后镜检得到典型的梭状芽胞菌属菌株1株。对这菌株进一步纯化后得到菌体较大的杆状、次端生椭圆芽孢菌株，初步鉴定为丁酸梭菌，其直径为0.6μm～1.2μm×3.0μm～7.0μm，两端钝圆，中间部分轻度膨胀，细菌呈直杆状或稍有弯曲，单个或成对，短链，偶见有丝状菌体，周身鞭毛，能运动。随后进行生理生化试验，发现该菌株能产酸产气，能分解蔗糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖、淀粉、蜜二糖，不能分解松三糖、木糖，不能使明胶液化，还原石蕊，凝固牛乳，凝块碎裂不消化(见表1、图1和图2)，由此，判定分离菌株为丁酸梭菌，命名为丁酸梭菌Clostridium butyricum Cb-2，已于2011年11月09日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC M 2011384。 

表1  分离菌株的生理生化特征 

2.2耐酸性试验比较结果 

两株菌分别接种于梭菌增殖培养基，在盐水瓶中静置培养，在16h和26h取样离心，上清液测定丁酸和乙酸含量，结果见表2。 

表2  两株丁酸梭菌的产丁酸、乙酸能力比较 

试验结果表明，原菌株产乙酸能力稍强于新菌株，但产丁酸能力则以后者为优。 

2.3抑菌试验比较结果 

两株菌分别接种于梭菌增殖培养基，在盐水瓶中静置培养，16h样品进行抑菌试验，比较二者抑菌能力的不同，结果见表3。 

表3  两株丁酸梭菌的抑菌能力 

注：O1为鸡大肠杆菌；C249为猪大肠杆菌；k88为产毒素大肠杆菌；C79-20鸡伤寒沙门氏菌。 

抑菌试验结果表明，两株丁酸梭菌对大肠杆菌k88、金黄色葡萄球菌、藤黄八叠球菌的抑菌圈大小达到14mm，对C249、O1、C79-20抑菌圈的大小在12～14mm不等，两者抑菌能力没有显著差异，新分离菌株Cb-2的抑菌性能略高于原分离株Cb-1。 

2丁酸梭菌菌种特性 

作为饲用微生态制剂的选用菌株，必须具有一定的特性，如对酸性高胆汁环境的耐受性，对肠道有害菌的抑制作用等。发明人首先对这株丁酸梭菌的一些特性进行了研究。 

2.1耐酸性试验 

取株菌Cb-2的悬液0.1mL注射入含有2mL无菌磷酸盐缓冲液的pH分别为1.0、2.0、3.0、4.0(用盐酸调到最终pH)的厌氧试管中。将这些厌氧试管放入37℃生化培养箱中，并分别于0h、1h、2h、3h和4h进行活菌计数。每次计数均重复三次取平均值，结果见图3。 

耐酸性试验结果表明在四个pH下，经过4h的耐酸实验，活菌数变化差异不大，该结果进一步表明该菌株有较强的耐酸性，能顺利通过胃部，到达肠道部位发挥其作用。 

2.2耐胆汁试验 

取株菌Cb-2的悬液0.1mL注射入含有2mL相应液体培养基的含胆汁浓度分别为0％、0.3％、0.6％、1.0％的厌氧试管中。将这些厌氧试管放入37℃生化培养箱中，并分别于0h、1.5h、3h、4.5h和6h进行活菌计数。每次计数均重复三次取平均值，结果见图4。 

丁酸梭菌Cb-2对这四个胆汁浓度的耐受性都很好，经过6h的耐受实验，几乎保持了初始的活菌数。结果表明该菌株能耐受胃肠的胆汁而保持较高活性。 

2.3耐高温试验 

取丁酸梭菌Cb-2的24h培养液10mL于试管中，置于90℃水浴处理，分别于热处理之前、处理5min和10min时取样测定活菌数，计算存活率，结果见表4。 

表4  耐高温试验结果 

试验结果表明，丁酸梭菌Cb-2菌液在90℃水浴处理5min和10min后存活率分别在80％和70％以上，这一点对该菌作为饲料添加剂推广有特别重要的意义。 

2.4抑菌试验 

分析丁酸梭菌全菌液、菌体、代谢产物培养液对大肠杆菌K88、C249、Q1、C79-20、金黄色葡萄球菌、藤黄八又叠球菌等菌的抑制作用。采用牛津杯法进行抑菌试验，37℃培养8～10h，测量抑制菌圈直径。 

丁酸梭菌全菌液、菌体、代谢产物的制备：将丁酸梭菌培养液3000rpm离心30min，取沉淀，并用生理盐水清洗3次，将得到的菌体用生理盐水稀释到原体积，制成丁酸梭菌菌体；同时将第一次离心所得到的上清液用无菌过滤器过滤，得到丁酸梭菌的无菌代谢产物。 

表5  丁酸梭菌全菌液、菌体和代谢产物的抑菌能力比较 

注：O1为鸡大肠杆菌；C249为猪大肠杆菌；k88为产毒素大肠杆菌；C79-20鸡伤寒沙门氏菌；-表示未检出。 

试验结果(见表5)表明：丁酸菌菌全菌液、代谢产物对k88菌、金黄色葡萄球菌、藤黄八叠球菌的抑菌圈大小达到14mm，对C249、O1、C79-20抑菌圈的大小在12～14mm不等；而丁酸梭菌菌体对上述菌均无抑制作用。这一结果表明丁酸梭菌对肠道致病菌有很好的抑制作用，起抑制作用的是丁酸梭菌及其代谢产物。 

2.5产酸试验 

用100mL小盐水瓶进行丁酸梭菌的发酵，静置培养36h，不同时间取样测定菌液的pH值，结果见表6和图5。 

表6  不同时间阶段发酵液中pH值的变化 

试验结果表明，丁酸梭菌的主要代谢产物就是丁酸，菌体进入对数生长期时，丁酸即开始产生，同时产生的还有乙酸。丁酸、乙酸的产生，使发酵液的pH值迅速下降，发酵27h时，pH达到最低值，最低值为4.56。 

3种子培养基的优化 

根据已有研究，发明人确定培养丁酸梭菌的初始培养基为梭菌增殖培养基。采用液体深层静置培养的方法，菌数测定用血球计数法和焦性没柿子酸法相配合。为了提高酪酸菌菌体收得率，本研究以单位体积培养液中的活菌数作为指标对培养基组成和初始pH、培养温度等培养条件进行优化。 

3.1菌体的培养温度 

丁酸梭菌Cb-2在25℃、28℃、30℃、32℃、35℃、37℃、40℃不同温度发酵培养36h，残留菌体80℃水浴15min灭活处理后，平板培养计数，结果见表7。 

表7  温度对菌液浓度的影响 

试验结果表明，温度对丁酸梭菌Cb-2的生长有较大影响，通过试验确定Cb-2最佳生长温度为37℃。 

3.2菌体的培养pH值 

取发酵36 h的菌液10mL，3000rpm离心15min，弃上清，将菌体用生理盐水洗涤3次，先加入生理盐水5mL，调节丁酸梭菌Cb-2的菌悬液的pH值分别为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，然后用生理盐水定容至10mL，于37℃处理2h。取菌悬液，在平皿上作菌落计数，结果见表8。 

表8  不同初始pH值对菌液浓度的影响 

不同初始pH值，丁酸梭菌Cb-2培养后，菌液浓度变化差异很显著，试验结果表明，在初始pH值为7～8时，菌液浓度变化不大，pH值低于7则有较大的降低，pH值过高也不利于 其生长，因此确定丁酸梭菌Cb-2培养最适pH为7.0。 

3.3碳、氮源配比试验 

调节碳、氮源种类和添加量，为菌体生长提供足够的营养，从而使菌体浓度达到最大。 

3.3.1不同碳源对菌体浓度的影响 

分别以1.0％甘油、1.0％葡萄糖、1.0％麦芽糖、1.0％淀粉、1.0％D-果糖、1.0％乳糖、1.0％蔗糖为碳源，代替基础培养基中0.5％的葡萄糖，基础培养基中其它成分不变，对丁酸梭菌进行液体深层静置培养，培养24h，结果见表9。 

表9  不同碳源对菌体浓度的影响 

试验结果表明，以1.0％葡萄糖碳源培养效果最好，其中淀粉与蔗糖作为碳源，镜检发现菌种生长期延迟。 

3.3.2葡萄糖添加量对菌体浓度的影响 

以葡萄糖为碳源，分别用0.3％、0.5％、1.0％、1.2％、1.5％5个用量水平进行培养，基础培养基中其它成分保持不变。培养24h，结果见表10。 

表10  葡萄糖添加量对菌体浓度的影响 

试验结果表明，葡萄糖添加量1.0％、1.2％、1.5％时菌体浓度最大，从节约成本角度考虑，葡萄糖添加量1.0％为最佳。 

3.3.3不同类型氮源对菌体浓度的影响 

由于丁酸梭菌的蛋白酶活性较弱，基本不能利用蛋白质，因此主要选择一些可溶性氮源进行比较，固定初始培养基中其它成分不变，改变氮源种类，分别以(NH₄)₂SO₄、NaNO₃、胰蛋白胨、酵母膏、胰蛋白胨+酵母膏+牛肉浸膏，代替基础培养基中1.0％的牛肉浸膏，其它成分不变，培养24h，结果见表11。 

表11  不同类型氮源对菌体浓度的影响 

试验结果表明，胰蛋白胨1.0％、酵母膏0.3％、牛肉浸膏0.5％时，菌体浓度最高，因此，确定氮源配比最佳为胰蛋白胨1.0％、酵母膏0.3％、牛肉浸膏0.5％。 

3.3.4培养基碳、氮源配比确定 

在上述碳源、氮源等单因素研究中，确定了碳源和氮源比较合适的浓度，但碳氮比对菌体的生长也有很大的影响。通过正交试验，按极差的大小决定因素的主次，采用L9(3⁴)进行正交试验(表头设计见表12)来确定合适的碳氮比例，试验结果见表13。 

表12  表头设计 

表13  正交试验设计结果 

由上述试验可确定种子基本培养基为：葡萄糖1.0％、酵母膏0.3％、牛肉浸膏0.5％、胰蛋白胨0.5％。 

3.3.5不同CaCO₃添加量对菌液浓度的影响 

调整合适的碳、氮源配比可以获得较高的菌体浓度，考虑到丁酸梭菌在发酵过程中大量产酸，使得pH值降辐很大，而pH只在一定时间保持在较适范围内，才能促进菌液浓度的增加，添加一定量的发酵调节剂CaCO₃可以中和掉部分的酸，结果见表14。 

表14  不同CaCO₃添加量对菌液浓度的影响 

试验结果表明，当CaCO₃的添加量为1.0％，可以获得最大的活菌总数，因此，CaCO₃浓度选取1.0％为最佳浓度。 

综上所述，种子培养基确定为：葡萄糖1.0％、酵母膏0.3％、牛肉浸膏0.5％、胰蛋白胨0.5％、CaCO₃ 1.0％。 

4丁酸梭菌发酵罐培养基及培养条件的优化 

摸索丁酸梭菌的发酵培养条件，选择最佳的培养基和培养方法，为研制和开发丁酸梭菌微生态制剂提供基础数据，并作一些初步的试验研究。 

4.1发酵培养基的确定 

如果采用种子培养基来大规模的生产丁酸梭菌，成本较高，大生产需要对适合于实际生产过程中的发酵培养基。发明人参照公司现有的培养基(葡萄糖2％、牛肉浸膏1.5％、蛋白胨1.5％、CaCO₃2％)为初始发酵培养基，利用7L小发酵罐，用经验法和统计法对发酵培养条件进行了优化，考虑到牛肉浸膏价格较高，发明人在试验中将牛肉膏替换为等量的酵母膏，进行了正交试验，结果见表15。 

表15  发酵培养基的正交试验 

按极差的大小决定因素的主次，A₁B₂C₃D₁为最佳组合，最终确定优化后葡萄糖1.0％、酵母膏1.5％、蛋白胨2.0％、CaCO₃ 1.0％。与优化前相比，葡萄糖和CaCO₃各降低了1个百分点，牛肉浸膏替换为价格较低廉的酵母膏，活菌数不但没有降低，而且节省了成本。 

4.2无机盐及微量元素配比试验 

合适的碳氮比可以提高丁酸梭菌的活菌数，在生产中如何提高菌体的芽孢率是最关键的。现调整培养基中无机盐及微量元素配比以提高芽孢转化率。钾离子、镁离子、锰离子可促进芽孢形成，故发明人添加不同浓度的K₂HPO₄、MgSO₄、MnSO₄并分别对培养液中的活菌数进行计数。 

4.2.1K₂HPO₄对菌体浓度的影响 

磷是核酸和蛋白质的必要组分，也是ATP的组分，对菌体的生长有重要影响。添加不同浓度的K₂HPO₄，并分别对培养液中的活菌数进行计数，结果见表16。 

表16  K₂HPO₄浓度对菌液浓度的影响 

试验结果表明，当钾离子的浓度为0.2％时，菌液活菌数为最大，因此，确定菌液中K₂HPO₄最适添加浓度为0.2％。 

4.2.2MgSO₄对菌体浓度的影响 

镁离子是微生物体内许多酶的辅助因子，对菌体的生长有重要影响。添加不同浓度的MgSO₄，并分别对培养液中的活菌数进行计数，结果见表17。 

表17  MgSO₄浓度对菌液浓度的影响 

试验结果表明，当镁离子的浓度为0.02％时，菌液活菌数为最大，因此，确定菌液中MgSO₄最适添加浓度为0.02％。 

4.2.3MnSO₄对芽菌体浓度的影响 

锰离子对丁酸梭菌菌体的生长以及芽孢的形成具有显著的促进作用，对菌体的生长有重要影响。添加不同浓度的MnSO₄，并分别对培养液中的活菌数进行计数，结果见表18。 

表18  MnSO4浓度对菌液浓度的影响 

试验结果表明，当锰离子的浓度为0.02％时，菌液活菌数为最大，因此，确定菌液中MnSO₄最适添加浓度为0.02％。 

4.2.4正交试验找出最佳配比 

在上述钾离子、镁离子和锰离子等单因素研究中，确定了K₂HPO₄、MgSO₄、MnSO₄和CaCO₃比较合适的浓度，通过正交试验，按极差的大小决定因素的主次，采用L9(3⁴)进行正交试验来确定合适的碳氮比例，试验结果见表19。 

表19  无机盐正交试验结果 

即无机盐配比为：MgSO₄ 0.02％、K₂HPO₄ 0.2％、MnSO₄ 0.02％、CaCO₃ 1.0％。通过以上试验，发明人确定了K₂HPO₄、MgSO₄、MnSO_4、CaCO₃浓度分别为0.2％、0.02％、0.02％、1.0％。 

4.3接种量的选择 

接种量大小对培养结果有一定影响，较大接种量可促使菌体在接种后较短时间内恢复增长，缩短菌体浓度达到高峰的时间，但接种量过大会带入较多的种子培养期的代谢产物，并使菌体前期生长过快，而使最终菌数下降。接种量过小则使菌体增殖缓慢，培养时间延长。试验分别采用了1％、2％、5％、8％、10％、12％6个接种量进行培养，培养24h，结果见表20。 

表20  丁酸梭菌接种量对菌体浓度的影响 

试验结果表明，在培养24h时镜检发现，10％接种量组已进入稳定期，但菌体浓度并不是 最高；1％、2％接种量组仍处于指数期，生长过慢，因此5％为最佳接种量。 

4.4丁酸梭菌生长和pH值变化曲线 

根据以上对丁酸梭菌培养基和培养条件的研究，确定丁酸酸菌优化后的培养基为葡萄糖1.0％、酵母膏1.5％、蛋白胨2.0％、CaCO₃ 1.0％，K₂HPO₄ 0.2％，MgSO₄ 0.02％，MnSO₄ 0.02％，pH7.0，培养温度为37℃，接种量为5％。根据以上培养条件，测量33h内pH值变化曲线和菌液浓度以及芽孢转化情况，结果见表21。 

表21  不同发酵阶段发酵液中丁酸梭菌生长与pH值变化 

试验结果表明，培养时间18h时，活菌数比较大，但芽孢转化率偏低。培养30h时，活菌数稍微下降，芽孢率达到90％，脱落率达到40～60％，为避免发酵时间过长出现芽孢二次生长，发明人将30h定为最佳培养时间。 

4.5、中试放大试验及菌粉制备 

中试放大选用70L发酵罐，发酵罐容积100L，装料系数0.6，接种量5％，发酵温度37℃，发酵培养基的初始pH控制在7.0。以优化好的培养基配方进行中试试验，并在不同发酵时间取样测定发酵液的丁酸梭菌Cb-2的生物量、pH值以及丁酸和乙酸含量，同时镜检观察丁酸梭菌的生长及芽孢形成情况，结果见表22、23、24。 

表22  不同发酵阶段菌液中丁酸梭菌的生物量 

表23  不同发酵阶段菌液中pH值的变化 

表24  不同发酵阶段菌液中丁酸、乙酸含量的测定 

发酵液在15h时，镜检发现，丁酸梭菌已进入对数生长末期，菌体大量增加；在18h时菌体部分形成芽孢；24h时菌体芽孢率达90％以上，成熟率达50％，发酵结束而停止发酵。发酵液中生物量在18h时达到最高(7.9mg/mL)，随着时间推移，生物量反而下降，可能与此时菌体形成芽孢后菌体的减少有关；pH值在15h达到最低值6.18，随时间延长而回升；丁酸和乙酸的含量在12～15h增加较快，这与此时菌体大量繁殖有关，而后后期21h时又升高，则可能与此时发酵液中CaCO₃的利用达到最大而无法继续与之中和有关。 

试验结果表明，70L扩大试验与7L罐的发酵过程结果较为相似，但也有不同：丁酸梭菌在70L的罐中18h即已形成芽孢，在24h时停止发酵，比7L小罐发酵时间缩短了8h；发酵液活菌数比较高，最高达1.8×10⁹cfu/mL，比7L罐提高了1.5倍。 

采用喷雾干燥法对发酵液进行干燥，干燥后菌粉计数，结果为3.34×10⁹cfu/g。菌粉活菌数不高，分析原因可能是丁酸梭菌菌体较大，在喷雾干燥过程中无法承受近12000rpm的离心力而死亡。发明人对发酵液尝试进行冷冻干燥(先以3000rpm离心后再喷雾干燥)，成活率只有40％左右，且成本太高。因此发酵液的后处理过程还需进一步探索。 

4.6制备丁酸梭菌菌粉 

所述制备丁酸梭菌菌粉的具体步骤如下 

(i)菌种：选用丁酸梭菌Clostridium butyricum Cb-2，CCTCC M 2011384； 

(ii)实验室培养：将上述丁酸梭菌的冻干粉菌种一环接种于培养基上，无菌操作，封上石蜡凡士林(1∶1 v/v)，37℃下厌氧培养36h； 

(iii)制备液体种子：采用5000mL三角瓶，培养基装量1000mL/5000mL三角瓶，115℃灭菌20min，冷却后接种，接种量5％(v/v)，在37℃条件下，厌氧培养24h，即为液体种子； 

(iv)种子罐发酵：采用50L种子罐，培养基装量为30L；实消温度121℃，时间30min；待培养基温度降为40℃时接种，接种量5％(v/v)，罐压0.05MPa，在37℃条件下，厌氧培养30h，转入发酵罐培养； 

(v)发酵罐培养：采用0.5T发酵罐，培养基装量为350L；实消温度121℃，时间30min；待培养基温度降为40℃时接种，接种量5％(v/v)，罐压0.05MPa，厌氧培养24h； 

(vi)发酵结束后，立即将发酵液离心并用清水清洗，如此反复3遍后冷冻干燥，粉碎，即为菌粉成品；或：发酵结束后，立即喷雾干燥，即得菌粉成品； 

上述步骤(ii)(iii)、(iv)中所述培养基配方为：葡萄糖10g/L、胰蛋白胨5g/L、酵母膏3g/L、牛肉浸膏5g/L、碳酸钙10g/L，使用时，调节pH至7.0，115℃条件下灭菌20min；步骤(v)中所述培养基配方为：葡萄糖10g/L、蛋白胨20g/L、酵母膏15g/L、碳酸钙10g/L、 硫酸镁0.2g/L、磷酸氢二钾2g/L，硫酸锰0.2g/L，使用时，调节pH至7.0。 

实施例2  丁酸梭菌Cb-2替代丁酸钠在仔猪生产上的应用 

目的意义 

仔猪断奶综合症一直是制约仔猪健康培育的重要问题，目前的常用手段是在断奶后日粮中添加有机酸。丁酸钠是丁酸相对稳定的钠盐，在治疗仔猪腹泻、改善胃肠道机能、提高动物生产性能方面发挥着重要作用。 

丁酸梭菌是动物肠道内的一种益生菌，其作为微生态饲料添加剂的研究已有报道，同时由于本菌能形成芽孢，对外界环境有很强的抵抗力，抗逆性强、耐高温高压及对多种抗生素有抗性，因此成为当今研究和应用的热点。 

研究丁酸钠和丁酸梭菌对断奶仔猪生产性能的影响，对丁酸梭菌替代丁酸钠在仔猪生产上应用的可行性进行验证。研究丁酸梭菌的不同添加水平对断奶仔猪采食量、平均日增重、饲料转化效率、腹泻率的影响，为其在实际生产中的应用提供理论依据和指导。 

1材料与方法 

1.1试验材料 

断奶三元仔猪16头，胎次和体重相近并且健康状况良好。按照实施例1中4.6的方法制备丁酸梭菌Cb-2粉剂，即丁酸梭菌Cb-2经发酵处理，得到发酵液，然后加入6％(重量百分数)玉米淀粉(商品名称：玉米淀粉；商品号：6920420601219；生产厂家：山东金城股份有限公司)通过喷雾干燥制成丁酸梭菌菌粉，活菌数为2.0×10⁸cfu/g，猪栏采用发酵床。基础口粮为本公司自己配制的仔猪发酵床全价料，配方如表25，单位：克。 

表25  常规饲料配方 

1.2试验时间、地点 

试验于2010年4月下旬至5月下旬，在宝来利来公司宁阳生态养猪厂，时间为35天。 

1.3试验仔猪的选择和分组 

考虑公司的实际情况，发明人从猪厂原有的仔猪中选用了健康状况良好的16头仔猪，根据体重相近，公、母各半原则随机分到4个处理组，每组4头，①组为丁酸钠对照组，饲喂基础日粮+0.15％的丁酸钠；试验组②、③、④为丁酸梭菌组，饲喂基础日粮+丁酸梭菌Cb-2，添加量分别为0.1％、0.5％、1.0％，活菌数分别为1.0×10⁵cfu/g、5.0×10⁵cfu/g、1.0×10⁶cfu/g。 

1.4饲养管理 

猪舍采用发酵床，环境卫生条件良好，自由采食，自由饮水。 

1.5测定指标 

测量数据包括初始重、末重、平均口增重、饲料消耗量、料肉比和腹泻率。试验开始时，每头仔猪早晨空腹称初始体重，试验结束次日早晨空腹称重，用以计算仔猪平均日增重(ADG)；分别记录每个处理组每次的投料量与剩料量，用以计算仔猪的平均采食量(ADFI)，根据仔猪平均增重和日采食量计算饲料转化率，记录每天腹泻仔猪的头次数并计算每个处理组仔猪的腹泻率，腹泻率(％)＝腹泻仔猪数/处理中总的仔猪数×100％。 

2试验结果 

试验阶段各组仔猪的体重、日增重、料肉比及腹泻率，见表26。 

表26  丁酸钠、丁酸梭菌对仔猪生产性能的影响 

试验结果表明，添加丁酸梭菌Cb-2的试验组与添加丁酸钠的对照组相比，日增重以添加0.5％丁酸梭菌Cb-2效果最好；料肉比以0.5％的丁酸梭菌Cb-2组为较好；所有试验猪在试验期间均未发生腹泻。 

3分析讨论 

本次试验结果表明，丁酸钠组和丁酸梭菌Cb-2各剂量组对猪的日增重和料肉比方面均有较好的表观效果，这与相关文献资料报导的一致，说明丁酸梭菌和丁酸钠对改善仔猪胃肠道的微生态环境具有良好的促进作用，从而保证仔猪对饲料具有良好的消化和利用效率，获得了较好的饲养效果。尤其是丁酸梭菌Cb-2的替代丁酸钠试验表明，丁酸梭菌Cb-2完全可以替代丁酸钠，真正起到“酸化肠道、修复黏膜；对抗耐药菌、优于丁酸钠”的作用。 

实施例3  丁酸梭菌对腹泻小鼠的治疗应用试验 

目的：观察丁酸梭菌Cb-2对氨苄青霉素引起的小鼠腹泻及肠道菌群的影响，评价丁酸梭菌Cb-2在调节肠道菌群平衡方面的作用。 

方法：采用氨苄青霉素灌胃的方法，制造小鼠腹泻模型；造模成功后灌服不同剂量丁酸梭菌Cb-2进行治疗，观察不同治疗时间的粪便情况并检测双歧杆菌、乳杆菌、肠杆菌、肠球菌和拟杆菌的数量。 

1材料与方法 

1.1试验动物：昆明小鼠，雄性，体重18～22g，购自泰邦生物制品研究所。 

1.2药品：氨苄青霉素，购自康地恩生物制药股份有限公司。 

1.3培养基：BDS、LBS、伊红美蓝琼脂(EMB)、TPY、叠氮钠-结晶紫-七叶苷琼脂 

1.4试验菌株：按照实施例例1中4.6的方法制备丁酸梭菌Cb-2粉剂(1.0×10⁸cfu/mL)，即丁酸梭菌Cb-2经发酵处理，得到发酵液，然后加入6％(重量百分数)玉米淀粉(商品名称：玉米淀粉；商品号：6920420601219；生产厂家：山东金城股份有限公司)通过喷雾干燥制成丁酸梭菌菌粉，，用灭菌生理盐水配制成活菌数分别为1.0×10⁴cfu/mL、1.0×10⁵cfu/mL、1.0×10⁶cfu/mL浓度的液体制剂，冷藏备用。 

1.5试验方法 

1.5.1小鼠腹泻模型 

制模环境：鼠笼充分清洁后铺5～6层卫生纸(便于肉眼观察粪便情况)，每笼2只小鼠，笼上贴分组标记，小鼠入笼后每天更换卫生纸。 

制模用药：准备制模用氨苄青霉素浓度22.4g/kg体重计算。按每次每只小鼠灌胃量0.5mL、每天2次、连续5天计算，将足量氨苄青霉素粉溶于无菌生理盐水，充分振荡溶解后，置4℃冰箱保存备用。 

模型制备：受试小鼠进行一周适应性饲养后，于造模前禁食12h(自由饮水)，按22.4g/kg体重配制足量氨苄青霉素生理盐水溶液，小鼠灌胃0.5mL/次.只，每天2次，连续5天，直至造成小鼠腹泻症状发生。 

1.5.2试验分组 

正常菌群组：15只，正常健康小鼠，空白对照。 

腹泻模型组：15只，造模后立即进行肠道菌群分析，验证模型是否成功建立。 

自然恢复组：15只，造模成功后不作任何治疗处理，连续观察7天，记录症状及菌群变化。 

生理盐水组：15只，造模成功后每只小鼠每次灌胃生理盐水0.5mL，每天2次，连续4天，观察到第7天。 

丁酸梭菌组：高(1.0×10⁶cfu/mL)、中(1.0×10⁵cfu/mL)、低(1.0×10⁴cfu/mL)三个剂量组，每组15只，造模成功后每只小鼠每次灌胃丁酸梭菌溶液0.5mL，每天2次，连续4天，观察至第8天。 

1.5.3症状学观察：氨苄青霉素溶液灌胃后立即观察用药反应，以后每天注意观察小鼠活动表现和粪便情况；治疗期间观察记录小鼠活动表现和粪便变化情况。 

1.5.4肠道菌群分析： 

造模前取5只小鼠的新鲜粪便作菌群分析，造模成功后无菌采取小鼠粪便进行活菌计数，并与正常菌群分析组对比分析；用丁酸梭菌各剂量组治疗后第4天(D4)、第6天(D6)、第8天(D8)，从各组中取5只小鼠剖杀，无菌取盲肠内容物，称重后10倍稀释，分别对其中的肠杆菌、肠球菌、乳杆菌、拟杆菌和双歧杆菌进行计数。自然恢复组和生理盐水组取样同治疗组。 

1.5.5统计学处理：肠道正常菌群分析结果换算成log值。组间均数比较采用T检验，所有数据用统计学SPSS10.0软件进行统计学处理。 

2结果与分析 

2.1腹泻症状比较 

治疗前，各组小鼠均呈现不同程度的水样便腹泻，治疗后3天，丁酸梭菌中、高剂量组有半数小鼠腹泻症状好转，低剂量组和生理盐水组效果稍差；治疗后5天，各剂量组几乎没有水样便，生理盐水组还有2只腹泻；7天后大部分小鼠已恢复正常粪便，生理盐水组有1只继续稀便，具体结果见表27。 

表27  各处理组试验小鼠腹泻症状回复情况 

2.2氨苄青霉素对小鼠肠道菌群的影响，结果见表28和图6。 

表28  正常小鼠与模型小鼠肠道菌群均值比 

注：O1是造型前菌群；O2是生理盐水组；T1是腹泻模型组。 

试验结果表明，生理盐水组O2同造模前小鼠O1肠内正常菌群相比，数量无明显变化， 差异不显著。用氨苄青霉素造模后，肠道内5种主导菌群的数量明显改变，同正常小鼠相应菌群数量相比，肠杆菌、拟杆菌、乳杆菌、双歧杆菌和肠球菌量剧减；模型组与正常组小鼠肠道菌群之间存在着显著性差异(p＜0.05)，说明模型小鼠肠道内微生物种群平衡已被破坏，出现菌群失调症。 

2.3丁酸梭菌不同治疗天数肠道菌群变化：如表29、表30、表31、图7、图8和图9所示。 

表29  各组小鼠处理后第4天肠菌群定量分析结果 

注：O2为生理盐水组；O3为腹泻自然恢复组；T2为10⁴Cb-2组；T3为10⁵Cb-2组；T4为10⁶Cb-2组；-代表未检出。 

表30  各组小鼠处理后第6天肠菌群定量分析结果 

注：O2为生理盐水组；O3为腹泻自然恢复组；T2为10⁴Cb-2组；T3为10⁵Cb-2组；T4为10⁶Cb-2组；-代表未检出。 

表31  各组小鼠处理后第8天肠菌群定量分析结果 

注：O2为生理盐水组；O3为腹泻自然恢复组；T2为10⁴Cb-2组；T3为10⁵Cb-2组；T4为10⁶Cb-2组； -代表未检出。 

试验结果表明，自然恢复O3组、生理盐水组造模成功后第4、6、8天，肠球菌、乳杆菌、双歧杆菌数量水平逐渐递升，但较正常健康小鼠肠道生理菌水平偏低。丁酸梭菌各剂量组治疗后第4天，乳杆菌和双歧杆菌增加非常明显，拟杆菌、肠杆菌和肠球菌增加明显；治疗后第6天，双歧杆菌增加明显，其他菌不明显；第8天各菌群则基本趋于正常值。 

3分析与讨论 

3.1用氨苄青霉素灌服小鼠，制作试验肠菌群失调症模型，旨在验证不同剂量组的丁酸梭菌Cb-2对小鼠肠菌群失调的药效学作用。试验结果表明，用氨苄青霉素灌胃5天后，小鼠出现了中、重度腹泻；肠道菌群定量分析表明，模型小鼠正常优势菌群的数量远低于正常健康小鼠，这种症状表明小鼠存在严重的肠菌群失调症，表示造模成功，模型小鼠可以作为评价丁酸梭菌治疗的客观依据。 

3.2从治疗效果上看，丁酸梭菌制剂治疗前，重度腹泻为100％，治疗后第4天，10⁵Cb-2组治愈率为30％，10⁶Cb-2组治愈率为40％；治疗后第6天，10⁵Cb-2组治愈率为70％，10⁶Cb-2组治愈率为80％；治疗后第8天则治愈率达到100％；10⁴Cb-2组治愈效果好于自然恢复组。可以看出丁酸梭菌对小鼠腹泻有很好的治疗效果，10⁵Cb-2组、10⁶Cb-2组对纠正肠菌群失调性腹泻有快速而显著作用，与剂量存在着一定的相关性。 

3.3从肠菌群定量分析看，未经处理的两组对照组造模成功后的一周内，五种正常肠道菌群数量逐渐回升，说明肠菌群有自愈倾向，但仍较正常健康小鼠肠道菌群数量水平偏低，说明肠道菌群失调在无外界因素辅助，在短时间内恢复正常较慢，这样就会对机体造成多重影响。经丁酸梭菌治疗后五种优势生理菌增殖水平高于对照组，说明丁酸梭菌对肠道生理性菌数量恢复和结构重建有迅速而积极的影响。值得注意的是，肠道主要优势菌群双歧杆、乳杆菌的数量增加幅度高于其他菌，从一个方面说明丁酸梭菌除能调整和补充肠道路正常菌群外，还能与双歧杆菌和乳杆菌等肠道内有益菌共生，并促使其生长繁殖。 

综上所述，本发明的丁酸梭菌具有以下功效：酸化肠道，促进小肠消化吸收功能；修复黏膜，维持肠黏膜上皮细胞的正常形态，增强免疫功能；对抗耐药菌，作为肠道细胞的能量来源；维护胃肠道内有益微生物菌群。应用时，可先将丁酸梭菌培养液制成预混剂、预混料，然后再与配合饲料的其它组份混合均匀后使用；也可直接与配合饲料各组份混合均匀后使用；既可应用于饲料厂，也可直接应用于养殖场。 

添加用量如表32所示： 

表32  丁酸梭菌的使用量说明 

注：按丁酸梭菌活菌数≥1亿/克，kg/t配合饲料 

本发明的丁酸梭菌可以作为丁酸钠的替代品用于畜牧业和饲料业。