乌苏里蝮蛇毒FLE基因、其编码蛋白及其真核表达产物的制备方法

技术领域

本发明涉及乌苏里蝮蛇毒FLE基因、其编码蛋白及其真核表达产物的制备方法。

背景技术

乌苏里蝮蛇(Gloydius ussuriensis)隶属于爬行纲(Reptilia)有鳞目(Squamata)蛇 亚目(Serpentes)蝰蛇科(Viperidae)蝮亚科(Crotalinae)亚洲蝮属(Gloydius)，在我 国主要分布在黑龙江、吉林、辽宁(北部)、内蒙古(大兴安岭以东)，是我国东北分布广泛、 种群数量最多、毒性强的一种毒蛇，具有重要的经济价值和药用价值。

蛇毒成分复杂，含有包括凝血酶、类凝血酶、磷脂酶、磷酸二酯酶、透明质酸酶、 精氨酸酯酶等在内的拥有多种生物活性的酶类。其中，在蝰亚科、蝮亚科和眼镜蛇科等 蛇毒中存在着一类能直接溶解纤维蛋白和纤维蛋白原的酶，称为纤维蛋白溶酶 (fibrin(ogen)olytic enzyme，FLE)，简称纤溶酶。蛇毒纤溶酶具有降解纤维蛋白和纤维蛋 白原的作用，能够通过抑制第VIII凝血因子影响正常凝血酶的生成。研究表明蛇毒纤溶酶 具有明显的抗血栓作用，可用于心脑血栓和心肌梗塞的治疗，可作为一种潜在的强力抗 栓剂，目前世界各国正在进行相关的研发工作。

发明内容

本发明提供一种乌苏里蝮蛇毒FLE基因、其编码蛋白及其真核表达产物的制备方法。

本发明乌苏里蝮蛇毒FLE基因是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID NO：1的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID NO：2的DNA序列。

本发明乌苏里蝮蛇毒FLE基因的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明乌苏里蝮蛇毒FLE基因真核表达产物的制备方法，按以下步骤进行：

一、构建乌苏里蝮蛇毒FLE基因的真核表达载体ppFASTBACHTa-FLE重组质粒； 二、ppFASTBACHTa-FLE重组质粒的提取及纯化；三、重组质粒注射小鼠：取20μg纯 化的ppFASTBACHTa-FLE重组质粒，用生理盐水稀释到小鼠体重的1/10，小鼠经尾静脉 注射稀释的ppFASTBACHTa-FLE重组质粒，在5s内注射完毕，8h后，将小鼠经颈椎脱 臼处死，取出肝脏组织，放入生理盐水中；四、真核表达产物的制备：采用pH为7.2的 磷酸盐缓冲液清洗小鼠肝脏组织3～5次，然后按照200mg组织/ml的比例向肝脏组织中 加入单去污剂裂解液，匀浆，然后于4℃、12000r/min离心10min，取上清液，采用亲和 层析法进行蛋白纯化，即完成乌苏里蝮蛇毒FLE基因真核表达产物的制备。

本发明提供了一个乌苏里蝮蛇毒FLE基因，其编码纤维蛋白溶酶FLE，具有纤溶活 性，能够降解纤维蛋白原和纤维蛋白。可用于溶解在心肌梗塞、中风、血栓等期间形成的 血凝块，作为一种强有力的抗栓、溶栓药物，将在心肌梗塞、中风、血栓等病症的治疗中 发挥重要作用。

附图说明

图1为具体实施方式三中真核表达产物的SDS-PAGE电泳结果；图2为具体实施方 式三中真核表达产物的Western blot检测结果；图3为具体实施方式三中对照组小鼠肝脏 组织免疫组织化学检测结果；图4为具体实施方式三中实验组小鼠肝脏组织免疫组织化学 检测结果；图5为具体实施方式三中真核表达产物的纤溶活性鉴定结果。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任 意组合。

具体实施方式一：本实施方式乌苏里蝮蛇毒FLE基因是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID NO：1的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID NO：2的DNA序列。

具体实施方式二：本实施方式乌苏里蝮蛇毒FLE基因的编码蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID NO：2所示。

乌苏里蝮蛇毒FLE基因的获得方法如下：

一、乌苏里蝮蛇毒腺总RNA的分离

1、乌苏里蝮蛇捕捉于黑龙江省牡丹江市，经分类系统检查，确认；2、取材时迅速 断取蛇头，用液氮速冻，再贮存于-80℃冰柜中，用时置于冰上，迅速剥离毒腺；3、将 毒腺置于液氮中迅速研磨成粉末状，装入冰上预冷的2ml的Eppendorf管内；4、加入450μl 的Tris饱和酚、350μl的氯仿、700μl的2％SDS缓冲液和100μl的β-巯基乙醇，振荡器上 剧烈震荡混匀10min；5、4℃，12000r/min离心10min；6、取上清于另一个Eppendorf管 中，再加入350μlTris饱和酚和350μl氯仿，振荡5min后，4℃，12000r/min离心7min； 7、重复步骤6一次；8、取上清加入预冷的700μl氯仿，振荡5min，4℃，12000r/min离 心7min；9、取上清，加入350μl无水乙醇和350μl 8mol/L的LiCl，冰浴10min，4℃， 12000r/min离心12min；10、弃上清，12000r/min瞬时离心5S，弃上清；11、将沉淀溶于 10μl DEPC水中贮存，同时进行电泳检测。

二、乌苏里蝮蛇毒腺总RNA的纯化

按照上海生工生物工程有限公司的RNA抽提试剂盒说明书纯化乌苏里蝮蛇毒腺总 RNA。

三、RT-PCR法扩增蛇毒FLE基因

采用反转录酶AMV试剂盒(购自上海生工生物工程有限公司)操作，将纯化后的乌 苏里蝮蛇毒腺总RNA反转录获得cDNA。以GenBank数据库已发表的短尾蝮蛇纤溶酶的 基因序列(GenBank登录号：AF176679)为依据，采用DNAMAN软件设计一对引物。P1 为正向引物序列，为方便后续试验的酶切，外设EcoR I酶切位点；P2为反向引物序列， 委托大连宝(TaKaRa)生物工程有限公司合成。

以cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系为50μl，由下列成分组成：

PCR扩增条件为：94℃预变性7min，94℃变性90s，55℃退火60s，72℃延伸90s， 共30个循环，再72℃延伸10min，4℃保存。

三、PCR产物的纯化及与载体的连接

PCR反应结束后对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，采用上海生工生物工程 有限公司胶回收试剂盒进行纯化回收，获得约777bp的目的片段，将该目的基因即为乌苏 里蝮蛇毒FLE基因。将乌苏里蝮蛇毒FLE基因连接到pMD18-T载体(购自大连宝生物 工程有限公司)上，得连接产物。

四、重组质粒的转化及鉴定

按博大泰克生物工程有限公司提供的JM109感受态细胞使用说明将连接产物转化到 JM109感受态细胞，筛选阳性克隆，提取重组质粒。

五、乌苏里蝮蛇毒FLE基因的核苷酸与氨基酸序列测定与分析

重组质粒命名为pMD18T-FLE，委托上海生工生物工程有限公司进行重组质粒的序列 测定，测序结果表明乌苏里蝮蛇毒FLE基因具有序列表中SEQ ID NO：1的核苷酸序列， 序列表中的SEQ ID NO：1由777个碱基组成，其编码序列为自5’端第1至777位碱基， 编码具有序列表中SEQ ID NO：2的氨基酸序列的蛋白质。

具体实施方式三：本实施方式乌苏里蝮蛇毒FLE基因真核表达产物的制备方法，按 以下步骤进行：

一、构建乌苏里蝮蛇毒FLE基因的真核表达载体ppFASTBACHTa-FLE重组质粒； 二、ppFASTBACHTa-FLE重组质粒的提取及纯化；三、重组质粒注射小鼠：取20μg纯 化的ppFASTBACHTa-FLE重组质粒，用生理盐水稀释到小鼠体重的1/10，小鼠经尾静脉 注射稀释的ppFASTBACHTa-FLE重组质粒，在5s内注射完毕，8h后，将小鼠经颈椎脱 臼处死，取出肝脏组织，放入生理盐水中；四、真核表达产物的制备：采用pH为7.2的 磷酸盐缓冲液清洗小鼠肝脏组织3～5次，然后按照200mg组织/ml的比例向肝脏组织中 加入单去污剂裂解液，匀浆，然后于4℃、12000r/min离心10min，取上清液，采用亲和 层析法进行蛋白纯化，即完成乌苏里蝮蛇毒FLE基因真核表达产物的制备。

单去污剂裂解液由50mmol/L且pH为8.0的Tris·HCl、150mmol/L的NaCl、体积浓 度为1％的TritonX-100和蒸馏水组成，临用时按照100∶1比例加入甲基磺酰氯。

本实施方式步骤一中构建乌苏里蝮蛇毒FLE基因的真核表达载体 ppFASTBACHTa-FLE重组质粒的方法为：a、将乌苏里蝮蛇毒FLE基因连接到pMD18-T 载体，得连接产物pMD18T-FLE；b、对pMD18-T-FLE和表达载体质粒pFASTBACHTa 均采用EcoR I和Pst I双酶切，回收目的基因片段和载体片段；c、将回收的目的基因片 段和载体片段通过T4DNA连接酶连接，连接产物转化到JM109感受态细胞，挑取阳性 的重组菌落，委托上海生工生物工程有限公司进行序列测定，测序正确的阳性菌株即含有 ppFASTBACHTa-FLE重组质粒。

步骤a中的连接体系如下：

连接反应条件：16℃水浴，8～12h。所述Solution I为pMD18-T载体配套缓冲液， 内含T4 DNA连接酶，购买自TaKaRa公司。

步骤b中pMD18-T-FLE双酶切的体系如下：

酶切反应条件：37℃水浴，2h。

步骤b中表达载体质粒pFASTBACHTa双酶切的体系如下：

酶切反应条件：37℃水浴，2h。

步骤c中的连接体系如下：

连接反应条件：16℃水浴，8～12h。

本实施方式步骤二中ppFASTBACHTa-FLE重组质粒的提取方法为：

(1)在无菌条件下，将测序正确的阳性菌株划线接种于含80μg/ml Amp的LB琼脂 平板上，37℃倒置培养16h，挑取单一菌落，接种于50ml含80μg/ml Amp的LB液体培 养基中，37℃震摇培养过夜，得菌液；

(2)取2ml菌液于2.0ml离心管中，4℃以12000r/min离心1min，弃上清，收集菌 体，向菌体中加入100μl预冷的溶液I，于漩涡振荡器上剧烈震荡混匀；

(3)加入200μl新配制的溶液II，盖紧管口，轻轻颠倒5次，0℃冰浴5min；

(4)加入150μl预冷的溶液III，盖紧管口，将管倒置后轻轻震荡至分散均匀，之后 0℃冰浴5min。

(5)4℃、12000r/min离心10min，吸取上清于另一离心管中，加入等体积的溶液A， 震荡混匀；

(6)4℃、12000r/min离心5min，吸取上清于另一离心管中，加入等体积的溶液B， 震荡混匀；

(7)4℃、12000r/min离心5min，吸取上清于另一离心管中，加入2倍体积的预冷 的无水乙醇，震荡混匀，-20℃下放置10min；

(8)4℃、12000r/min离心10min，弃上清，再加入体积浓度为70％的乙醇，吹打清 洗沉淀；

(9)4℃、12000r/min离心5min，弃上清，将离心管倒置于吸水纸上，自然干燥；

(10)于沉淀中加入30μl ddH₂O(含3μl RNase)，37℃水浴消化2h，-20℃保存备用。

(11)将所提取的质粒DNA2μl在1％琼脂糖凝胶上进行电泳，紫外灯下观察结果。

步骤(2)中所述溶液I由50mmol/L葡萄糖、25mmol/L且pH8.0的Tris·HCl、10mmol/L 且pH8.0的EDTA和蒸馏水组成，一次配置100ml，在10磅高压下蒸汽灭菌15min后， 保存于4℃备用。

步骤(3)中所述溶液II的配置方法：母液为10％SDS和10M NaOH，使用前稀释成 0.2mol/L NaOH和1％SDS。

步骤(4)中所述溶液III：配置100ml，内含5mol/L乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml， 水28.5ml。

步骤(5)中所述溶液A由酚、氯仿和异戊醇按体积比25∶24∶1组成；

步骤(6)中所述溶液B由氯仿和异戊醇按体积比24∶1。

本实施方式步骤二中ppFASTBACHTa-FLE重组质粒的纯化方法按照UNIQ-10柱式 DNA胶回收试剂盒(购买自上海生工生物工程有限公司)说明书操作。

本实施方式步骤四中采用亲和层析法进行蛋白纯化的方法为：

A、制备亲和层析柱：采用溴化氰活化的琼脂糖凝胶，与抗乌苏里蝮蛇蛇毒纤溶酶的 多克隆抗体(由上海生工生物工程有限公司合成)偶联，制备3.5×20cm的多克隆抗体亲 和层析柱，再采用平衡液进行柱子的平衡；所述平衡液由0.02mol/L Tris-HCl、0.5mol/L 的NaCl和蒸馏水组成，pH为7.8；

B、上样过柱：往层析柱内加上清液，每次加入3ml，置于温箱内相互作用20min， 释放流出液，再采用平衡液进行平衡，直至蛋白检出液处于稳定数值；

C、蛋白洗脱：采用亲和层析洗脱液洗脱表达产物，收集1-2ml/管，收集洗脱峰，透 析脱盐，冷冻干燥，即得到纯化的乌苏里蝮蛇毒FLE基因真核表达产物；所述洗脱液由 0.04mol/L的Tris-HCl、1.2mol/LNaCl和蒸馏水组成，pH为7.8。

采用以下方式检测本实施方式得到的真核表达产物：

取体重20～25g雄性昆明小鼠20只，随机分为2组。一组10只为实验组，另一组10 只为对照组。实验组采用本实施方式的方法进行处理；对照组小鼠经尾静脉注射体重1/10 的生理盐水。8h后，所有小鼠采用去眼球法采集血样，再经颈椎脱臼处死，取出肝脏组 织放入生理盐水中备用。

1、本实施方式真核表达产物的SDS-PAGE检测

按照200mg组织/ml的比例向实验组和对照组的肝脏组织中分别加入单去污剂裂解 液，匀浆，然后于4℃、12000r/min离心10min，取上清液；将上清液与等体积的2×SDS 上样缓冲液充分混匀，煮沸5min，再冰浴2min。以对照组的小鼠肝组织匀浆的上清液为 对照，进行SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶)电泳。电泳结果如图1所示，泳道1为蛋白分 子量标准，泳道2为对照组小鼠肝组织匀浆的上清液，泳道3为实验组小鼠肝组织匀浆的 上清液，泳道4为实验组小鼠肝组织匀浆的上清液。与对照组相比，实验组的样品中均出 现一条明显且清晰的蛋白表达条带，表明在小鼠肝脏组织中有重组蛋白表达。参照分子量 标准，该蛋白的分子量约为30kDa，与预期蛋白分子量相符。

2、本实施方式真核表达产物的Western blot检测

重组蛋白经SDS-PAGE电泳后，将分离胶置于转移缓冲液中，浸泡30min。以上海生 工生物工程有限公司制备的兔抗乌苏里蝮蛇蛇毒纤溶酶多克隆抗体作为一抗，第二抗体为 辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，采用半干式转移法进行转膜，DAB显色液中避光显 色，当观察到清晰的褐色条带时，立即终止显色反应，拍照保留。照片如图2所示，泳道 1为蛋白分子量标准，泳道2为小鼠肝组织蛋白样品的杂交条带。Western blot检测结果 显示，在30kDa处出现一条特异性的杂交条带，表明获得的真核表达产物为重组FLE蛋 白。

3、本实施方式真核表达产物的免疫组织化学检测

将实验组和对照组小鼠的肝组织做固定处理，然后进行常规梯度乙醇脱水，石蜡包 埋，所用的第一抗体和第二抗体与Western blot检测所用抗体相同，苏木精染色，中性树 胶封片，烘干后对组织切片进行拍照保存。对照组小鼠肝脏组织免疫组织化学检测结果如 图3所示，实验组小鼠肝脏组织免疫组织化学检测结果如图4所示，实验组和对照组小鼠 肝脏组织切片经免疫组织化学检测显示，对照组小鼠肝脏组织中未出现染色阳性细胞，大 部分呈蓝色；而在实验组小鼠肝脏组织中存在大量呈黄色的染色阳性细胞，表明重组FLE 蛋白在肝脏组织中高水平表达，且重组蛋白主要在细胞质中表达。

4、本实施方式真核表达产物的纤溶活性鉴定

纤溶活性鉴定采用纤维蛋白平板法。取2％琼脂溶液5ml(用pH7.4，含150mM NaCl、 50mM Tris-Cl的缓冲液配制)，在50℃水浴中与5ml 4％纤维蛋白原溶液(用pH 7.4，含 150mM NaCl、50mM Tris-Cl的缓冲液配制)混合，铺板前加入1ml含10单位的凝血酶， 混匀后倒入无菌培养皿中，室温凝固。待凝固后，在平板上打直径为4mm的小孔，每孔 加小鼠肝组织匀浆的上清液15μl，37℃保温18～72h，观察结果。

鉴定时以天然乌苏里蝮蛇毒做阳性对照。蛇毒处理方法：新鲜蛇毒5μl加45μl生理 盐水，混匀，4℃、10000r/min离心10min，取上清，-20℃保存备用。

采用纤维蛋白平板法对实验组和对照组小鼠肝脏组织匀浆进行了纤溶活性鉴定，并 取天然乌苏里蝮蛇蛇毒做阳性对照。实验结果如图5所示，由图可知，37℃保温18h后， 实验组样品(样品2和3为实验组小鼠肝组织匀浆的上清液)和天然蛇毒(样品4)均出 现了明显的纤溶圈，而对照组样品(样品1为对照组小鼠肝组织匀浆的上清液)未出现纤 溶现象，表明在小鼠肝脏中表达的重组FLE具有纤溶活性，能够降解纤维蛋白原和纤维 蛋白。