一种玉米苗期根腐病生防木霉菌的筛选方法

（一）      技术领域

    本发明涉及生物领域，特别涉及一种玉米苗期根腐病生防木霉菌的筛选方法。

（二）      背景技术

玉米苗期根腐病是一种分布广、危害严重、病原菌种类繁多和防治较困难的世界性病害。该病是由多种病原菌复合侵染引起，主要危害玉米的根及茎基部，引起根系及茎基部受害部位变褐坏死，影响作物对水分和养分的吸收，地上部叶片边缘出现黄褐色云纹状斑。玉米苗期根腐病的症状表现为：在玉米3-6叶期，地上部生长受到抑制，株型矮小，下部叶片从叶缘开始出现黄化症状，进而叶片或整株变黄，或出现褐色斑；胚根和须根上有褐色病斑，或腐烂，或缢缩。轻者可逐渐恢复，但是生长趋势明显减弱，影响产量，重者死亡，造成缺苗断垄。

国外报道引起玉米根腐病的病原菌有：禾生腐霉菌、禾谷镰刀菌、蠕孢菌、串珠镰刀菌、尖孢镰刀菌、立枯丝核菌等，主要病原菌为腐霉菌和镰刀菌。国内报道的病原菌有:串珠镰刀菌、串珠镰刀菌胶孢变种、禾谷镰刀菌、蠕孢菌、腐霉菌、丝核菌等。吉林省的优势种为镰刀菌占66-80%，丝核菌占5%-10%；浙江省串珠镰刀菌占49%-79.7%，腐霉菌的分离频率也较高；河北省以镰刀菌为主，立枯丝核菌为辅。总的看来，玉米根腐病的主要病原菌为串珠镰刀菌和禾谷镰刀菌，不同地区病原菌组成因生态环境的不同而略有差异。

玉米苗期根腐病的初侵染源为种子和土壤中的病原菌，在适宜的条件下侵入植株地下部，引起发病。传统的防治方法主要是化学药剂拌种。但该防治方法存在较多缺点：一是化学药剂只能杀死种子及周围的病原菌，而对稍远一些的病原菌却无能为力，而且在杀死病原菌的同时，也将有益微生物无选择地杀死；二是药剂防治，药量大，毒性大，污染重，长期使用会导致病原菌产生抗药性，使化学药剂失去了原有的防治作用。

木霉菌作为一种生防菌，可以防治很多经济作物的主要病害，对发生在根部和叶部病害都有很好的防治效果，近年来对储藏期病害也有研究。木霉菌对一些土传植物病原菌的防治具有很好的效果，这些病原菌包括：丝核菌属（Rhizoctonia）、小核菌属（Sclerotium）、镰刀菌属（Fusarium）、腐霉属（Pythium）、疫霉属（Phytophthora）等，并且木霉菌的不同种、同种不同菌株甚至同一菌株的不同后代个体都存在着拮抗性的差异及拮抗对象种类上的差别。作为普遍存在并具有丰富资源的拮抗微生物，在土传病害的生物防治中具有重要的地位。木霉菌的作用机制几乎包括了所有可能机制，并因此而受到广泛的关注，也是其用途广泛、效果突出的重要原因。据报道，木霉菌至少有如下几种作用机制：竞争作用、抗生作用、溶菌作用、寄生作用、诱导抗性、协同拮抗作用。

自从1932年Weindling发现木霉菌对植物病原真菌有拮抗作用，70多年来国外专家、学者对木霉菌生物药剂的开发做了许多尝试和深入的研究。美国的Top shield(哈茨木霉T22)、以色列的Trichodex(哈茨木霉T39)、新西兰的木霉制剂Trichodry和Trichoflow、俄罗斯Kolombet博士研制的木霉制剂(Myco1)、韩国Chung教授研究开发的木霉制剂YC458、西班牙Monte教授采用哈茨木霉和绿色木霉混合开发的生防制剂TUSAL，这些制剂在植物病害防治中都取得很好的防治效果和明显的增产作用。近年来，国内的科研人员也把生物防治的注意力转移到拮抗木霉菌上来，并使其逐步在田间得到应用。丁万隆等用木霉制剂防治西洋参立枯病，李良做了哈茨木霉T.harzianum防治茉莉白绢病，邢云章等用绿色木霉T.vi ride防治人参根腐病都取得了一定的效果。但现有的木霉菌在防治玉米苗期根腐病方面防病效果不佳，保苗率较低，应用效果不理想。

（三）      发明内容

    本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种低成本、简便易操作的玉米苗期根腐病生防木霉菌的筛选方法。

本发明是通过如下技术方案实现的：

一种玉米苗期根腐病生防木霉菌的筛选方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）土样采集：

选取玉米种植田块，每个地块5点取样，每取样点沿玉米根围从不同位置取样3次，取土深度0-20cm，同一田块5点取样后将其混合均匀装入无菌塑料袋；

（2）土壤溶液的制备：

将采集到的土样敲碎、风干后过筛，取充分混匀的土样10g于容量瓶中，加无菌水定容至100mL，振动30min，取10mL土壤悬浮液加入90mL无菌水中，依次稀释至10^－6倍，充分摇匀后用于分离；

（3）木霉菌的分离纯化：

将稀释后的土壤悬浮液在振荡器上振荡10-20s，吸取1mL土壤悬浮液至LB琼脂平板中央，用涂布棒涂匀，并做好浓度标记，涂好的LB琼脂平板静置5min，使土壤悬浮液渗透进LB琼脂平板中，将涂好的LB琼脂平板倒置于28℃恒温箱中培养，每浓度重复3次，待LB琼脂平板上长出菌落后，挑取菌落边缘幼嫩菌丝到PDA平板上反复纯化，从形成的单个分散的菌落上移植菌丝体于PDA斜面上冷冻保存；

（4）木霉菌的筛选：

将分离的木霉菌株用PDA培养基复筛后即得。

PDA培养基复筛属于现有技术，不再详述。

本发明玉米苗期根腐病生防木霉菌的筛选方法的有益效果是：方法简便易操作，成本较低；筛选出的木霉菌制备得到木霉菌剂贮存期长，能有效贮存1年以上，防病效果佳，出苗率提高约45%，存活率比对照高50%，保苗效果好，感病指数降低60%，对人畜和生态环境无害，无残留，不产生抗药性，原料来源广，生产成本低于化学农药多菌灵等，还可以变废为宝，具有很好的经济效益和社会效益。

（四）      附图说明

下面结合附图对本发明作进一步的说明。

附图1为不同载体对木霉菌产孢量的影响图。

（五）      具体实施方式

（A）玉米苗期根腐病病原菌的分离鉴定：

（Ⅰ）方法：

①病原菌分离：

玉米苗期根腐病病原菌分离：将玉米苗根部用清水冲洗干净，剪取根部病健交界处组织0.5cm左右，用常规方法进行组织表面消毒后，分别放置在PDA和CMA培养基上，28℃培养。5天后对分离物进行初步鉴定。如果是镰孢菌(Fusarium spp.)则转到F8液体培养基上，待其产生大型分生孢子后，挑取单孢进一步纯化，供菌种鉴定及测试用。

PDA培养基：马铃薯去皮200g，切碎加水1000mL，煮沸20min，纱布过滤，滤液补足至1000mL，加葡萄糖20g，琼脂15g，加热至熔化；

CMA培养基：取60g玉米粒放入水中煮1h，过滤，取液体加入20g琼脂，20g葡萄糖，加水至1000mL，pH=7.0，分装，灭菌；

F8液体培养基：KH₂PO₄ 2g；KNO₃ 2g；KCl 1g；MgSO₄ 1g；FeSO₄、FeCl₃、MnSO₄、ZnSO₄ 各0.0002g；Sug 1g；水1000mL；pH=5.0，分装，灭菌。

②病原菌鉴定：

将分离物依据魏景超(真菌鉴定手册》和Maleolme.shurtleff.的《eompendium of corn disease》(1980)所描述的无性器官形态特征及培养形状鉴定。

（Ⅱ）结果与分析：

玉米苗期根腐病病原菌种类：

从玉米苗期根腐病病株分离得到的病原菌有串珠镰孢菌、禾谷镰孢菌、尖孢镰孢菌、腐霉菌、立枯丝核菌等，其中串珠镰孢菌的分离频率最高，分别为43.66%；禾谷镰孢菌的分离频率为13.57%；其它病原菌的分离频率均在5%以下（表1）。结果说明，引起玉米苗期根腐病的主要病原菌为串珠镰孢菌和禾谷镰孢菌。

表1 玉米苗期根腐病病原菌分离频率

(B)玉米苗期根腐病生防木霉菌的筛选方法：

（Ⅰ）方法：

①   土样采集：

随机选取玉米种植田块，每个地块5点取样， 每取样点沿玉米根围从不同位置取样3次，取土深度0～20cm，同一田块5点取样后将其混合均匀装入无菌塑料袋，标明编号、地点、采集时间，带回实验室供分离用，共采集36份土样；

②土壤溶液的制备：　

将采集到的土样敲碎、风干后过筛，取充分混匀的土样10g于容量瓶中，加无菌水定容至100mL，振动30min。取10mL土壤悬浮液加入90mL无菌水中，依次稀释至10^－6倍，充分摇匀后用于分离；

③木霉菌的分离纯化：

将稀释后的土壤悬浮液在振荡器上振荡10～20s，吸取1mL土壤悬浮液至LB琼脂平板中央，用涂布棒涂匀，并做好浓度标记，涂好的LB琼脂平板静置5min，使土壤悬浮液渗透进LB琼脂平板中，将涂好的LB琼脂平板倒置于28℃恒温箱中培养，每浓度重复3次。待LB琼脂平板上长出菌落后，挑取菌落边缘幼嫩菌丝到PDA平板上反复纯化。从形成的单个分散的菌落上移植菌丝体于PDA斜面上冷冻保存待用；

④木霉菌的筛选：

从采集的36份土样中，分离出92株木霉菌株。用PDA培养基复筛后得到拮抗效果较好的10个木霉菌株，编号为：T-A2、T-B5、T-B8、T-B11、T-C7、T-C10、T-D3、T-E4、T-E8、T-F3；

⑤对峙培养：　

将PDA平板上培养5d左右的木霉菌与串珠镰孢菌分别用打孔器打成大小为6mm的菌饼，分别接种于PDA平板上，2个菌饼相距5cm，于28℃培养7d，逐日观察并记录木霉菌和串珠镰孢菌的菌落生长距离及拮抗情况，计算抑制率。

抑制率/%＝[(dCK－dB)/dCK]×100式中，dCK表示对照病原菌菌落直径，dB表示处理病原菌菌落直径。

防效=（对照病情指数-处理病情指数）/对照病情指数×100%

对峙培养72h时，挑取两菌落交界面菌丝制片，用显微镜观察木霉菌与病原菌交集处菌丝生长情况并跟踪观察。再以仅接种串珠镰孢菌为对照，同时做木霉菌和串珠镰孢菌的纯培养试验并记录菌落满皿时间，每处理3次重复。

对峙培养的抑制率：

从表2看出，10株拮抗效果较好的木霉菌株对串珠镰孢菌均有不同程度的抑制作用，抑制率大于70％有5株。其中，T-C7的抑制率高于85%，其最初生长速度均明显优于供试病原菌，对峙培养36h后两菌落菌丝相互接触，后可看到串珠镰孢菌生长速度迅速降低。由于木霉菌的拮抗，串珠镰孢菌菌落半径增加缓慢。显微镜下可以看到菌丝相互缠绕折叠，木霉菌的孢子在病原菌菌落上生长。

表2木霉菌对病原菌的拮抗效果

（Ⅱ）结果与分析：

①盆栽防治试验：

将串珠镰孢菌接于PDA培养基上，置于28℃恒温培养箱中培养，待其产生孢子后用灭菌水洗下，配成10⁴个/mL的孢子悬浮液。选择大小均一的玉米种子，用体积浓度为70％的酒精消毒5min后用无菌水洗涤3次，再以质量分数为0.1％的氯化汞溶液灭菌5min后用无菌水洗涤5次。每盆土重5kg，播种6粒。萌发后选取生长均匀的幼苗3株，分成以下3个处理（每个处理3次重复）：处理1：10⁷个/mL的木霉菌T-C7菌液50mL与50mL上述孢子悬浮液的混合液进行处理；处理2：1mg/mL的58%甲霜灵锰锌WP药液50mL与50mL上述孢子悬浮液的混合液进行处理；处理3：50mL清水与50mL上述孢子悬浮液的混合液进行处理。用上述三种处理方法的三种混合液分别浇灌幼苗(每盆100mL)，30d后调查各处理玉米的发病情况，计算病情指数和防效。玉米根腐病分级标准：0=根系健全，无病斑；1=根系上有零星病斑，但不连片；2=根病斑连片，但小于根部周长的l/4；3=根病斑大于根部周长的1/4，但小于l/2；4=根病斑大于周长的1/2，但小于3/4；5=整个根部均有病斑包围，根部腐烂。

②盆栽防治试验的防治效果：

盆栽防治试验结果(表3)表明，用木霉菌T-C7防治玉米苗期根腐病，防效为45.19%，用58%甲霜灵锰锌WP药液防治玉米苗期根腐病，防效为35.87%，低于木霉菌株T-C7。对各处理的玉米苗生长情况进行观察，经木霉菌T-C7处理的玉米苗的长势优于甲霜灵锰锌处理，表明，木霉菌T-C7对玉米苗的生长具有一定的促进作用。

表3盆栽防治试验的防治效果

（C）玉米苗期根腐病生防木霉菌的鉴定：

（Ⅰ）材料与方法:

①材料:

（a）供试菌株：木霉菌株T-C7。

(b)主要试剂:GoldView核酸染料，购于北京赛百盛生物工程有限公司；Taq酶、DL2000 PlusMarker和克隆载体pMD18-T，购于Takara公司；DNA回收试剂盒，购于北京博迈德生物工程有限公司； PCR扩增引物： ITS1： 5′TCCGTAGGT-GAACCTGCGG3′和ITS4： 5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

②方法:菌种鉴定:

（a）培养性状及形态观察:

将待鉴定的木霉菌株T-C7接入PDA平板，28℃培养，每隔24 h观察菌落的颜色和形态。72h后于显微镜下观察菌丝、分生孢子梗及分生孢子的大小和形态。依据Rifai和Bissett的方法进行分类鉴定。

(b)分子鉴定:

采用十六烷基三甲基溴化铵法（即CTAB法）提取木霉菌株T-C7总DNA，以通用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增。

25.00μl反应体系： 

2.50μl 10×Buffer， 2.00μl 2. 5mmol/L dNTPs ， 2.00μl 25 mmol/LMgCl2，1.00μl10μmol/LITS1引物，1.00μl10μmol/L ITS4引物，0.25μl5U/μlTaq酶，2.00μlDNA模板，用灭菌双蒸水补足至25.00μl。

反应程序：94℃变性5min；94℃变性30 s，51℃退火30s，72℃延伸1min，32个循环；72℃延伸10 min。用含有核酸染料的1%琼脂糖进行电泳检测，扩增产物经DNA回收试剂盒回收，将回收的PCR产物连接到克隆载体上，重组质粒转化至大肠杆菌DH5α宿主细胞中，使用含Amp的LB琼脂平板筛选含重组质粒的白色克隆，通过菌落PCR验证后送北京诺赛基因有限公司测序，测序结果与GenBank中已知木霉菌的ITS序列进行比对。

（Ⅱ）结果与分析:木霉菌T-C7的鉴定:

①培养性状及形态特征:

在PDA平板上，菌落生长迅速，棉絮状，浅绿色至深绿色，分生孢子梗主轴上初级分枝常位于基部，且多不规则，孢子梗主轴次级分枝分布结构复杂，通常具有2-3回分枝，瓶梗基部收缩不明显，分生孢子椭圆形或卵圆形，表面光滑。与长枝木霉的形态描述极为相似，初步鉴定为长枝木霉。

②ITS序列扩增结果:

木霉菌T-C7的基因组DNA经PCR扩增得到单一的目的条带。通过序列分析得知，序列长度为549 bp的DNA片段。将测定序列进行Blast比对，在GenBank数据库中进行同源性搜索，菌株T-C7的ITS序列与登录号为HM192931.1、GQ203535.1、EU401572.1和FJ858772.1的长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)的ITS序列的同源性达100%。根据菌株T-C7的ITS序列分析结果以及培养性状和形态特征，将其鉴定为长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)。

1 ccgagtttac aactcccaaa ccccaatgtg aacgttacca atctgttgcc tcggcgggat

61 tctcttgccc cgggcgcgtc gcagccccgg atcccatggc gcccgccgga ggaccaactc

121 caaactcttt tttctctccg tcgcggctcc cgtcgcggct ctgttttatt tttgctctga

181 gcctttctcg gcgaccctag cgggcgtctc gaaaatgaat caaaactttc aacaacggat

241 ctcttggttc tggcatcgat gaagaacgca gcgaaatgcg ataagtaatg tgaattgcag

301 aattcagtga atcatcgaat ctttgaacgc acattgcgcc cgccagtatt ctggcgggca

361 tgcctgtccg agcgtcattt caaccctcga acccctccgg ggggtcggcg ttggggatcg

421 gcccctcacc gggccgcccc cgaaatacag tggcggtctc gccgcagcct ctcctgcgca

481 gtagtttgca cactcgcacc gggagcgcgg cgcggccaca gccgtaaaac accccaaact

541 tctgaaatg。

（D）木霉菌的发酵工艺:

(Ⅰ)材料与方法:

①木霉菌株:长枝木霉菌株；

②营养条件:

(a)斜面培养基：将长枝木霉菌株接种到PDA培养基上30℃培养5天；

(b)液体培养基：成分为麸皮0.5-0.8g、硫酸铵0.2-0.4g、磷酸二氢钾0.1-0.3g、碳酸钙0.1-0.3g、葡萄糖1-2g，将上述物质用无菌水配制液体发酵培养基100mL，调整pH值为5.5-6，高压灭菌30-40min，冷却后，接入长枝木霉菌种，于26-30℃振荡培养60h后停止，备用；

(c)固体发酵培养基质的选择:

以木霉菌T-C7为发酵菌株并进行菌剂加工工艺研究，根据已有的报道，选择菌糠和玉米秸秆粉作为木霉菌株发酵培养基质，菌糠是利用秸秆、木屑等原料进行食用菌代料栽培，收货后的培养基剩余物，俗称食用菌栽培废料、菌渣或余料；是食用菌菌丝残体及经食用菌酶解，结构发生质变的粗纤维等成分的复合物。

不同配比的培养基质和含水量对产孢量的影响:

选择菌糠：玉米秸秆粉的重量比＝1:0.5、1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5、1:5，二者混合总量为50g，含水量分别为50%、55%、60%、65%、70%（W/W），装入500mL三角瓶中，重复3次，灭菌备用。接入木霉菌株T-C7的孢子悬浮液5.0mL（1.0×10⁷cfu/mL），纱布封口，保证良好的透气性，26℃培养（光照:黑暗＝12:12），培养环境相对湿度为90％。从第4d开始，每隔1d搅拌一次，培养至第10d，自然风干。然后取部分发酵产物60℃干燥箱内烘干24h，测定孢子量。以50g玉米秸秆粉为对照。

不同接种量对发酵时间和产孢量的影响：

将菌糠和玉米秸秆粉的混合物（二者重量比为1:4）混合总量为50g，加蒸馏水100mL，装入500mL三角瓶中，灭菌备用。分别接入木霉菌株T-C7孢子悬浮液5.0mL，孢子悬浮液浓度分别为1.0×10⁵cfu/mL、1.0×10⁶cfu/mL、1.0×10⁷cfu/mL、1.0×10⁸cfu/mL、1.0×10⁹cfu/mL，用6层纱布封口，保证良好的透气性，26℃分别培养（光照:黑暗＝12:12）5d、7d、10d和12d。培养环境相对湿度为90％。从第4d开始，每隔1d搅拌一次。发酵结束后，取部分发酵产物60℃干燥箱内烘干24h，检查孢子量。每一处理重复4次。

(Ⅱ) 结果与分析:

①固体发酵不同配比的培养基质和含水量对产孢量的影响：

表4 不同配比的培养基质和含水量对产孢量的影响

由表4看出，在26℃培养（光照:黑暗＝12:12）10d后，菌糠:玉米秸秆粉重量比为1:0.5、1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5、1:5十个配比中，随着培养基质中含水量的增加，发酵产物孢子量也在升高，其中以60%的含水量发酵产物最好。发酵结束后，1:0.5和1:1两个配比发酵产物风干破碎较困难，发酵成本增加。当含水量到达70％时，发酵过程中菌丝层表面出现结露现象，对产孢不利，产孢量降低。试验中还发现，随着菌糠比例的增大，产孢量会依次增加，但发酵过程中粘度变大，透气性降低，会增加细菌污染的风险。1:3配比有轻度的结块，1:3.5、1:4和1:5两个配比的发酵产物风干后非常松散，无需破碎。

考虑到发酵成本、孢子产量、发酵过程的透气性以及发酵产物风干后处理是否简便，选择菌糠和玉米秸秆粉的比例以1:4为最佳发酵配比，最适宜含水量为60％。

②不同接种量对木霉发酵时间和产孢量的影响：

表5 不同接种量对发酵时间和产孢量的影响

由表5结果看出，不同接种量对发酵时间有较大的影响。最低浓度的接种量（1×10⁵ cfu/mL）直到第12d的产孢量才达到和其它接种量相同的结果。随着接种量的增加，发酵时间缩短。第7d，1×10⁷ cfu/mL、1×10⁸ cfu/mL、1×10⁹ cfu/mL三个接种量的发酵物孢子产量即达到较高水平，每克发酵物含孢子量为1.37×10¹⁰-1.51×10¹⁰个，无显著差异。第5d至第7d是该三个接种量产孢高峰期。随着时间延长，孢子量还有增加的趋势，但增加量较低。从试验结果综合评价，选择每100g培养基质接种10mL孢子悬浮液（1×10⁷cfu/mL），发酵8d即可到达稳定的孢子产量。

（Ⅲ）木霉菌株T-C7固体发酵工艺：

综合前面研究结果，生防木霉菌株T-C7采用固体发酵法的发酵条件为：培养基质为菌糠和玉米秸秆粉（重量比为1:4），含水量为60%（W/W），120℃灭菌30min；发酵接种量为每100g培养基质接种10mL浓度为1×10⁷cfu/mL的孢子悬浮液；发酵温度26℃；发酵环境相对湿度90%以上；发酵8d即可停止，风干后储存即得满载木霉菌分生孢子的固体培养料。每克固体培养料孢子量可达1.37×10¹⁰-1.51×10¹⁰个。

(E)木霉菌剂的制备方法：

（Ⅰ）材料与方法：

①供试菌株：木霉菌T-C7。

②载体的筛选：

供试载体包括高岭土、碳酸钙、滑石粉、硅藻土、硅胶、膨润土或蛭石，以上载体均为市售。

（a）载体对木霉菌生长速度的影响:

以5﹪的比例将各种供试载体加入PDA培养基中制成平板，接入培养4d的木霉菌饼（d=5mm），25℃下培养4d，测量菌落直径大小并计算菌落直径日增长量。

菌落直径日增长量（cm/d）=(菌落直径-0.5cm)/4

(b)载体对木霉菌产孢量的影响：

在上述培养4d的木霉菌菌落边缘用打孔器（d=5mm）打取1块菌饼置于含两滴吐温-80的10ml无菌水中，充分摇匀，使孢子全部脱落，用血球计数板计数并计算单位面积产孢量。产孢量（个/cm²）=(平均每格孢子数×4×10⁶×稀释倍数)/0.19625。

③紫外保护剂的筛选：

供试紫外保护剂包括腐植酸、黄原胶、抗坏血酸。

（a）紫外保护剂对木霉菌生长速度的影响:

将腐植酸、黄原胶、抗坏血酸各0.5g分别加入到100mLPDA培养基中，制成培养基平板，将木霉菌块接入培养基平板中，每个处理重复4次，以PDA平板中不加紫外保护剂的处理为对照，紫外光照射30min，25℃黑暗培养箱中培养，4d测量菌落直径大小，并计算菌落直径日增长量。

(b)紫外保护剂对木霉菌产孢量的影响:

在上述步骤（a）培养4d的木霉菌菌落边缘用打孔器（d=5mm）打取1块菌饼置于含两滴吐温-80的10ml无菌水中，充分摇匀，使孢子全部脱落，用血球计数板计数并计算单位面积产孢量。利用SPSS数据处理软件（版本18.0）对试验结果进行处理，比较不同紫外保护剂对木霉菌株生长有无显著性影响。

④蛭石pH值的测定:

取10g蛭石放入具有磨口塞的锥形瓶中，加入pH 7.0的蒸馏水40mL，塞紧瓶塞剧烈摇动1min，再加蒸馏水50mL，摇动1min，静置后取上层清液，然后测定pH值。

⑤木霉菌剂的制备方法:

将蛭石载体进行粉碎，控制其细度为40-60目，调节湿度为8-12％，向载体中加入紫外保护剂，调配均匀后备用；将满载木霉菌分生孢子的固体培养料常温干燥后，用万能粉碎机粉碎成木霉菌分生孢子粉，将木霉菌分生孢子粉溶于木霉菌分生孢子粉重量8倍的水中混匀后，均匀喷洒到载体和紫外保护剂的混合物上，混匀，在鼓风干燥箱中进行烘干，使菌剂的相对湿度控制在10-15％，密封包装保存即得木霉菌剂；其中木霉菌分生孢子粉、紫外保护剂、载体的重量配比为10：1-5：85-90。

（Ⅱ）结果与分析：

①载体的筛选：

试验结果（图1）显示，供试载体对木霉菌落生长、产孢量都有影响，以蛭石对孢子活力保护最好，甚至还有促进菌落生长的作用，其他载体的菌落生长量与产孢量与对照相比有显著的差异。

②紫外保护剂的筛选：

供试的紫外保护剂中腐殖酸对木霉菌落生长有促进作用、对产孢量影响不大；黄原胶对木霉菌落生长也有促进作用，但产孢量降低；抗坏血酸对木霉菌的菌落生长和产孢量有抑制作用，见表6。

表6 不同紫外保护剂对木霉菌活力的影响

③蛭石pH值：

通过重复测定得出，蛭石的pH值为5-6，偏酸性，适合木霉菌生长。

实验表明，蛭石处理与对照在菌落直径日增长量与单位产孢量没有显著性的差异，对木霉活力影响不明显，腐殖酸对木霉菌落生长有促进作用、对产孢量影响不大。上述对木霉T-C7菌株具良好生物学相容性紫外保护剂的确定，为木霉生防制剂配方研究奠定了基础。

④木霉菌剂贮藏实验：

木霉菌剂装包后，放在常温下贮存，在第9、13个月时取出测定其孢子萌发率分别为：100%、94.6%；分别对菌剂进行高低温贮存试验，测定孢子萌发率，0℃贮存一周，孢子萌发率达99.60%，55℃贮存两周，孢子萌发率达90.2%，达到农药注册对贮藏期的要求。

（F）木霉菌剂药效结果：

（Ⅰ）材料与方法：

①菌剂：

木霉菌剂：固体发酵的菌剂作为防病试剂，约含孢子量2×10⁹g个/g。

②病原菌的选择：

利用蘸根接种法，对进行感病力的测定，选出致病力最强的菌株，在培养皿中培养7天，菌丝长满培养皿，放入组织捣碎器加水20倍捣碎，备用。

③生物制剂对自然土盆栽玉米根腐病防效试验：

每盆5kg重茬土壤，充分混匀。每盆播5粒玉米种子，保苗3株。设计三种不同处理：1、每穴施入木霉菌剂0.2g，同时种植玉米时接种串珠镰孢菌；2、清水对照：每穴不施入菌剂，种植玉米时不接种串珠镰孢菌；3、空白对照：每穴不施入菌剂，种植玉米时接种串珠镰孢菌。每处理设3个重复。在苗期调查发病情况，计算死亡率、病情指数和防效。

④田间试验：

试验设在玉米苗期根腐病重发的博兴县的试验田。试验田土质一致，地力均匀，土壤肥力中上。本试验以玉米为研究对象，设计三种不同处理：1、每穴施入木霉菌剂0.2g，同时种植玉米时接种串珠镰孢菌；3、清水对照：每穴不施入菌剂，种植玉米时不接种串珠镰孢菌；2、空白对照：每穴不施入菌剂，种植玉米时接种串珠镰孢菌。设置两个区组三次重复。每个区组包含三个小区，每个小区为一个处理，其小区面积4米×2.4米，区组内三个处理采用随机排列，区组面积为4米×7米。

⑤取样及调查：

苗期对植株取样，调查各处理玉米的发病情况，计算死亡率、病情指数和防效。

⑥统计：

将记录数据进行统计与分析

病情指数=100×∑（级数×该级株数）/（发病最高级数×总株数）

防效=（对照病情指数-处理病情指数）/对照病情指数×100%

死亡减少率=（接病对照死亡率-其它处理死亡率）/接病对照死亡率×100%。

（Ⅱ）结果与分析：

①盆栽试验木霉菌剂对盆栽玉米根腐病的防治效果：

表7 盆栽试验木霉菌剂对盆栽玉米根腐病的防治效果

盆栽试验(表7)证实，清水对照病情指数为63.51%，防效为11.09%。木霉菌剂处理的玉米，其死亡率比接病对照减少71.66%，病情指数为19.11%，防治效果高达73.24%。可见木霉菌防治效果明显高于清水对照和接病处理。

②田间试验木霉菌剂对玉米苗期根腐病的防治效果：

表8田间试验木霉菌剂对玉米苗期根腐病的防治效果

田间试验结果(表8)表明，用木霉菌剂防治玉米苗期根腐病，其出苗率大幅提高，死亡减少率为72.13%，保苗效果显著。病情指数为显著降低，防效为74.24%，防治效果显著。

总结：

（ⅰ）调查研究滨州市玉米苗期根腐病发病情况，对玉米苗期根腐病病健交界处组织进行培养，分离得到的病原菌有串珠镰孢菌、禾谷镰孢菌、茄类镰孢菌、束梗镰孢菌、尖孢镰孢菌、腐霉菌、立枯丝核菌等，其中串珠镰孢菌的分离频率最高，分别为43.66%；禾谷镰孢菌的分离频率为13.57%；其它几种病原菌的分离频率均在5%以下。结果表明，引起滨州市玉米苗期根腐病的主要病原菌为串珠镰孢菌和禾谷镰孢菌。

（ⅱ）筛选出拮抗玉米苗期根腐病的木霉菌并进行鉴定。从采集的36份土样中，分离出92株木霉菌株。用PDA培养基复筛后得到拮抗效果较好的10个木霉菌株，10株拮抗效果较好的木霉菌株对串珠镰孢菌均有不同程度的抑制作用，抑制率大于70％有5株。其中，T-C7的抑制率高于85%，其最初生长速度均明显优于供试病原菌，对峙培养36h后两菌落菌丝相互接触，后可看到镰孢菌生长速度迅速降低。

（ⅲ）根据培养性状及形态特征，T-C7菌株初步鉴定为长枝木霉。后通过rDNA-ITS序列分析，菌株T-C7的ITS序列与登录号为HM192931.1、GQ203535.1、EU401572.1和FJ858772.1的长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)的ITS序列的同源性达100%，遂将其鉴定为长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)。

（ⅳ）生防木霉菌株T-C7采用固体发酵法的发酵条件为：培养基质为菌糠和玉米秸秆粉（重量比为1:4），含水量为60%（W/W），120℃灭菌30min；发酵接种量为每100g培养基质接种10mL浓度为1×10⁷cfu/mL的孢子悬浮液；发酵温度26℃；发酵8d即可停止，风干后储存。每克固体培养料孢子量可达1.37×10¹⁰-1.51×10¹⁰个。

（ⅴ）木霉菌剂制备：将蛭石载体进行粉碎，控制其细度为40-60目，调节湿度为8-12％，向载体中加入紫外保护剂，调配均匀后备用；将满载木霉菌分生孢子的固体培养料常温干燥后，用万能粉碎机粉碎成木霉菌分生孢子粉，将木霉菌分生孢子粉溶于木霉菌分生孢子粉重量8倍的水中混匀后，均匀喷洒到载体和紫外保护剂的混合物上，混匀，在鼓风干燥箱中进行烘干，使菌剂的相对湿度控制在10-15％，密封包装保存即得木霉菌剂；其中木霉菌分生孢子粉、紫外保护剂、载体的重量配比为10：1-5：85-90。

（ⅵ）木霉菌剂装包后，放在常温下贮存，达到农药注册对贮藏期的要求。

（ⅶ）田间试验结果表明，用木霉菌剂防治玉米苗期根腐病，其死亡率比接病对照减少75.43%，病情指数为19.43%，防效为74.24%。

本发明所制木霉菌剂对人畜和生态环境无害，无残留，不产生抗药性，生产成本低于化学农药多菌灵等，还可以变废为宝，具有很好的经济效益和社会效益。具体比较如下表：

表9木霉菌剂和化学农药特性综合对比表

本发明所制木霉菌剂与其它同类产品相比具有以下优势：

（1）生产周期短、产孢量大，使用方便。在固体发酵阶段木霉分生孢子的产孢量高，每克固体培养料含孢子量为1.37×10¹⁰-1.51×10¹⁰ 个；采用穴施法施入木霉菌粉剂，简便易行，降低劳动成本；

（2）原料来源广，成本低，产品可以消耗大量玉米秸秆，不仅避免因焚烧玉米秸秆造成的大气污染，还可以变废为宝，具有很好的经济效益和社会效益，是发展高效，绿色，生态农业理想的生物农药；

（3）木霉分生孢子收集的工序简便，将满载木霉菌分生孢子的固体培养料经常温干燥后，用万能粉碎机粉碎成木霉菌分生孢子粉，利于生产；

（4）贮存期长，有利于产品流通。木霉菌剂装包后，放在常温下贮存，在第9、13个月时取出测定其孢子萌发率分别为：100%、94.6%。

该木霉菌剂可有效防治玉米苗期根腐病，促进根系生长，并能提高保苗率，进而增加玉米产量，促进农民增收。2010年滨州玉米种植面积达370.39万亩，亩产492.8公斤，随着近几年全球气候变化等因素的影响，玉米苗期根腐病发病面积有扩大趋势，若以存活率提高10%计，则每亩可增产约50公斤，整个滨州市可增产20万吨，以每吨1600元计，则可增加收入3亿2000万元。木酶菌剂能增加植株生物量，有促进生长的作用，若促进产量增加1%，则可增加收入3200万元，而在实际生产中，增加率要高于1%。另外木霉菌剂制备时可以消耗大量玉米秸秆，不仅避免因焚烧玉米秸秆造成的大气污染，还可以变废为宝，具有很好的经济效益，有利于农村循环经济的发展。

目前农药的发展趋向是高效、高安全性、作用机制多样化以及良好的环境相容性。该产品的投产有利于转变经济发展方式，有利于农药产业的升级换代。该木霉菌剂与传统农药相比，具有目标害虫单一、用量少、毒性小、效率高、易分解等特性，符合农药发展趋势。该菌剂的广泛应用必将减少化学农药的使用量，降低抗药性发生，减小污染，有利于环境保护，对促进生态环境的好转有积极意义。