一种新生大鼠海马神经元原代培养的培养液及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种新生大鼠海马神经元原代培养液及其制备方法和应用。 

背景技术

神经元是神经系统结构和功能的基本单位，也是研究神经系统生理、病理机制及各种神经递质功能的良好材料。海马组织中神经元数量和分布较为集中，海马神经元体外培养是研究神经系统结构、功能以及病理、生理变化的重要手段之一。现有的海马神经元培养液中基本都是在DMEM、F12培养基添加血清，培养海马神经元。血清增加了胶质细胞等非神经元增殖速度，影响了海马神经元的纯度，对神经细胞有不同程度的毒性，且由于血清中成分复杂，对实验产生一定的影响或干扰。神经元培养的一个重要问题是保证神经元的纯度与活性。 

中国专利CN1966674A公开了一种蜘蛛中枢神经细胞培养液，该发明所采用的培养液添加了200ml小牛血清；中国专利CN1171991C公开了“人神经干细胞的培养方法”，该发明培养液由DMEM和F12以1∶1混合而成的基础培养液，添加胰岛素、L-谷氨酰胺、盐酸丁二胺、硒化钠、人转铁蛋白、氢化可的松、黄体酮，另外添加5-20％新鲜血清；因此，以上神经培养液的配方和方法同样存在不能有效减少了胶质细胞的生长，保证神经元纯度的问题。培养液中即使添加了阿糖胞苷等抑制胶质细胞分裂的药物能提高神经细胞的纯度，但是，阿糖胞苷的加入对神经细胞生长也有一定的抑制作用，严重影响所培养的神经元活性。 

尽管无血清培养出现，提高了神经元培养的纯度，减少了胶质细胞的生长，但是所培养的海马神经元仍然具有存活率低、细胞生长缓慢和突触形成少等缺点，不能满足对细胞进一步实验的要求。目前无血清培养液的添加物都含有Invitrogen(GIBCO)公司研发的神经元培养液B27或(和)N2，其主要成分为多种维生素和微量元素。尽管提高了神经细胞培养的纯度，有效减少了胶质细胞的生长，但是仍然存在不能为海马神经元培养提供足够的能量，在缺氧环境下尤为明显，更容易导致致死性损害，影响了海马神经元的生长状态，从而造成细胞存活率低、细胞生长缓慢和突触形成少等问题。通过增加葡萄糖剂量的方法，结果会更糟糕，葡萄糖作为能源物质在无氧酵解产生大量乳酸堆积，也会降低培养液的pH值， 增加渗透压，损害神经细胞，造成培养基中神经细胞生长抑制，同时也增加了神经细胞污染的机会。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种具有纯度高、生长状态好的海马神经元的培养液及其制备方法，并提供了利用这种培养液培养海马神经元的方法。 

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案是，一种海马神经元培养液，该培养液为在基础培养液中加入1、6二磷酸果糖、果糖和营养添加剂；每升基础培养液中加入1-10mmol的1、6二磷酸果糖和2-20mmol的果糖，其中所述基础培养液为Neurobasal Medium。 

所述1、6二磷酸果糖与果糖质量浓度比为1∶2。每升基础培养液中加入如下组分的营养添加剂：10-20μg碱性成纤维细胞生长因子，6-15mg ATP，30-50U辅酶A，0.1-1g两性霉素B，5-50mg胰岛素，0.42-0.83mg硫酸亚铁，5-50mg人转铁蛋白和20-60mg维生素混合液。维生素混合液为生物素、氯化胆碱、泛酸钙、叶酸、肌醇、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12和烟酰胺的混合物。其中，本发明所述的商品化基础培养液Neurobasal Medium(GIBCO公司)。之后采用0.22μm的滤膜过滤除菌。配置好的培养液置于4℃储存。 

本发明的培养液中1，6-二磷酸果糖是能在分子水平上调节细胞代谢中若干酶活性，恢复和改善细胞代谢，减轻细胞损伤，能促进血液循环，增加ATP合成。果糖作为体外培养的能量成分明显优于葡萄糖，果糖酵解与葡萄糖酵解的主要区别在于在果糖酵解过程中，果糖氧化磷酸化为F-1-P(1-磷酸果糖)——糖酵解前体物质，能在缺氧状态下提供ATP，维持细胞膜的离子泵，所以能有效的保护细胞膜的完整性和维持细胞活性的功能。而葡萄糖代谢过程中却不能产生F-1-P。本发明添加1，6-二磷酸果糖和果糖的混合物有较好的效果，1，6-二磷酸果糖和果糖有显著的协同作用，可以显著增加增加海马神经元的活力，尤其在缺氧状态下照常提供ATP细胞，保证神经元的纯度与活性。 

所述本发明的培养液中营养添加剂包括碱性成纤维细胞生长因子，胰岛素、硫酸亚铁、人转铁蛋白、ATP、辅酶A、两性霉素B和维生素混合液。 

本发明中提供的动物细胞无血清低密度培养基中胰岛素是重要的血清替代成分。胰岛素可促进糖元与脂肪酸的合成，同时促进RNA、蛋白质和脂类的合成。胰岛素可以为重组胰岛素、牛源胰岛素或人源胰岛素，胰岛素类因子也可以使用。本发明中使用的硫酸亚铁为培养基提供细胞生长所需的亚铁离子，同时可以作为转铁蛋白的替代成分。本发明中使用的转 铁蛋白主要是细胞获取微量元素的主要渠道，同时具有促进胰岛素发挥作用的功能。在该发明使用的转铁蛋白可以是重组的、人源的或牛源的等，另外柠檬酸铁也可以起到同样的作用。本发明中使用的维生素为细胞的生长代谢提供必要的维生素，促进细胞生长和延长细胞活性，提供营养物质的同时降低代谢产物的堆积。本发明所使用的维生素是无菌包装的维生素混合液。使用浓度参考说市售的产品明书推荐浓度，采用相应培养基稀释即可。ATP作为能量物质，在分解时放出大量的能量，可以为细胞培养的各个过程都提供充足的能量，改善和提高细胞酶的代谢功能，促进细胞的扩增和传代。辅酶A能够促进三羧酸的循环，为细胞的扩增与传代提供能量。两性霉素B的使用浓度在0.1-1g/L。 

本发明还提供了一种原代培养大鼠海马神经元的方法，具有以下步骤： 

①制备如权利要求1-5之一所述的海马神经元原代培养的培养液； 

②取材、消化：新生大鼠断头取脑，在冰上钝性拨离出脑组织，去除血管膜，完整取出海马组织；剪碎成约1mm3的小块，加入约与组织等体积的浓度为2-4mg/mL的木瓜酶，混匀，37℃消化5-15min。用含10％胎牛血清DMEM/F12培养基终止消化，并加入10μlDNase I打开絮状黏连，吸管轻轻吹打组织块分散细胞。 

③制备单细胞悬液：将步骤②细胞悬液经400目尼龙网过滤，1000r/min离心10min去上清，加10％胎牛血清的DMEM/F12重悬，调细胞密度为1～5×105个细胞/mL浓度的单细胞悬液； 

④接种、培养：将步骤③制备的单细胞悬液加入多聚L-赖氨酸的培养板中，置于37℃、5％CO2培养箱培养；24h后将原来含10％胎牛血清DMEM/F12培养基更改为步骤①制备的海马神经元原代培养的培养液，每隔2d换液1次，每次更换一半培养液。 

本发明所能达到的有益效果如下： 

(1)利用本发明的培养液进行海马神经元体外培养，获得了相对单一、纯度高(纯度≥90％以上)的海马神经元。这就是由于1，6-二磷酸果糖和果糖为海马神经元培养提供的足够的能量，促进了海马神经元的活性； 

(2)利用本发明的培养液进行海马神经元体外培养，有效地提高了神经元的存活率，且神经元的生长状态良好、生理特性稳定，表明本培养方法可以满足体外实验的要求； 

(3)利用本发明的培养液进行海马神经元体外培养，与传统培养方法相比，体外培养的海马神经元存活的时间大大得到延长(高纯度、高活性的海马神经元细胞可以维持16天以上)； 

(4)本发明的培养液海马神经元培养液配制方法简单，可重复性强，操作简便易行。 

具体实施方式

实施例1海马神经元培养液的配方及制备方法 

按照下表中的配方配置培养液1-9： 

上述培养液1-7的制备方法如下： 

a.按所述配比取1、6二磷酸果糖、果糖加入基础培养液Neurobasal Medium中，充分搅拌均匀； 

b.加入上述量的碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素、硫酸亚铁、人转铁蛋白、两性霉素B、维生素混合液； 

c.以1-10当量浓度的氢氧化钠调pH 7.4-8.0； 

d.层流细胞培养室抽滤消毒，4℃储存备用，使用前再加入所述量的ATP以及辅酶A。实施例2原代培养大鼠海马神经元的方法 

具有以下步骤： 

①制备如实施例1所述的海马神经元原代培养的培养液； 

②取材、消化：新生大鼠断头取脑，在冰上钝性拨离出脑组织，去除血管膜，完整取出海马组织；剪碎成约1mm3的小块，加入约与组织等体积的浓度为2-4mg/mL的木瓜酶，混匀，37℃消化5-15min。用含10％胎牛血清DMEM/F12培养基终止消化，并加入10μlDNase I打开絮状黏连，吸管轻轻吹打组织块分散细胞。 

③制备单细胞悬液：将步骤②细胞悬液经400目尼龙网过滤，1000r/min离心10min去上清，加10％胎牛血清的DMEM/F12重悬，调细胞密度为1～5×105个细胞/mL浓度的单细胞悬液； 

④接种、培养：将步骤③制备的单细胞悬液加入多聚L-赖氨酸的培养板中，置于37℃、5％CO2培养箱培养；24h后将原来含10％胎牛血清DMEM/F12培养基更改为步骤①制备的海马神经元原代培养的培养液，每隔2d换液1次，每次更换一半培养液。 

实施例3原代培养大鼠海马神经元的形态学观察和功能试验 

在倒置显微镜下观察，大鼠海马神经细胞接种6～8h开始贴壁，单个分散，呈圆形。24h后基本完全贴壁，细胞开始变扁平，并开始长出1～2个突起。3d后，神经元数量进一步增多，突起进一步增长，而神经胶质细胞也开始迅速分裂增殖，神经元下形成一片支持层。10d神经元状态良好，神经元突触发育成熟，形成明显的神经网络。培养至14d，虽然细胞数目有所减少，细胞却达到最佳的状态，胞体周围有明显的光晕，且细胞最饱满。培养17d，随着培养时间的进一步延长，细胞开始出现退化、脱落。DMEM/F12+20％小牛血清组和Neurobasal medium+2％B27组出现神经细胞的死亡，可见凋亡小体。DMEM/F12+20％小牛血清实验组培养至24d，神经细胞全部死亡、退化，可见变性的神经细胞残迹。 

本发明实验组神经元胞体饱满，核大，突起明显增长，连接密集，形成复杂的神经纤维网络，阳性细胞(纯度)≥90％。显著高于DMEM/F12+20％小牛血清组和Neurobasal Medium+2％B27组；DMEM/F12+20％小牛血清组和Neurobasal Medium+2％B27组细胞数量相对较少，极少数细胞长出突起。用图像分析仪分析，结果见表1-4。本发明组神经细胞胞体面积、长径、短径均显著高于DMEM/F12+20％小牛血清组和Neurobasal Medium+2％B27组(p＜0.01)，表明本发明组对神经细胞生长发育有促进作用。 

表1培养的海马神经元的细胞活力 

注：^**表示P＜0.01表示差异极显著。 

培养液4中5mmol/L 1，6-二磷酸果糖和10mmol/L果糖有最好的效果。 

表2培养的海马神经元MTT 

由表1可看出，与DMEM/F12+20％小牛血清组、Neurobasal Medium+2％B27组比较，本发明(培养液1)组、本发明(培养液5)组OD值均明显增加，表明本发明培养液可以促进神经细胞的增殖，提高神经活性。 

表3培养的海马神经元LDH释放量 

注：^**表示p＜0.01表示差异极显著。 

表4组胞体直径和突起长度测量 

注：^**表示P＜0.01表示差异极显著。 

实施例4神经细胞存活率的测定 

本发明神经元培养液对神经细胞的存活起明显的促进作用，培养14天时神经元存活 率，与DMEM/F12+20％小牛血清、Neurobasal Medium+2％B27组相比，DMEM/F12+20％小牛血清组、Neurobasal Medium+2％B27组存活率分别为65％、69％。，而发明1组和发明2 

组分别为81％、85％，本发明明显促进神经细胞的存活，差异极显著(p＜0.01)。 

实施例5不同培养时间神经元纯度的测定 

表5不同培养时间神经元纯度(％)和神经元形态 

注解： 

++++，神经元密度高，分布均匀，胞体粗大 

+++，神经元较多，形态典型 

++，神经元散在 

+，偶尔神经元 

结果显示，12天后DMEM/F12+20％小牛血清组和Neurobasal Medium+2％B27组的神神经元大量死亡；而本发明(培养液2)组神经元的存活高，生长旺盛，第16天仍然有很好的神经元纯度和典型的神经元形态。 

结论：本发明方法培养的原代海马神经元体外最长存活期达1月余，神经元形态典型，海马神经元纯度≥90％，且神经元的生长状态良好、生理特性稳定，可以满足体外实验的要求，可作为海马神经元原代培养的良好培养液。