一种鉴别猪瘟疫苗毒株和流行毒株反转录-复合套式聚合酶链式反应诊断试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及的鉴别猪瘟疫苗毒株和流行毒株反转录-复合套式聚合酶链式反应诊断试剂盒及检测方法，属于动物医学动物疫病分子生物学诊断技术领域。 

背景技术

猪瘟(Classical swine fever，CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起的一种高度接触性传染病，迄今仍是我国最重要的猪传染病之一，每年引起猪只发病死亡的损失巨大，因此世界动物卫生组织(World organization for animal health，OIE)将其列为16种A类法定传染病之一，我国农业部将其列为一类传染病。猪瘟是养猪业的一种毁灭性传染病，几乎遍及全世界(除北美洲和大洋洲外)，死亡率高达80％～90％。 

1954年，我国学者周泰冲等通过将CSFV强毒Shimen株连续在兔体传代数百代后致弱，成功研制出了世界公认有良好免疫效果的猪瘟兔化弱毒疫苗，至今已应用了半个世纪，对我国猪瘟疫情的控制做出了积极贡献。但是，弱毒疫苗的使用对猪瘟的诊断造成了很大干扰。鉴于以上弊端，西方发达国家对猪瘟采取不免疫，感染猪扑杀的策略进行净化。但我国目前对扑杀的损失还难以承受，主要依赖于疫苗接种进行猪瘟的控制。 

我国使用的诊断猪瘟的血清学方法有琼脂扩散试验、荧光抗体试验、间接血凝试验、中和试验、酶联免疫吸附试验和免疫胶体金技术，分子生物学 方法有RT-PCR技术和核酸探针技术。现有的血清学检测方法大多数是检测抗体水平，在疫苗免疫效果的评价上有重要作用，但在猪瘟的定性诊断上尚需要依赖病原的检测。在病原检测上常用荧光抗体试验和RT-PCR技术。由于我国多年一直采用疫苗预防为主的猪瘟防控策略，猪群疫苗免疫覆盖率高，导致疫苗毒株在猪群中广泛存在。常规荧光抗体试验和RT-PCR技术不能区分疫苗毒株和猪瘟流行毒株，在诊断结果的判定上存在困难。 

目前，在国内有学者尝试建立相关的鉴别诊断方法，如赵耕等建立了RT-PCR和酶切的方法区分猪瘟强毒与疫苗弱毒，但该技术无法确诊早期感染；赵建军等建立了鉴别猪瘟病毒野毒株和兔化弱毒疫苗株的复合荧光定量RT-PCR检测方法，但成本较高，目前只应用于实验室检测。李艳等建立了鉴别猪瘟强毒和弱毒的RT-nPCR检测方法，强毒出现1条343bp的特异条带，弱毒出现1条447bp的特异条带，但是由于2条片段大小相近，在一次反应中不易做出准确判断。李安等建立的鉴别方法扩增的极限为6.5×10^-2pg·L^-1，灵敏度较低，由于猪瘟病毒在组织病料中的拷贝数较低，灵敏度不够可能会造成用组织病料诊断时的漏诊。 

发明内容

针对上述现有技术中存在的问题与缺陷，本发明的是目的在于提供一种用于鉴别猪瘟疫苗毒株和流行毒株反转录-复合套式聚合酶链式反应诊断试剂盒，该试剂盒操作简便、结果直观、灵敏度高、特异性好的区分猪瘟流行毒株与疫苗毒株的诊断试剂盒。 

实现上述发明目的的技术方案是一种用于鉴别猪瘟疫苗毒株和流行毒株反转录-复合套式聚合酶链式反应诊断试剂盒，该试剂盒由反转录混合液、一 扩混合液、二扩混合液、阴性对照和阳性对照组成； 

所述反转录混合液由DEPC处理灭菌水、2.5m mol·L^-1dNTP、5×AMVBuffer、25μmol·L^-1S2下游引物、5U/μL AMV反转录酶和40U/μL HPR I RNA酶抑制剂组成；每个反应体积比为10∶4∶4∶1∶0.5∶0.5，共计20μL，50个反应共计1000μL，装成1管； 

所述一扩混合液由灭菌三蒸水、10×PCR Buffer、2.5m mol·L^-1dNTP、25μmol·L^-1S1上游引物、25μmol·L^-1S2下游引物、5U/μL rTaq DNA聚合酶组成，每个反应体积比为17∶2.5∶2∶0.5∶0.5∶0.5，共计23μL，50个反应共计1150μL，装成1管； 

所述二扩混合液由灭菌三蒸水、10×PCR Buffer、2.5m mol·L^-1dNTP、25μmol·L^-1S3上游引物、25μmol·L^-1S4下游引物、25μmol·L^-1S5下游引物、5U/μLrTaq DNA聚合酶组成，每个反应体积比为16.5∶2.5∶2∶0.5∶0.5∶0.5，共计23μL，50个反应共计1150μL，装成1管； 

所述阴性对照为正常细胞培养上清液，阳性对照为HCLV株细胞培养液； 

所述的引物S1序列为：5’-GACACTAGYGCAGGCAAYA-3’ 

所述的引物S2序列为：5’-AGTGGGTTCCAGGARTAC-3’ 

所述的引物S3序列为：5’-CCACGGGGGTGCCCTACAA-3’ 

所述的引物S4序列为：5’-CCTGGCATGTAACTA-3’ 

所述的引物S5序列为：5’-CTCTCGGTGAGAAATTTG-3’。 

本发明还有一个目的是提供上述试剂盒鉴别检测猪瘟流行毒株和疫苗毒株的方法，包括以下步骤： 

1)TRIzol Reagent试剂法提取待检样品总RNA，空气中自然干燥； 

2)取反转录混合液20μL，充分吹吸溶解总RNA，42℃水浴反转录90min，取出置-20℃保存备用； 

3)取一扩混合液23μL，加入反转录产物2μL，混合均匀进行PCR扩增，反应条件为95℃预变性5min，94℃45s，54℃50s，72℃50s共进行35个循环，最后72℃延伸10min； 

4)取二扩混合液23μL，加入一扩产物2μL，混合均匀进行PCR扩增，反应条件为95℃预变性5min，94℃30s，54℃30s，72℃40s共进行35个循环，最后72℃延伸10min； 

5)10g·L^-1琼脂糖凝胶中电泳； 

6)结果分析：阴性对照不出条带，阳性对照出261bp、157bp两个条带，说明对照成立，样品中出现261bp一个条带，即为猪瘟流行毒株感染，样品出261bp、157bp两个条带，即为疫苗毒株。 

试剂盒的验证性试验 

①特异性试验 

使用本发明的诊断试剂盒，提取HCLV、Shimen、SXYL2006、GX54、SD2002、BVDV和PRRSV总RNA(SXYL2006、GX54和SD2002为本实验室分离CSFV流行毒株，并进行了全基因测序)，按操作方法进行反转录-套式复合PCR；按照DNAzol Reagent试剂说明提取PCV-2、PRV、PPV等DNA病毒的DNA作为模板，用试剂盒的一扩混合液和二扩混合液进行套式复合PCR，扩增完毕后电泳观察。结果显示，HCLV株出现261bp、157bp两个条带，Shimen、SXYL2006、GX54和SD2002出现261bp一个条带，BVDV、PRRSV、PCV-2、PRV和PPV均没有出现条带(见附图1)。回收各阳性样本 的条带，纯化后连接pMD18-T载体，转化DH5α感受态细胞，取PCR鉴定为阳性得菌液，提取质粒进行测序，将测得的序列与所用毒株基因序列进行比较，发现序列完全一致。结果证实本试剂盒及检测方法具有很高的特异性，能准确扩增CSFV基因片段，并能直观区分疫苗株和流行毒株。 

②灵敏度试验 

使用本发明提供的诊断试剂盒，提取HCLV株总RNA，紫外分光光度计测定浓度为3.4pg·L^-1，按照10倍浓度梯度稀释至10^-9，用试剂盒提供的一扩混合液和二扩混合液进行套式复合PCR，扩增完毕后电泳观察。结果显示，本发明的试剂盒能检测的极限为3.4×10^-7pg·L^-1，提示本方法灵敏度高(见附图2)。 

③稳定性试验 

本发明提供的诊断试剂盒保存条件为-20℃，每月1次用HCLV、Shimen、SXYL2006及对照进行检测试验，连续检测6个月，检测试剂盒存放的稳定性。结果显示，6个月内试剂盒检测结果完全一致，说明试剂盒有良好的稳定性。 

④田间试验 

采集了陕西省临床疑似猪瘟组织病料116份，用本发明的试剂盒及检测方法进行诊断，同时以RT-nested PCR方法进行平行检测试验。结果本发明的检出阳性率为32％(37/116)，RT-nested PCR方法检出阳性率为28％(33/116)，两种方法符合率96％(112/116)。提示两种方法符合率高，且本发明灵敏度更高(见附图3)。 

本发明将反转录步骤和第一次PCR扩增分开进行，目的是保证反应充分有效，采用套式PCR扩增，且目的片段较小，保证了反应的高灵敏度。检测 总时间控制在4小时左右，达到了快速检测的目的。本发明能彻底解决猪瘟流行毒株和疫苗毒株鉴别诊断问题，快速、灵敏，特异性好，非常适合猪瘟疫情的大面积快速检测普查，适用于各实验室、动物疫病预防控制中心以及条件具备的大中型养殖场。 

附图说明

图1为本发明试剂盒及方法特异性试验电泳图 

图中M为DL2000 DNA分子质量标准，1为HCLV疫苗毒株，2为Shimen毒株，3为SXYL2006毒株，4为GX54毒株，5为SD2002毒株，6为BVDV毒株，7为PRRSV毒株，8为PCV-2毒株，9为PRV毒株，10为PPV毒株。 

图2为本发明试剂盒及方法灵敏度试验电泳图 

图中M为DL2000 DNA分子质量标准，1～9为HCLV株总RNA梯度稀释，浓度范围为3.4×10^-1pg·L^-1～3.4×10^-9pg·L^-1。 

图3为本发明试剂盒及方法对部分临床样品检测结果 

图中M为DL2000 DNA分子质量标准，P1为阳性对照，P2为Shimen毒株，N为阴性对照，1～20为部分组织病料，1、2、5、6、8、13、16、17为检测阴性结果，3、4、7、9、10、11、12、14、15、18、19、20为猪瘟流行毒株感染阳性结果。 

具体实施方式

下面结合具体实施案例对本发明进行详细叙述。 

实施例1 

1.引物的设计与制备 

参考GenBank上公布的30多个CSFV、BVDV全基因组序列，结合本课 题组数年研究测定的CSFV全基因序列，用DNAStar生物软件综合分析比对，筛选出了CSFV疫苗毒株和其他流行毒株以及BVDV的差异位点，针对NS5B基因差异位点设计了5条引物S1、S2、S3、S4和S5，引物S1、S2、S3、S4和S5的序列如下： 

S1：5’-GACACTAGYGCAGGCAAYA-3’ 

S2：5’-AGTGGGTTCCAGGARTAC-3’ 

S3：5’-CCACGGGGGTGCCCTACAA-3’ 

S4：5’-CCTGGCATGTAACTA-3’ 

S5：5’-CTCTCGGTGAGAAATTTG-3’ 

上述引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。 

2.阴、阳性对照的制备 

阴性对照为本实验室培养的正常PK-15细胞上清液，阳性对照为HCLV疫苗株的PK-15细胞培养液。 

3.试剂盒的制备 

本试剂盒由以下组分组成： 

①反转录混合液：由DEPC处理灭菌水、dNTP(2.5m mol·L^-1)、5×AMVBuffer、S2下游引物(25μmol·L^-1)、AMV反转录酶(5U/μL)和HPR I RNA酶抑制剂(40U/μL)组成。每个反应体积比为10∶4∶4∶1∶0.5∶0.5，共计20μL，50个反应共计1000μL，装成1管。 

②一扩混合液：由超纯水、10×PCR Buffer、dNTP(2.5m mol·L^-1)、S1上游引物(25μmol·L^-1)、S2下游引物(25μmol·L^-1)、rTaq DNA聚合酶(5U/μL)组成，每个反应体积比为17∶2.5∶2∶0.5∶0.5∶0.5，共计23μL，50个反应 共计1150μL，装成1管。 

③二扩混合液：由超纯水、10×PCR Buffer、dNTP(2.5m mol·L^-1)、S3上游引物(25μmol·L^-1)、S4下游引物(25μmol·L^-1)、S5下游引物(25μmol·L^-1)、rTaq DNA聚合酶(5U/μL)组成，每个反应体积比为16.5∶2.5∶2∶0.5∶0.5∶0.5，共计23μL，50个反应共计1150μL，装成1管。 

④阴性对照：为正常PK-15细胞培养上清液，每个反应需对照250μL，50个反应共计12500μL，分装10管，每管1250μL。 

⑤阳性对照：为HCLV株PK-15细胞培养液，每个反应需对照250μL，50个反应共计12500μL，分装10管，每管1250μL。 

本发明试剂盒保存条件为-20℃。 

实施例2 

1.引物的设计与制备 

同实施例1。 

2.组织病料样品的处理与RNA提取 

①取疑似猪瘟组织病料3～5g，剪碎成糊状，加5倍无菌PBS，用组织研磨器充分研磨，收集悬液，4℃、12000r/min离心15min，取上清液250μL加入到无菌无RNA酶的EP管，同时做试剂盒中提供的阴、阳性对照，给以上各管中加入750μL TRIzol Reagent，颠倒混匀后于4℃静置5min。 

②加入200μL预冷的氯仿(4℃保存)，充分振荡至乳化均匀，4℃静置15min。 

③于4℃、12000r/min离心15min，取出EP管，轻轻吸取上层水相约450μL转移入另一EP管。 

④加入等体积的冰冷异丙醇(-20℃保存)，颠倒混匀后置-20℃过夜，充分沉淀核酸。 

⑤于4℃、12000r/min离心10min，取出EP管，弃去上清液，加入1mL冰冷的75％乙醇(-20℃保存)，颠倒数次洗涤核酸。 

⑥于4℃、12000r/min离心5min，取出EP管，弃去上清液，倒置EP管干燥核酸。 

3.用本发明试剂盒鉴别检测CSFV 

①吸取反转录混合液20μL，反复吹打离心管管底核酸，充分溶解后瞬间离心，置于42℃水浴反转录90min，取出备用； 

②吸取一扩混合液23μL，加入反转录产物2μL，混合均匀进行PCR扩增，反应条件为95℃预变性5min，94℃45s，54℃50s，72℃50s共进行35个循环，最后72℃延伸10min； 

③吸取二扩混合液23μL，加入一扩产物2μL，混合均匀进行PCR扩增，反应条件为95℃预变性5min，94℃30s，54℃30s，72℃40s共进行35个循环，最后72℃延伸10min；即得到扩增产物。 

实施例3 

1.引物的设计与制备 

同实施例1。 

2.血清样品的处理与RNA提取 

①取分离得到待检猪血清250μL加入到无菌无RNA酶的EP管，同时做试剂盒中提供的阴、阳性对照，给以上各管中加入750μL TRIzol Reagent，颠倒混匀后于4℃静置5min。 

②加入200μL预冷的氯仿(4℃保存)，充分振荡至乳化均匀，4℃静置15min。 

③于4℃、12000r/min离心15min，取出EP管，轻轻吸取上层水相约450μL转移入另一EP管。 

④加入等体积的冰冷异丙醇(-20℃保存)，颠倒混匀后置-20℃过夜，充分沉淀核酸。 

⑤于4℃、12000r/min离心10min，取出EP管，弃去上清液，加入1mL冰冷的75％乙醇(-20℃保存)，颠倒数次洗涤核酸。 

⑥于4℃、12000r/min离心5min，取出EP管，弃去上清液，倒置EP管干燥核酸。 

3.用本发明试剂盒鉴别检测CSFV 

①吸取反转录混合液20μL，反复吹打离心管管底核酸，充分溶解后瞬间离心，置于42℃水浴反转录90min，取出备用； 

②吸取一扩混合液23μL，加入反转录产物2μL，混合均匀进行PCR扩增，反应条件为95℃预变性5min，94℃45s，54℃50s，72℃50s共进行35个循环，最后72℃延伸10min； 

③吸取二扩混合液23μL，加入一扩产物2μL，混合均匀进行PCR扩增，反应条件为95℃预变性5min，94℃30s，54℃30s，72℃40s共进行35个循环，最后72℃延伸10min；即得到扩增产物。 

实施例4 

1.引物的设计与制备 

同实施例1。 

2.全血样品的处理与RNA提取 

①取待检猪全血250μL加入到无菌无RNA酶的EP管，同时做试剂盒中提供的阴、阳性对照，给以上各管中加入750μL TRIzol Reagent，颠倒混匀后于4℃静置5min。 

②加入200μL预冷的氯仿(4℃保存)，充分振荡至乳化均匀，4℃静置15min。 

③于4℃、12000r/min离心15min，取出EP管，轻轻吸取上层水相约450μL转移入另一EP管。 

④加入等体积的冰冷异丙醇(-20℃保存)，颠倒混匀后置-20℃过夜，充分沉淀核酸。 

⑤于4℃、12000r/min离心10min，取出EP管，弃去上清液，加入1mL冰冷的75％乙醇(-20℃保存)，颠倒数次洗涤核酸。 

⑥于4℃、12000r/min离心5min，取出EP管，弃去上清液，倒置EP管干燥核酸。 

3.用本发明试剂盒鉴别检测CSFV 

①吸取反转录混合液20μL，反复吹打离心管管底核酸，充分溶解后瞬间离心，置于42℃水浴反转录90min，取出备用； 

②吸取一扩混合液23μL，加入反转录产物2μL，混合均匀进行PCR扩增，反应条件为95℃预变性5min，94℃45s，54℃50s，72℃50s共进行35个循环，最后72℃延伸10min； 

③吸取二扩混合液23μL，加入一扩产物2μL，混合均匀进行PCR扩增，反应条件为95℃预变性5min，94℃30s，54℃30s，72℃40s共进行35 个循环，最后72℃延伸10min；即得到扩增产物。 

结果判定 

1.称取1.0g琼脂糖，加入100mL 1×TAE缓冲液中，微波炉中加热融化，加入5μL(100mg/mL)溴化乙锭，混匀，倒入水平放置的凝胶盘中，胶板厚度为5mm，待冷却凝固后拔出梳子，将凝胶放入电泳槽中，加入1×TAE缓冲液淹没胶面； 

2.分别取5μL上述实施例2～4所得PCR扩增产物和上样缓冲液混匀，加入加样孔中，同时加5μL DL2000 DNA分子量标准； 

3.电压80V～100V，或电流40mA～50mA，电泳30min； 

4.取出凝胶，置入紫外分析仪中观察，或置入凝胶成像系统中观察照相； 

5.以DL2000 DNA分子质量标准作为参照，阴性对照不出条带，阳性对照出261bp、157bp两个条带，说明对照成立，样品中出现261bp一个条带，即为猪瘟流行毒株感染，样品出261bp、157bp两个条带，即为疫苗毒株。