一种针对整合酶核心区去整合反应的整合酶抑制剂体外筛选方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说是涉及一种针对整合酶核心区去整 合反应的整合酶抑制剂体外筛选方法。

背景技术

整合酶是HIV-1病毒编码的一种蛋白质，在体内通过催化3’加工和链转 移两步反应，介导病毒DNA和宿主细胞基因组的整合，其中，链转移反应是 整合酶催化的关键反应。研究表明，在体外，应用纯化的重组整合酶蛋白、 分别模拟病毒和宿主细胞DNA的寡核苷酸链，能够实现整合过程。据此，可 以开展整合酶抑制剂的体外筛选，目前，已经成功筛选获得了整合酶抑制剂， 且第一个针对整合酶的抗艾滋病药物raltegravir已经于2007年获得美国食品 药品监督管理局(FDA)批准上市。整合酶在体外还能够催化整合过程的逆 反应，即去整合反应，将整合形成的DNA复合物(整合中间体)还原重新生 成病毒DNA和宿主细胞DNA两部分，整合酶的关键结构域——整合酶核心 区，具有独立催化去整合反应的活性。目前，针对HIV-1整合酶核心区去整 合反应的整合酶抑制剂体外筛选方法主要有以下几类：

1、使用放射性同位素标记DNA底物的凝胶电泳和放射自显影方法

Chow等人(Chow SA，Vincent KA，Ellison V，Brown PO.Reversal of  integration and DNA splicing mediated by integrase of human immunodeficiency  virus.Science，1992，255(5045)：723-726.)报道了根据放射性同位素标记DNA 底物的放射自显影方法筛选去整合抑制剂。该方法根据整合反应中病毒DNA 与宿主DNA核苷酸序列，合成4条寡核苷酸链，在其中一条链的末端标记放 射性同位素32P，寡核苷酸链混合后，变性退火形成Y型的去整合DNA底物， 模拟链转移反应形成的整合中间体。去整合反应将整合酶中间体还原为病毒 DNA链和宿主细胞DNA链，反应产物经变性凝胶电泳后，可以通过放射自 显影观察到，根据反应产物片段在凝胶中的片段大小和位置可以对产物和反 应程度定量分析，加入抑制剂后，可通过设置各种对照，计算抑制剂的抑制 效果。基于放射性同位素标记DNA底物的凝胶电泳和放射自显影方法具有结 果直观可靠等优点，被称为黄金标准。该方法主要存在通量低、时间长、操 作繁琐、需特殊设备和专业操作人员，易造成放射性污染等缺点。

2、基于酶联免疫吸附测定法(ELISA)的固相微孔板方法

Gao等人(Gao K，Wang S，Bushman FD.Metal binding by the D，DX35E  motif of human immunodeficiency virus type 1integrase：selective rescue of Cys  substitutions by Mn²⁺in vitro.Journal of Virology，2004，78(13)：6715-6722.)报道 了基于ELISA的固相微孔板方法。使用链霉亲和素包被的微孔板，设计的模 拟整合中间体的DNA底物两端分别使用生物素和地高辛标记，通过生物素- 链霉亲和素特异性反应将DNA底物固定在微孔板中，去整合反应还原生成宿 主DNA时将标记生物素的链合标记地高辛的链共价连接。反应后通过碱变性 即随后的ELISA检测手段，能定量分析反应。通过抑制剂对反应影响情况筛 选去整合抑制剂。该方法操作相对简单，能实现高通量，但包被和封闭微孔 板耗时耗力，且封闭易实效造成高背景信号及低灵敏度。

3、基于磁珠吸附DNA技术和ELISA的液相微孔板方法

He等人(He HQ，Liu B，Zhang XY，Chen WZ，Wang CX.Development of a  high-throughput assay for the HIV-1integrase disintegration reaction.Science  China Life Sciences，2010，53(2)：241-247.)报道了基于磁珠吸附DNA技术结 合ELISA的液相微孔板方法。该方法在基于ELISA的固相微孔板方法的基础 上，使用同样的生物素和地高辛标记的DNA底物，引入链霉亲和素磁珠捕获 生物素DNA底物，再通过ELISA检测地高辛，据此分析去整合反应并开展 整合酶抑制剂筛选。该方法具有固相微孔板方法高通量的优点，且背景信号 低，灵敏度特异性高。但是无论固相和液相微孔板方法还是放射自显影方法， 均需要反应完全完成后进行后续操作检测，步骤繁琐，检测时间长。

发明内容

本发明的目的是提供一种步骤简单、快速便捷且成本低廉的针对整合酶 核心区去整合反应的HIV-1整合酶抑制剂体外筛选方法。

本发明所提供的一种针对整合酶核心区去整合反应的HIV-1整合酶抑制 剂体外筛选方法，包括以下步骤：

(1)整合酶核心区蛋白的制备：

按照文献(He HQ，Liu B，Zhang XY，Chen WZ，Wang CX.Development of a  high-throughput assay for the HIV-1integrase disintegration reaction.Science  China Life Sciences，2010，53(2)：241-247.)所述方法，表达纯化野生型整合酶 核心区蛋白，定量后稀释为3600nmol/L，分装保存待用。

(2)去整合DNA底物的制备

将合成的寡核苷酸链1、2、3、4分别按照等摩尔浓度比例混合，震荡混 匀后用铝箔纸完全封闭避光，置于95℃下孵育5分钟变性，缓慢冷却至室温 退火，稀释为750nmol/L，分装避光保存待用。寡核苷酸序列如下：

寡核苷酸链1：5’-CCTCGAAGTCGACCTGCAGCCCAAGCTTGCGTTGC TGAACGAGG-3’(5’端标记5-羧基荧光素[FAM]，3’端标记4-(4’-二甲基对氨 基偶氮苯)苯甲酸[DABCYL])

寡核苷酸链2：5’-ATGTGGAAAATCTCTAGCAGGCTGCAGGTCGAC-3’

寡核苷酸链3：5’-ACTGCTAGAGGATTTTCCACAT-3’

寡核苷酸链4：5’-CAGCAACGCAAGCTTG-3’

(3)待测化合物样品的制备

室温下将待测化合物样品用二甲亚砜配制成不同浓度的溶液，充分振荡 溶解后备用；

(4)待测化合物样品的筛选

反应体系为50μl/微孔，加入去离子水40μl。微孔板设阴性对照3孔，每 孔分别加入2μl二甲亚砜，其他孔中每孔分别加入2μl不同浓度的待测化合物 样品，设阳性对照3孔，加入的5μl蛋白质样品为高温变性后的整合酶核心 区蛋白，之后所有孔均分别加入5μl整合酶核心区蛋白，振荡器充分混匀后， 在25℃下孵育10～30分钟，加入去整合DNA底物3μl，振荡器充分混匀后， 在37℃下孵育30分钟，用荧光分析仪检测报告基团信号，计算待测样品的抑 制率。

按照以下公式计算待测样品的抑制率：

本发明方法具有以下有益效果：

本发明根据分子信标的原理设计了荧光基团和淬灭基团标记的DNA底 物，整合酶去整合反应对DNA底物的切割连接生成新的DNA产物并使得 DNA产物构象变化，使荧光基团和淬灭基团空间分离，激发发射产生荧光信 号以检测整合酶核心区去整合反应活性，并据此开展针对这一反应活性的整 合酶核心区抑制剂筛选。本发明较之于现有方法，摒弃了放射性同位素，无 环境污染；不需要包被和封闭微孔板等耗时耗力的工作；不需要对产物进行 变性和后续标记检测；能够实现高通量和对反应实时检测。达到了简化步骤、 缩短时间、降低成本等目的。现有方法中放射自显影方法需10小时以上，固 相和液相ELISA也需要3小时左右，而本发明方法所需时间短至1小时以内， 同时大大降低了筛选成本。

附图说明

图1是方法原理示意图；

图2是HIV-1整合酶核心区抑制剂baicalein结构图；

图3是baicalein的抑制曲线(样品孵育时间为10分钟)；

图4是baicalein的抑制曲线(样品孵育时间为20分钟)；

图5是baicalein的抑制曲线(样品孵育时间为30分钟)。

具体实施方式

实施例1

用100μl PBS缓冲液(pH 7.2～7.4，NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L， Na₂HPO₄10mmol/L，KH₂PO₄2mmol/L)洗涤微孔板1次，甩去空中液体 待用；每个微孔中加入去离子水40μl；将已知具有抗HIV-1整合酶核心区去 整合功能的化合物黄芩素(简称baicalein)用二甲基亚砜配制成1.25μmol/L、 2.5μmol/L、7.5μmol/L、12.5μmol/L、25μmol/L、75μmol/L、187.5μmol/L、 375μmol/L、750μmol/L、1250μmol/L、1250μmol/L的溶液，充分震荡溶解 后备用；设阴性对照3孔，每孔分别加入2μl二甲亚砜，其他孔中每孔分别 加入2μl不同浓度的baicalein溶液，设阳性对照3孔，加入的5μl蛋白质样 品为高温变性后的整合酶核心区蛋白，之后所有孔均分别加入5μl整合酶核 心区蛋白(3600nmol/L)，加入去离子水40μl，振荡器充分混匀后，在25℃ 下孵育10分钟，加入去整合DNA底物3μl(750nmol/L)，振荡器充分混匀 后，在37℃下孵育30分钟，用荧光分析仪检测每孔的荧光信号值，选取激发 波长485nm，发射波长535nm，计算待测样品的抑制率，绘制已知曲线(见 图3)。经计算，baicalein的半数抑制浓度为6.25μmol/L。

实施例2

用100μl PBS缓冲液(pH 7.2～7.4，NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L， Na₂HPO₄10mmol/L，KH₂PO₄2mmol/L)洗涤微孔板1次，甩去空中液体 待用；每个微孔中加入去离子水40μl；将已知具有抗HIV-1整合酶核心区去 整合功能的化合物黄芩素(简称baicalein)用二甲基亚砜配制成1.25μmol/L、 2.5μmol/L、7.5μmol/L、12.5μmol/L、25μmol/L、75μmol/L、187.5μmol/L、 375μmol/L、750μmol/L、1250μmol/L、2500μmol/L的溶液，充分震荡溶解 后备用；设阴性对照3孔，每孔分别加入2μl二甲亚砜，其他孔中每孔分别 加入2μl不同浓度的baicalein溶液，设阳性对照3孔，加入的5μl蛋白质样 品为高温变性后的整合酶核心区蛋白，之后所有孔均分别加入5μl整合酶核 心区蛋白(3600nmol/L)，加入去离子水40μl，振荡器充分混匀后，在25℃ 下孵育20分钟，加入去整合DNA底物3μl(750nmol/L)，振荡器充分混匀 后，在37℃下孵育30分钟，用荧光分析仪检测每孔的荧光信号值，选取激发 波长485nm，发射波长535nm，计算待测样品的抑制率，绘制已知曲线(见 图4)。经计算，baicalein的半数抑制浓度为2.78μmol/L。

实施例3

用100μl PBS缓冲液(pH 7.2～7.4，NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L， Na₂HPO₄10mmol/L，KH₂PO₄2mmol/L)洗涤微孔板1次，甩去空中液体 待用；每个微孔中加入去离子水40μl；将已知具有抗HIV-1整合酶核心区去 整合功能的化合物黄芩素(简称baicalein)用二甲基亚砜配制成1.25μmol/L、 2.5μmol/L、7.5μmol/L、12.5μmol/L、25μmol/L、75μmol/L、187.5μmol/L、 375μmol/L、750μmol/L、1250μmol/L、2500μmol/L的溶液，充分震荡溶解 后备用；设阴性对照3孔，每孔分别加入2μl二甲亚砜，其他孔中每孔分别 加入2μl不同浓度的baicalein溶液，设阳性对照3孔，加入的5μl蛋白质样 品为高温变性后的整合酶核心区蛋白，之后所有孔均分别加入5μl整合酶核 心区蛋白(3600nmol/L)，加入去离子水40μl，振荡器充分混匀后，在25℃ 下孵育30分钟，加入去整合DNA底物3μl(750nmol/L)，振荡器充分混匀 后，在37℃下孵育30分钟，用荧光分析仪检测每孔的荧光信号值，选取激发 波长485nm，发射波长535nm，计算待测样品的抑制率，绘制已知曲线(见 图5)。经计算，baicalein的半数抑制浓度为2.21μmol/L。