测定三氮脒颗粒中三氮脒和安替比林含量的方法

技术领域

本发明属于分析化学领域，涉及定量测定制剂中三氮脒和安替比林含量的方法，具体地说是用一种测定三氮脒颗粒剂中三氮脒和安替比林含量的方法。 

背景技术

三氮脒属于芳香双脒类，是传统使用的广谱抗血液原虫药，对家畜梨形虫、锥虫和无形体均有治疗作用，但预防效果较差。芳香双脒类的抗虫作用同干扰虫体的需氧糖酵解和DNA合成有关，这类药物均会引起宿主低血糖。梨形虫和锥虫所进行的需氧糖酵解要依靠宿主的葡萄糖，这类药物的杀锥虫作用取决于它对锥虫需氧糖酵解的抑制作用和核蛋白变性作用。具有治疗作用的三氮脒颗粒剂，里面添加了一定量的安替比林作为解热阵痛的活性物质被国外市场广泛使用，但目前文献记载三氮脒颗粒中检测三氮脒和安替比林的液相方法还很少有报道，国内外药典也没有记载此品种的检测方法。 

发明内容

本发明要解决的技术问题，是针对三氮脒颗粒中添加了安替比林活性物质，中国药典和文献报道中没有其检测方法，在此情况下，提供了一种测定三氮脒颗粒中测定三氮脒和安替比林含量的测定方法，该方法属于高效液相色谱法即HPLC法，具有操作简便、准确、重复性好、专属性强等特点，适用于三氮脒颗粒中测定三氮脒和安替比林含量的测定。 

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是： 

一种测定三氮脒颗粒中三氮脒和安替比林的含量的方法，它属于HPLC法，该方法的色谱条件为： 

（1）用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂Diamonsil C₁₈柱（250mm×4.6mm，5μm）；

（2）流动相体积比为磷酸缓冲盐溶液：甲醇＝27：10；

（3）紫外检测器的检测波长为250nm。

作为本发明的一种限定，所述的磷酸盐缓冲液为磷酸二氢钾或磷酸二氢钠溶液。 

作为上述限定的进一步限定，所述的磷酸盐缓冲液为磷酸二氢钾溶液。 

作为上述限定的再次限定，所述的磷酸二氢钾溶液为1.15%的磷酸二氢钾水溶液。 

作为上述限定的最后限定，所述磷酸二氢钾水溶液用85%磷酸调节pH值至3.0。 

作为本发明的另一种限定，所述该HPLC法的色谱条件为：所用流动相的流速为0.5mL/min，进样体积为20μL，柱温为30℃。 

通过建立的上述方法，用来测定三氮脒颗粒中三氮脒和安替比林的含量，能够达到分析准确的目的。 

由于采用了上述的技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于：采用HPLC法检测三氮脒颗粒中三氮脒和安替比林含量的方法，操作简单，提高了检测的灵敏度和准确度。 

本发明适于对三氮脒颗粒中三氮脒和安替比林的含量进行HPLC法测定。 

附图说明

图1为本发明实施例溶剂干扰性试验的HPLC图； 

图2为本发明实施例空白辅料干扰性试验的HPLC图；

图3为本发明实施例三氮脒对照品HPLC图；

图4为本发明实施例安替比林对照品HPLC图；

图5为本发明实施例三氮脒和安替比林标准品HPLC图；

图6为本发明实施例三氮脒和安替比林样品HPLC图；

图7为本发明实施例对照品进样量5μL线性测定的HPLC图；

图8为本发明实施例对照品进样量10μL线性测定的HPLC图；

图9为本发明实施例对照品进样量15μL线性测定的HPLC图；

图10为本发明实施例对照品进样量20μL线性测定的HPLC图；

图11为本发明实施例对照品进样量25μL线性测定的HPLC图。

本发明下面将结合说明书附图及具体实施例作进一步详细说明。 

具体实施方式

以下实施例用于补充说明本发明，而并非本发明的限定。                           

实施例    一种测定三氮脒颗粒剂中三氮脒和安替比林含量的方法

该方法属于HPLC法，其色谱条件为： 

（1）用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂Diamonsil C₁₈柱（250mm×4.6mm，5μm）；

（2）流动相体积为磷酸缓冲盐溶液：甲醇＝27：10。磷酸盐缓冲液为磷酸二氢钾溶液（也可以用磷酸二氢钠溶液替代），具体为1.15%的磷酸二氢钾水溶液，用85%磷酸调节pH值至3.0；

所用流动相的流速为0.5mL/min，进样体积为20μL，柱温为30℃；

（3）紫外检测器的检测波长为250nm。

一、本发明方法的建立过程：

1、仪器与试剂

仪器：岛津LC-2010A高效液相色谱仪（LC-2010型号检测器，LC-2010型号泵，LC-2010柱温箱，LC-2010自动进样器），LCsolution色谱工作站；

试剂：甲醇（色谱纯），磷酸二氢钾（优级纯），磷酸（优级纯），水（二次去离子水），三氮脒颗粒（样品，河北科星药业有限公司生产），三氮脒对照品（批号：091203，中国药品生物制品检定所，含量为99.6％）；安替比林对照品（批号：100506-200301，中国药品生物制品检定所，含量为99.8%）。

2、含量测定方法的建立 

2.1、波长的选择

根据三氮脒，安替比林紫外光吸收具有的特性，测定了其水溶液在紫外光下的吸收图谱，三氮脒和安替比林在波长为250nm均有很好的吸收，并且相交，因此确定250nm做为其检测波长。

2.2、溶液的配制 

溶剂为流动相。

混合对照品溶液的配制：精密称取三氮脒对照品40.0mg和安替比林对照品55.0mg置于100ml棕色容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀即得对照品溶液M。 

三氮脒对照品溶液制备：精密称取三氮脒对照品40.0mg置于100mL棕色容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀即得溶液A。 

安替比林对照品溶液的制备：精密称取安替比林对照品55.0mg置于100mL棕色容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀即得溶液B。 

样品溶液的配制：精密称取样品适量（约相当于三氮脒40.0mg，安替比林约为55.0mg），置于100mL棕色容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀即得样品溶液D。 

2.3、溶剂、空白辅料的干扰性试验 

为排除色谱图中有溶剂和空白辅料干扰三氮脒和安替比林峰的出现，对单独的溶剂和空白辅料进行专属性试验，以增加检测的准确性。

溶剂的影响：取流动相过滤即得样品1。 

空白辅料的影响：按制剂配方规定的比例，除三氮脒和安替比林外，加入其他辅料制成样品，精密称取此样品0.1g置于100mL棕色容量瓶中用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤即得样品2。 

按照上述色谱条件进样，分别取样品1和样品2各20μL，进样，记录色谱图，如图1和图2所示。 

结果显示：由图1可以看出检测结果接近于基线没有干扰峰出现，表明溶剂对三氮脒和安替比林的测定没有影响。 

由图2可以看出没有干扰峰出现，表明空白辅料对三氮脒和安替比林的测定没有影响。 

按照上述色谱条件进样，分别取2.2项下的溶液A、B、M和溶液D各20μL，进样，记录色谱图，如图3－图6所示。结果显示：由图5和图6可以看出样品图中安替比林和三氮脒主峰保留时间和标准品图中安替比林和三氮脒主峰保留时间一致。 

2.4、样品含量的测定 

将配制好的对照品溶液M，取20μL进样，取三批样品，依照上述2.2方法制备样品溶液，每批样品做2个平行，各取20μL进样，并记录各主峰面积并按外标法计算三氮脒和安替比林的含量，结果如表1所示，根据试验测定结果，确定三氮脒和安替比林的含量为标示量的90.0%-110.0%。

2.5、方法的专属性 

由于三氮脒本身的特性于对空气中的氧气、光和热比较敏感，在操作的过程中会发生降解，避免降解产物对色谱峰的干扰，现进行破坏性试验下的分离，验证检测方法。

破坏性试验下的分离：取本含量测定所需的供试品5组，每组3个平行，分别置于酸性环境（0.1mol/L的盐酸溶液）、碱性环境（0.1mol/L的氢氧化钠溶液）、氧化环境（5%双氧水）、热环境（60℃）和光环境（4000LμX）的条件下，破坏3h，取破坏后的样品各20μL，进样。 

实验结果表明，本制剂在上述破坏性条件下均有降解产物生成，但是降解产物与主峰均能够达到较好的分离效果，且降解产物峰之间也可以有较好的分离效果。 

2.6、线性关系及范围的考察 

取对照品溶液M 5μL、10μL、15μL、20μL和25μL 按照上述色谱条件注入液相色谱仪，并记录色谱图：上述不同进样量的对照品溶液的HPLC图分别如图7-11所示。计算浓度与峰面积之间的线性关系，得回归曲线与回归方程，并以峰面积（Ａ）对进样量（C）进行线性回归，得三氮脒标准线性方程为：A＝1909043C+449493；r＝0.9991，结果表明三氮脒在2.3μg-11.6μg范围内，线性关系良好；同法得安替比林标准线性方程为：

A＝4670297C-250541，r＝0.9999，结果表明安替比林在3.0μg-14.9μg范围内线性关系良好，对照品线性范围测定结果如表2所示。

2.7、检测线及定量限的确定 

将对照品溶液逐级稀释，进样，记录峰高，当峰高为基线噪声的10倍高时的浓度时三氮脒定量限浓度为0.10μg/mL；安替比林定量限浓度为0.15μg/mL。当峰高为基线噪声2-3倍高时的浓度时三氮脒的检测限浓度为0.03μg/mL；安替比林的检测线浓度为0.05μg/mL。

2.8、精密度试验的考察 

取5份对照品溶液M各20μL，按照上述色谱条件连续进样5次，并计算该方法的精密度。测试结果如表3所示，测得三氮脒和安替比林的相对标准偏差RSD﹤2%，表明本方法的精密度良好。

2.9、稳定性试验 

取对照品溶液M和样品溶液D分别放置0h、2h、4h、6h和8h后进样测定，每个时间段分别连续进样3次，实验结果如表4所示，并计算得出三氮脒和安替比林峰面积的相对标准偏差RSD﹤2%，说明供试品溶液在8h内稳定。

2.10、重复性试验 

精密称取同一批号三氮脒颗粒样品5份，测定其含量，结果三氮脒和安替比林平均含量为96.0%、102.1%，结果如表5所示，相对标准偏差RSD＜2%。说明方法的重复性良好。

2.11、添加空白辅料的回收率的考察 

供试品溶液：精密量取空白辅料1ml共9份，分别置于100mL棕色容量瓶中，分为3组，每组3份，每组分别加入三氮脒对照品32mg，40mg，48mg，（约相当于三氮脒标示量的80%，100%，120%）和安替比林对照品44mg，55mg，66mg(约相当于安替比林标示量的80%，100%，120%），用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

对照品溶液：精密称取三氮脒对照品40mg和安替比林对照品55mg置于100mL的棕色容量瓶中用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。 

照上述方法，测定三氮脒和安替比林的含量，按下式计算回收率，结果如表6所示，表明三氮脒平均加样回收率为99.5%（n=9），RSD为0.49%；安替比林平均加样回收率为100.0%，RSD为0.49%，说明其回收率合格。 

三氮脒的回收率（%）=

  安替比林的回收率（%）=

 2.12、不添加空白辅料的回收率的考察

供试品溶液：将供试品分为3组，每组3份，每组分别加入三氮脒对照品32mg，40mg，48mg（约相当于三氮脒标示量的80%，100%，120%）和安替比林对照品44mg，55mg，66mg(约相当于安替比林标示量的80%，100%，120%）用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

对照品溶液：精密称取三氮脒对照品40mg和安替比林对照品55mg置于100mL的棕色容量瓶中用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。 

照上述方法，测定三氮脒和安替比林的含量，计算回收率，结果如表7所示，表明三氮脒平均回收率为100.1%（n=9），RSD的平均值为0.60% ；安替比林平均回收率为100.6%，RSD的平均值为0.49%，实验结果表明其回收率合格。 

二、实测

按照以下检测方法对4批三氮脒颗粒中三氮脒和安替比林进行含量测定。利用Diamonsil C₁₈柱（250mm×4.6mm，5μm）；1.15%的磷酸二氢钾溶液675mL与250mL甲醇混匀，用85%磷酸调节pH值至3.0为流动相；检测波长为250nm；流速为0.5ml/min，柱温30℃，进样量20μL，理论塔板数按三氮脒峰计算不小于1500，主峰与杂质峰的分离度符合要求，拖尾因子不大于1.5。

对照品溶液的配制：精密称取三氮脒对照品40.0mg和安替比林对照品55.0mg至100mL容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀即得对照品溶液M1。 

样品溶液的配制：精密称取样品适量（约相当于三氮脒40.0mg和安替比林55mg）至100mL容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀即得样品溶液D1。 

在本发明的色谱条件下，取上述样品溶液和对照品溶液各20μL，进样，记录色谱图主峰面积，以外标法按峰面积计算三氮脒和安替比林的含量。三氮脒主峰保留时间为7min，安替比林主峰的保留时间为26min。含量测定结果见下表：