一种基于拉曼光谱检测人乳腺癌细胞MCF-7的细胞探针复合物及其制备方法

技术领域

本发明属于细胞检测技术领域，具体而言，涉及一种利用表面增强拉曼信号检测人乳腺癌MCF-7细胞的细胞探针复合物及其制备方法。

背景技术

癌症是导致人类死亡的一种重要原因，据世界卫生组织统计，每年约有700万人死于各类癌症疾病。在女性当中，乳腺癌是一种发病率最高的癌症疾病，且近年来乳腺癌的发病率呈明显上升趋势，2008年全球乳腺癌的发病率高达41.4%。乳腺癌的早期诊断和治疗对于降低乳腺癌死亡率，提高疾病患者5年存活率具有极其重要的意义。

癌症是一种控制细胞生长增殖机制失常而引起的疾病，其发生与发展与细胞的状态密切相关。在各类癌症疾病中，癌细胞的生长与分裂速度远远超过正常细胞，还会局部侵入周遭正常组织，甚至经由体内循环系统或淋巴系统转移到身体其他部分。因此，发展一种可靠的、灵敏的检测人乳腺癌细胞的方法对于实现乳腺癌的早期诊断、筛查、治疗及预后意义重大。

在当前的乳腺癌医学诊断方法中，影像技术是一种最为常见的有效方法。但是影像技术也有其明显的不足，如难以分辨一些病理性特征相同或相近的癌细胞，难以灵敏的检测到癌症早期癌细胞水平较低时的癌变细胞等。而提高检测的特异性及灵敏度对于癌症的早期诊断治疗作用重大，因此越来越多的工作倾向于从单细胞、单分子水平上对癌细胞进行检测。

目前对单细胞研究的技术主要包括荧光光谱技术、扫描探针显微技术、微流控技术、毛细管电泳技术等, 但大多数技术存在侵入性, 会对细胞产生破坏。光学技术具有无侵入、无电离辐射、允许多种模式成像、可获得实时与定量等多种信息的特点, 在生命科学研究中占有越来越重要的地位。目前已经在生物医学领域中得到应用的光谱技术主要有紫外可见吸收光谱、红外光谱、荧光光谱、拉曼光谱等。拉曼光谱与其它光谱相比具有一些突出的优点，如稳定性高、不易猝灭、可用红光激发、对生物样品损坏小、不受生物样品自身荧光及水的干扰等, 因而尤其适合于细胞样品的研究。

提高拉曼光谱方法的靶向性对于提高检测的特异性和灵敏度十分重要。癌细胞的细胞膜表面通常具有一些与正常细胞不具有的蛋白或者糖基，常用的标志物包括表皮生长因子受体、磷酸酶及叶酸受体等。适体（aptamer）是用配体指数富集法系统演化（SELEX）技术从人工体外合成的随机寡核苷酸序列库中反复筛选得到的能以极高的亲和力和特异性与靶分子结合的一段寡核苷酸序列，可以与蛋白质甚至整个细胞发生特异性结合作用。将这些癌细胞标志物的核酸适体进行表面增强拉曼的功能化并与癌细胞相互作用，可实现基于表面增强拉曼光谱的高灵敏度、高特异性的癌细胞靶向检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种拉曼光谱检测人乳腺癌细胞MCF-7的细胞探针复合物及其制备方法，通过开发一种功能化的乳腺癌细胞适体-纳米复合材料（Au-Ag-aptamer），并基于所述纳米复合材料制成细胞探针复合物（Rh 6G-Au-Ag-aptamer），由于纳米复合材料具有强的表面拉曼增强作用，适体和细胞表面标志物间的强的专一性作用，细胞探针复合物对人乳腺癌细胞MCF-7有高度的选择性，可用于基于表面增强拉曼信号的乳腺癌细胞MCF-7的高灵敏度、高特异性检测。

完成上述发明任务的技术方案是：

一种基于拉曼光谱检测人乳腺癌细胞MCF-7的细胞探针复合物（Rh 6G-Au-Ag-aptamer），其特征在于，所述的探针复合物以核酸适体（S2.2，序列为 5’–GCA GTT GAT CCT TTG GAT ACC CTG G–3’）为模板，其碱基上沉积金/银双金属合金纳米粒子，纳米粒子表面固载拉曼信号分子罗丹明6G。

所述的细胞探针复合物Rh 6G-Au-Ag-aptamer其粒径约为20 ～120nm。

所述的细胞探针复合物Rh 6G-Au-Ag-aptamer按以下方法合成：

将核酸适体S2.2溶解在磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH 7.4）中，加入一定体积比的NaAuCl₄和AgNO₃溶液（体积比1~5：1），混合并搅拌均匀，在暗处放置12小时以上，置于紫外灯下光照5 min至60 min，形成Au-Ag-aptamer纳米复合物；将罗丹明6G（Rh 6G）溶液加入到Au-Ag-aptamer纳米复合物分散液中，避光搅拌后离心处理，用PBS洗涤除去未吸附的Rh 6G分子，得到所述的探针复合物（标记为Rh 6G-Au-Ag-aptamer）。

所述的Rh 6G-Au-Ag-aptamer纳米探针复合材料的制备方法具体包括以下步骤：

1）将核酸适体（S2.2，序列为 5’–GCA GTT GAT CCT TTG GAT ACC CTG G–3’）用0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）溶解，浓度为300 ng/mL；

2）将一定量的NaAuCl₄ （1mmol/L）和AgNO₃（1mmol/L）溶液按一定体积比混合（体积比1~5：1），将混合液加入到1）所述的核酸适体溶液中，在4℃下连续搅拌0.5–2小时，并在暗处避光保存12h以上，使Au³⁺和Ag⁺吸附到核酸适体的碱基上得到Au³⁺-Ag⁺-aptamer复合物；

3）将Au³⁺-Ag⁺-aptamer复合物在波数为254 nm的紫外灯下光照5min-60min，溶液颜色由无色逐渐变为蓝色，得到Au-Ag-aptamer纳米复合物；

4）将Rh 6G溶液加入到Au-Ag-aptamer纳米复合物分散液中，控制Rh 6G的最终浓度为1μmol/L的，在4℃下避光搅拌1h，离心处理后（转速为10000 转/分，时间10 min），用0.1 mol/L PBS溶液（pH 7.4）洗涤去除未吸附的Rh 6G分子，得到Rh 6G-Au-Ag-aptamer探针复合物。

所述的步骤2）中，混合后核酸适体溶液中Ag⁺与核酸适体碱基的物质量比优选为1:5。

本发明利用光催化的方法对人乳腺癌MCF-7细胞适体进行功能化，在适体核酸链上合成金和银的双金属合金纳米粒子（Au-Ag NPs），并修饰上拉曼信号分子Rh 6G制备得到MCF-7细胞拉曼光谱检测的分子探针，利用适体与MCF-7细胞的特异性靶向结合能力及适体表面的金/银双金属合金纳米粒子对Rh 6G分子拉曼信号的增强作用，可用于对MCF-7细胞的有效检测。

核酸适体S2.2与MCF-7细胞具有特异性靶向结合能力，有关核酸适体S2.2可参见.C. Yu,Y.Hu,J. H. Duan, W. Yuan, C. Tang, H. Y. Xu, X. D. Yang, Plos One, 2011, 6, e24077。

所述的探针复合物具有高度的与人乳腺癌细胞MCF-7的靶向结合能力，及高的表面增强拉曼活性。该探针复合物的表面增强拉曼光谱上存在罗丹明分子的特征吸收峰。

可按以下所述的方法，将Rh 6G-Au-Ag-aptamer探针复合物与MCF-7细胞作用并进行增强拉曼光谱检测：

1) 人乳腺癌细胞MCF-7的培养：将MCF-7细胞贴壁生长于DMEM（Dulbecco’s modified Eagle medium）培养液中，其中含牛胚胎血清10%（v/v）、青霉素100 U/mL、链霉素100 μg/mL，在37oC、5%的培养箱中培养。观察细胞生长，当细胞长到90%左右使进行传代。传代时，去除培养液，用PBS溶液洗涤3次，加入1 mL 0.25%的胰蛋白酶37 oC恒温消化3min，取适量细胞悬液加入新培养基中继续培养，隔天换液，用细胞计数器控制细胞个数在1×10⁵个/mL,除去培养液，用PBS溶液洗涤3次后，细胞待用。

2)将所述Rh 6G-Au-Ag-aptamer探针复合物在PBS溶液中（pH 7.4）中分散浓度为0.1mg/mL，取100 μL加入到1）中所述的细胞中，在室温下孵育30 min，依次用3 mL PBS溶液洗涤细胞3-5次，去除未和细胞作用的探针复合物。

3）在所述步骤2）中的细胞中，加入1 mL 0.25%的胰蛋白酶，室温下消化3 min，在1000 转/分下离心10 min，去除上清液，加入1 mL PBS，使其形成均匀的细胞悬液，取10 μL该细胞悬液将其滴涂到新鲜制备的云母片表面，避光保存，采用表面增强拉曼光谱技术检测MCF-7细胞，检测波长为785 nm，检测波数范围为400-4000 cm^-1，采集时间为10 s。

按照以上方法制得的Rh 6G-Au-Ag-aptamer复合物在透射电镜图上典型情况下呈DNA链状分布，与细胞作用后，对细胞的表面进行表面增强拉曼光谱检测，图谱上出现明显的信号分子Rh 6G的特征拉曼信号峰。

本发明具有以下优点：本发明的基于表面增强拉曼信号的人乳腺癌MCF-7细胞的探针复合物Rh 6G-Au-Ag-aptamer纳米复合物对MCF-7细胞有高的特异性识别能力和拉曼信号增强能力，通过对拉曼信号的监测可实现对MCF-7癌细胞的检测。该细胞探针及其检测方法具有特异性强、灵敏度高等特点，在生理学、病理学、临床学的研究中具有重要意义。

附图说明

图1  Au-Ag-aptamer纳米复合物的透射电镜图。

图2  Rh 6G-Au-Ag-aptamer复合物探针与MCF-7细胞作用后，细胞表面的透射电镜图。

图 3 基于探针复合物表面增强拉曼信号的人乳腺癌MCF-7细胞的拉曼光谱图。

具体实施方式

实施例1

将核酸适体（S2.2，序列为 5’–GCA GTT GAT CCT TTG GAT ACC CTG G–3’）用0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）溶解，浓度为300 ng/mL；将1mol/L的NaAuCl₄和1mol/L AgNO₃溶液按体积比为1:1混合均匀后，加入到核酸适体溶液中，该混合液中Au³⁺、Ag⁺及碱基的物质量比为1:1:5，将该混合液在4℃下连续搅拌0.5–2小时，并在暗处避光保存12h，将其转移至1cm×1cm的石英比色皿中，在波数为254 nm的紫外灯下光照30min，得到Au-Ag-aptamer纳米复合物；配置0.1 mol/L的Rh 6G甲醇溶液，并将其加入到Au-Ag-aptamer纳米复合物分散液中，控制Rh 6G的最终浓度为1μmol/L的，在4℃下避光搅拌1h，以10000 转/分的转速离心10 min，用0.1 mol/L PBS溶液（pH 7.4）洗涤沉淀共3遍，去除未吸附的Rh 6G分子，得到Rh 6G-Au-Ag-aptamer探针复合物，TEM照片显示所得的复合物呈链状分布，粒径均一，约为20 nm。

实施例2

将核酸适体（S2.2，序列为 5’–GCA GTT GAT CCT TTG GAT ACC CTG G–3’）用0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）溶解，浓度为300 ng/mL；将1mol/L的NaAuCl₄和1mol/L AgNO₃溶液按体积比为2:1混合均匀后，加入到核酸适体溶液中，该混合液中Au³⁺、Ag⁺及碱基的物质量比为2:1:5，将该混合液在4℃下连续搅拌0.5–2小时，并在暗处避光保存12h，将其转移至1cm×1cm的石英比色皿中，在波数为254 nm的紫外灯下光照30min，得到Au-Ag-aptamer纳米复合物；配置0.1 mol/L的Rh 6G甲醇溶液，并将其加入到Au-Ag-aptamer纳米复合物分散液中，控制Rh 6G的最终浓度为1μmol/L的，在4℃下避光搅拌1h，以10000 转/分的转速离心10 min，用0.1 mol/L PBS溶液（pH 7.4）洗涤沉淀共3遍，去除未吸附的Rh 6G分子，得到Rh 6G-Au-Ag-aptamer探针复合物，TEM照片显示所得的复合物呈链状分布，粒径均一，约为40 nm。

实施例3

将核酸适体（S2.2，序列为 5’–GCA GTT GAT CCT TTG GAT ACC CTG G–3’）用0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）溶解，浓度为300 ng/mL；将1mol/L的NaAuCl₄和1mol/L AgNO₃溶液按体积比为4:1混合均匀后，加入到核酸适体溶液中，该混合液中Au³⁺、Ag⁺及碱基的物质量比为4:1:5，将该混合液在4 ℃下连续搅拌0.5–2小时，并在暗处避光保存12h，将其转移至1cm×1cm的石英比色皿中，在波数为254 nm的紫外灯下光照30min，得到Au-Ag-aptamer纳米复合物；配置0.1 mol/L的Rh 6G甲醇溶液，并将其加入到Au-Ag-aptamer纳米复合物分散液中，控制Rh 6G的最终浓度为1μmol/L的，在4℃下避光搅拌1h，以10000 转/分的转速离心10 min，用0.1 mol/L PBS溶液（pH 7.4）洗涤沉淀共3遍，去除未吸附的Rh 6G分子，得到Rh 6G-Au-Ag-aptamer探针复合物，TEM照片显示所得的化合物呈链状分布，粒径均一，约为100 nm。

实施例4

实施例4中，除在紫外灯下光照时间为5 min，其他操作均与实例3相同，TEM照片上显示出有极少量颗粒状物质存在。

实施例5

实施例5中，除在紫外灯下光照时间为15 min，其他操作均与实例3相同，TEM照片上显示出有少量颗粒状物质存在，未呈链状分布。

实施例6

实施例6中，在紫外灯下光照时间为60 min，其他操作均与实例3相同，化合物出现聚沉现象，TEM照片显示所得的化合物呈树枝状。

实施例7

将实施例3制备的Rh 6G-Au-Ag-aptamer探针复合物与MCF-7细胞作用，利用表面增强拉曼光谱技术检测MCF-7细胞。

首先培养MCF-7细胞：将MCF-7细胞贴壁生长于DMEM（Dulbecco’s modified Eagle medium）培养液中，其中含牛胚胎血清10%（v/v）、青霉素100 U/mL、链霉素100 μg/mL，在37℃、5%的培养箱中培养。观察细胞生长，当细胞长到90%左右使进行传代。传代时，去除培养液，用PBS溶液洗涤3次，加入1 mL 0.25%的胰蛋白酶37℃恒温消化3min，取适量细胞悬液加入新培养基中继续培养，隔天换液，用细胞计数器控制细胞个数在1×10⁵个/mL，除去培养液，用PBS溶液洗涤3次后，细胞待用。

将实施例3中所制得的Rh 6G-Au-Ag-aptamer探针复合物在PBS溶液中（pH 7.4）中分散，浓度为0.1mg/mL，取100 μL分散液加入到1×10⁵个MCF-7细胞中，在室温下孵育30 min，用吸管吸去未和细胞作用的探针复合物，并用3 mL PBS溶液洗涤细胞3-5次。

将和探针复合物作用后的细胞用1 mL 0.25%的胰蛋白酶在室温下消化3 min，以 1000 转/分离心10 min后，去除上清液，再加入1 mL PBS溶液，使其形成均匀的细胞悬液，取10 μL该细胞悬液将其滴涂到新鲜制备的云母片表面，采用表面增强拉曼光谱技术检测MCF-7细胞，检测波长为785 nm，波数范围400-4000 cm^-1，采集时间为10 s。实验结果表明，MCF-7细胞的拉曼光谱图上出现到明显的拉曼信号分子Rh 6G的拉曼峰。

实施例8

将实施例1、2制备得到的Rh 6G-Au-Ag-aptamer探针复合物在与实施例7相同的条件下与MCF-7细胞作用，利用表面增强拉曼光谱技术检测MCF-7细胞。实验结果表明它们拉曼光谱图上也能够得到特征峰位置相似、但强度较为弱的Rh 6G的拉曼信号。

SEQUENCE LISTING

<110>  南京师范大学

<120>  一种基于拉曼光谱检测人乳腺癌细胞MCF-7的细胞探针复合物及其制备方法

<130> 

<160>  1    

<170>  PatentIn version 3.3

<210>  1

<211>  25

<212>  DNA

<213>  Artificial

<220>

<223>  用配体指数富集法系统演化（SELEX）技术从人工体外合成,与MCF-7细胞具

       有特异性结合能力

<400>  1

gcagttgatc ctttggatac cctgg                                           25