一种食品中双酚A和双酚AF的快速检测方法

技术领域

本发明涉及一种食品中双酚A和双酚AF的快速检测方法，属于分析化学技术领域，更具体的是采用液液分散微萃取-高效液相色谱法对塑料包装食品中双酚A和双酚AF进行测定。

背景技术

双酚A，（Bisphenol A，简称BPA）一种化工原料，能大大加强环氧树脂、聚碳酸酯和不饱和聚酯树脂等高分子材料的透明性和耐用性。广泛用于包装材料、橡胶防老材料、农药和婴儿用品等的生产中，而且其在生产和使用过程中大量流入环境。双酚A具有雌激素的作用，能干扰正常激素在机体内的产生、释放、运输和代谢的作用，能导致内分泌紊乱，诱发早熟、肥胖、生殖等健康问题，甚至能大大增加患前列腺癌及乳腺癌的风险，胎儿更易受其影响而致畸。另外，其物理和化学性质较为稳定，难以降解，一旦摄取难以在体内代谢。随着不良事件的发生，如“含双酚A的婴儿奶瓶”事件，其安全性问题成为国内外关注的焦点。同样，双酚AF（BPAF）可以诱导前列腺细胞增殖，也可促进人乳腺癌细胞MCF-7的增殖，Coleman等人已经证实双酚AF同样可以与雌激素受体结合，产生类雌激素效应。然而，市面上普通食品中双酚A和AF含量较低（通常在30～100 μg/(Kg或L)范围内），并且这些产品还存在很多其他物质，这给双酚A 和AF 的分析测定带来了的困难，因此建立高灵敏度、快速、高选择性和准确的双酚A 和AF的测定方法具有重要的现实意义。

双酚A结构式如下：

   双酚AF结构式如下：

目前国内外文献报道双酚A 和AF检测方法主要有色谱法、电化学法、荧光法、化学发光法、免疫分析法及联机技术法等，其中电化学法、荧光法、化学发光法和免疫分析法操作繁琐耗时、成本高、回收率较低及人为因素影响较大，而且检测限较高，如CN 101533014 A报道采用免疫法测定双酚A的最低检出限高达5 mg/Kg，以上方法主要是因为没有对样品进行前处理富集，而且样品双酚A的含量较低，检测准确度不足，检测限较高。色谱法及联机技术能准确定量和定性，然而样品成分复杂，含量较低，必须经前处理富集才能进入色谱柱和质谱仪进行定量和定性，因此前处理是样品分析最重要的环节，它决定了检测方法的灵敏度和可行性。相关文献报道了双酚A 和AF的样品前处理技术多采用固相萃取（SPE）和浊点萃取法（CPE）等方法，其中SPE技术以效率高，稳定可靠及溶液用量少等优势成为双酚A 和AF分析的主要处理方法，但SPE技术也存在萃取柱造价高，操作耗时；而CPE技术同样具有快速高效的优点，但相关的文献报道较少，一些关键的技术还在研究当中。

液液分散微萃取（DLLME）技术具有操作简单、快速、费用低、对环境友好、回收率和富集倍数高、检测限低等优点，得到广泛应用，文献报道应用DLLME技术处理的样品大多数为简单基质（如水样等），而选离子液体做萃取剂结合超声和温控萃取对食品的测定鲜有报道。 

发明内容

本发明提供一种食品中双酚A和双酚AF的快速检测方法，样品前处理采用离子液体（1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐）做萃取剂，Triton X-100或丙酮为分散剂进行液液分散微萃取，方法中首先对样品进行预处理，然后将萃取剂和分散剂加入经预处理的样品中，混匀，超声乳化萃取，离心，分离下层液滴，按前述方法对上层液再萃取一次，合并两次萃取液滴后进行HPLC分析。本发明具有快速、灵敏和简单及检测成本低等优点，可用于食品中双酚A 和AF的快速检测。 

本发明是通过如下具体技术方案实现本发明目的：

（1）        样品预处理：

A、固体样品：10.0～15.0 g固态食品中加入40～50 mL乙醇溶液（80～90%，V/V），超声提取40～45 min（超声频率为110～120 KHz），提取液减压浓缩至干，加入10.0～15.0 g蒸馏水，混匀，2500～4000 rpm离心5～10 min后取上清液调pH至6.0～7.0，再于1500～2000 rpm离心3～5 min除去其中的悬浮物，取上清液备用；

B、液体样品：取10.0～15.0 g液体样品在2500～4000 rpm离心5～10 min，离心后取上清液调节pH为6.0～7.0，再于1500～2000 rpm离心3～5 min，取上清液备用； 

（2） 10～50 μL萃取剂与500～1000 μL分散剂混合后快速注入预处理的样品中，混匀，在超声频率为60～90 KHz，温度为65～75 ℃的条件下超声乳化3～10 min，冷却至室温，1500～4000 rpm离心5～10 min，分离出下层萃取液滴，再按以上萃取方法重复萃取一次，合并两次萃取得到的下层液滴，备用； 

（3）配制一系列双酚A和AF混合标准溶液，在一定的色谱条件下，进行HPLC分析，测定

峰面积与双酚A和AF的线性范围、回收率、标准偏差和检测限及工作曲线的线性回归方程，

HPLC分析条件如下：流动相为乙腈和水的混合液，乙腈和水的混合比例为40：60～55：45，

流速为0.8～1.0 mL/min，柱温为25～40 ℃，检测波长为230 nm，检测时间为8～10 min；

（4）取步骤（2）下层萃取液滴进行HPLC分析，根据双酚A和AF标准溶液的线性回归方

程，计算分析得到食品中双酚A和AF的含量，并计算回收率，其中HPLC分析条件如下：流动相为乙腈和水的混合液，乙腈和水的混合比例为40：60～55：45（V/V），流速为0.8～1.0 mL/min，柱温为25～40 ℃，检测波长为230nm，检测时间为8～10 min。

本发明相对现有技术，具有如下显著优点：

（1）    本发明直接萃取富集样品，无交叉污染，减少待测物的损失量，检测成本低，对环境

友好，富集后的萃取物可直接用HPLC分析测定，快速、准确率高；

（2）        本发明方法经分散液液微萃取后，所得富集因子较大，均在70倍以上；检测方法简单、易操作，检出限较低，能灵敏，快速的检测到食品中的双酚A和AF；

（3）        本发明选用离子液体（1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐）作为绿色萃取剂，65～75 ℃超声处理3～10 min（超声频率为60～90 KHz），能大大提高萃取效率；

（4）本发明方法使用范围广，适用于检测用塑料包装的食品，如酸醋、食用油、黄酒、白酒、饼干、酸角糖和泡鸡脚等包装食品。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步详细说明，通过加标实验验证本发明方法的有效性及回收率，结果见表1-7，但本发明的保护范围不局限于所述内容。

实施例1：食用醋酸中双酚A和双酚AF的快速检测方法，具体步骤如下：

（1）取10.0 g食用酸醋在2500 rpm转速下离心5 min，取上层清液调pH为6.0，此时样品中出现少量悬浮物，于1500 rpm离心3 min，将上层清液注入萃取装置中，备用；

（2） 20 μL 1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐和500 μL Triton X-100混合后快速注入经预处理样液中，摇匀，75 ℃水浴5 min，75 ℃超声3 min（超声频率为60 KHz），冷却至室温，4000 rpm离心5 min，取下层萃取液滴。按以上萃取方法进行二次萃取，合并两次萃取得到的下层液滴，注入HPLC进行分离分析，流动相为乙腈和水（45:55，V/V），流速为1.0 mL/min，色谱柱为C₁₈（150 mm×4.6 mm，5 μm），柱温为25 ℃，检测波长为230 nm，检测时间为10 min，加标结果见表1，富集倍数为85 %。

表1：样品检出限，精密度和加标回收率结果

实施例2：食用油中双酚A和双酚AF的快速检测方法，具体步骤如下： 

（1）取10.0 g食用油在3000 rpm离心7 min，离心后取上清液调pH为7.0，再于1600 rpm离心4 min，备用； 

（2）15 μL萃取剂（1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐）和500 μL分散液丙酮混合后快速注入食用油样液中，摇匀，75 ℃水浴5 min，75 ℃超声5 min（超声频率为70 KHz），冷却至室温，4000 rpm离心5 min，取下层萃取液滴。按以上萃取方法进行二次萃取，合并两次萃取得到的下层液滴，注入HPLC进行分离分析，流动相为乙腈和水（40:60，V/V），流速为1.0 mL/min，色谱柱为C₁₈（150 mm×4.6 mm，5 μm），柱温为30 ℃，检测波长为230 nm，检测时间为10 min，加标结果见表2，富集倍数为80 %。

表2：样品检出限，精密度和加标回收率结果

实施例3：黄酒中双酚A和双酚AF的快速检测方法，具体操作如下：

（1）15.0 g黄酒[乙醇含量低于6 %（V/V）]离心8 min（3000 rpm），除去样品中的悬浮物，取上清液调pH为6.0，离心3min（2000 rpm），以除去加酸产生的悬浮物，取上层清液注入萃取装置中，备用；

（2）10 μL萃取剂（1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐）和500 μL分散液（丙酮）混合后快速注入预处理样品中，摇匀，70℃水浴5 min， 70℃超声8 min（超声频率为70 KHz），冷却至室温，1500 rpm离心10 min，取下层萃取液滴，按以上萃取方法进行二次萃取，合并两次萃取液滴，注入HPLC进行分离分析，流动相为乙腈和水（55:45，V/V），流速为0.8 mL/min，色谱柱为C₁₈（150 mm×4.6 mm，5 μm），柱温为40 ℃，检测波长为230 nm，检测时间为10 min，加标结果见表3，富集倍数为76 %。

表3：样品检出限，精密度和加标回收率结果

实施例4：白酒中双酚A和双酚AF的快速检测方法，具体操作如下：

（1）取15.0 g白酒[浓香型，乙醇含量为50 %（V/V）]，在4000 rpm离心5min，离心后取上清液调pH为6.0，再于1500 rpm离心5 min，备用；

（2）15 μL萃取剂（1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐）和500 μL分散液（Triton X-100）混合后快速注入预处理样品中，摇匀，70℃水浴5 min， 70℃超声8 min（超声频率为70 KHz），冷却至室温，2000 rpm离心6min，取下层萃取液滴。按以上萃取方法进行二次萃取，合并两次萃取液滴，注入HPLC进行分离分析，流动相为乙腈和水（55:45，V/V），流速为0.8 mL/min，色谱柱为C₁₈（150 mm×4.6 mm，5 μm），柱温为40 ℃，检测波长为230 nm，检测时间为10 min，加标结果见表4，富集倍数为80 %。

表4：样品检出限，精密度和加标回收率结果

实施例 5：饼干中双酚A和双酚AF的快速检测方法，具体步骤如下：

（1）准确称取10.0g研细的饼干样品，加入40 mL乙醇溶液（80 %，V/V），室温超声提取45 min（超声频率为110 KHz），减压浓缩提取液至干，加入10.0 g水，混匀，3000 rpm离心5min后取上清液调pH至6.0，再于1500 rpm离心5 min，取上清液备用；

（2） 10 μL萃取剂（1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐）与500 μL分散液（Triton X-100）混合后快速注入预处理样品中，摇匀，65℃水浴5 min， 65℃超声10 min（超声频率为90 KHz），冷却至室温，2000 rpm离心7 min，取下层萃取液滴；按以上萃取方法进行二次萃取，合并两次萃取液滴，注入HPLC进行分离分析，流动相为乙腈和水（50:50，V/V），流速为1.0 mL/min，色谱柱为C₁₈（150 mm×4.6 mm，5 μm），柱温为30℃，检测波长为230 nm，检测时间为10 min，加标结果见表5，富集倍数为75 %。

表5：样品检出限，精密度和加标回收率结果

实施例 6：酸角糖中双酚A和双酚AF的快速检测方法，具体操作如下：

（1）酸角糖碾细，准确称取15.0g样品，加入45 mL乙醇溶液（90 %，V/V），室温、超声提取40 min（超声频率为120 KHz），减压浓缩提取液至干，加入15.0 g水，混匀，在4000rpm离心5min除去悬浮物，调上清液pH为7.0， 2000 rpm离心3 min，取上清液备用；

（2）50 μL萃取剂（1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐）和1000 μL分散液（Triton X-100）混合后快速注入预处理样品中，摇匀，75 ℃水浴5 min，75 ℃超声3min（超声频率为90 KHz），冷却至室温，3500rpm离心6 min，取下层萃取液滴；按以上萃取方法进行二次萃取，合并两次萃取液滴，注入HPLC进行分离分析，流动相为乙腈和水（45:55，V/V），流速为1.0 mL/min，色谱柱为C₁₈（150 mm×4.6 mm，5 μm），柱温为30℃，检测波长为230 nm，检测时间为10 min，加标结果见表6，富集倍数为83 %。

表6：样品检出限，精密度和加标回收率结果

实施例 7：泡鸡脚中双酚A和双酚AF的快速检测方法，具体操作如下：

（1）用组织捣碎机将泡鸡脚搅细，准确称取10.0g样品，加入50 mL乙醇溶液（85%，V/V），室温超声提取45 min（超声频率为115 KHz），减压浓缩提取液至干，加入10.0 g水，混匀，2500rpm离心10min除去悬浮物，上清液调pH为7.0，再于1800 rpm离心4min，取上清液备用；

（2）20 μL萃取剂（1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐）和600 μL分散液（Triton X-100）混合后快速注入预处理样品中，摇匀，70 ℃水浴5 min， 70 ℃超声6 min（超声频率为80 KHz），冷却至室温，3000rpm离心5 min，取下层萃取液滴。按以上萃取方法进行二次萃取，合并两次萃取液滴，注入HPLC进行分离分析，流动相为乙腈和水（45:55，V/V），流速为1.0 mL/min，色谱柱为C₁₈（150 mm×4.6 mm，5 μm），柱温为30℃，检测波长为230 nm，检测时间为10 min，加标结果见表1，富集倍数为70 %。

本发明利用DLLME对几种食品进行了前处理，具有较高的富集倍数（70～80 %），该方法可行性较强，重现性高，操作简单。本方法具有较好的发展前景，检出限，精密度和加标回收率如下表7： 

表7：样品检出限，精密度和加标回收率结果