透明质酸一步法化学发光定量检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种一步法进行人血清、体液或组织匀浆中透明质酸 (Hyaluronic Acid，简称HA)含量检测的化学发光试剂盒。属于免疫分析医学 范畴。

背景技术

近年来的临床医学陆续发现透明质酸含量变化与肿瘤的生长、浸润和扩散 密切相关，尤其发现检测血清HA对诊断肿瘤有一定价值，可作为区分良、恶性 肿瘤的一个重要指标。它还有助于肝病的诊断和鉴别诊断、病情判断和预后评 估，还是抗纤维化药物治疗的一个非常重要的动态观察手段。

目前，HA的检测方法主要以放射免疫方法为主，文献CN1047391A公开 了一种放射免疫方法检测透明质酸(H A)含量的方法。它将碘标记的HA (¹²⁵I-HA)与未知量标本中的H A共同竞争加入的透明质酸结合蛋白(HAB P)，再用第一抗体、第二抗体将结合复合物沉淀下来，测其放射性计数，通过 标准品的浓度-计数关系计算出拟合方程，根据样本放射性计数反推出其中的HA 含量来。这是一种比较灵敏、准确的透明质酸检测方法。但是上述方法也存在 一定的缺陷：一、加样步骤繁琐。整个实验包括三步加样和离心等过程，反应 的总计时间达到2个多小时；二、试剂盒操作自动化程度低，试剂盒的有效期 也很短。只有30-45天；三、使用¹²⁵I作为标记物，对环境产生放射性污染，对 操作人员健康有潜在危害。

同样，在市场上也有一部分的HA化学放光和酶联检测试剂，据了解，它们 大多数都是采用三步法反应模式，免疫反应的时间一般都要1.5-2个小时左右， 可以说操作起来都比较繁琐。究其原因在于这些试剂盒都借助了HA与HABP之 间的结合反应，而HABP是一个成分和结构比较复杂的蛋白，提纯工艺复杂，纯 度也不会太高，且其与HA的结合力没有像抗原和抗体的结合力那么强，所以， 一、不能用它直接包被，干扰因素比较多，造成试剂的重复性差。二、不能用 它直接标记，HABP某些活性基团极易失活，造成试剂的稳定性差。

本发明从根本上解决了透明质酸试剂盒不能一步法检测的难题，可以让操 作更方便，让检测更准确。其反应原理为：预先在固相载体(例如96孔微孔板) 上包被HA，再依次加入校准品或样品和HA酶结合物，反应过程中固相包被HA 与样本中的HA共同与限量的HABP-anti-HABP-HRP进行竞争性结合反应，经过 一定的反应温度和反应时间，经洗涤除去某些游离成分，最终在固相板上形成 HABP-anti-HABP-HRP的复合物。校准品或样本中的HA含量越高，在包被板上形 成的复合物就越少。测定时，先洗去包被板中的液体，再加入发光底物液A和B， 发光底物液中的化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化，形成一个激发 态的中间体，当这种激发态中间体回到稳定的基态时，会释放等能级的光子， 对光子进行测定从而实现定量分析。

本试剂盒的突出技术优势具体在于：

(1)采用化学发光定量测定方法，充实了透明质酸的免疫检测手段，进一步 突出了方法学具有的灵敏度高，特异性强，精密度好，线性范围宽，试剂稳定 性好等优点。本发明试剂盒所有组分从缓冲液到原材料再到制备条件均经过了 最优化筛选与配比，大大提高了试剂盒的的灵敏度，特异性，检测范围和准确 性。试剂盒的底物系统使用鲁米诺(Luminol)/过氧化氢/辣根过氧化物酶(HRP) /对碘苯酚(p-iodophenol)底物发光系统，其在精心配比的Tris-HCL缓冲液 中延长了底物系统发光持续时间，1小时内对样品的测定值变化在10％以内，大 大提高了测定结果的稳定性。

同时，本试剂盒适用于开放式化学发光检测仪器，更有利于其进一步推广 和应用。

(2)液体试剂可直接使用，无需提前配制；可拆卸板条最大满足实验设计要求。

(3)一步法反应，操作极为简单，只需向微孔中连续加入校准品或样本及HA 酶结合物，反应1小时即可。

(4)间接法形成酶结合物，从根本上解决辣根过氧化物酶直接标记HABP存在 的不稳定、易失活的问题，试剂盒的稳定性大大改善，有效期可以达到6个月， 而且测定结果的重复性也明显提高。

(5)采用LogX-(1-B/B₀)拟合方法进行数据处理，避免个别低值血样发光值 偏出标准曲线范围，无法计算的弊病。

本试剂盒在具备了灵敏度高，测值准确，重复性好，试剂稳定，有效期长， 等技术优势的基础上，科学性、创新性地解决了HA酶促法(化学发光和酶联法) 试剂普遍存在的技术难题，大大简化了操作步骤，令其独特品质在国内的HA非 放试剂中名列前茅。

发明内容

一种一步法进行人血清、体液或组织匀浆中透明质酸(Hyaluronic Acid，简 称HA)含量检测的化学发光试剂盒。

本发明所提供的检测透明质酸的化学发光试剂盒包括：1)HA校准品2) HA包被板3)HA酶结合物4)化学发光底物液A和化学发光底物液B。

上述本发明的试剂盒中，所述的HA校准品内含有经准确定值的HA抗原。

上述本发明的试剂盒中，所述的HA包被板上包被有与牛血清白蛋白(BSA) 偶联的HA(HA-BSA)。

上述本发明的试剂盒中，所述的用于HA包被板的HA-BSA其制备方法如下： 准确称取5mg HA抗原，溶解于2ml 0.1mol/L pH 5.6磷酸盐缓冲液(PB)加 10mg牛血清白蛋白，溶解后加5mg  1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚 胺(EDC)4℃反应17-20小时，装入透析袋于1000ml 0.01mol/L pH7.4PB 中透析，换液4次，取出冻存于-15℃以下备用。

上述本发明的试剂盒中，所述的HA酶结合物是由透明质酸结合蛋白(HABP) 和辣根过氧化物酶(HRP)标记的HABP抗体分别按体积比1∶2000和1∶6500 稀释到酶稀释液中(含50mmol/L PB，0.25％BSA，10％丙三醇)，经过4℃20小时 二者充分反应后配制而成。

上述本发明的试剂盒中，所述的HA酶结合物中HABP的制备方法如下：取新 鲜牛鼻软骨，洗净后切成小块，加入4mol/L盐酸胍，制成均浆，4℃提取30小 时，抽提液13000g离心1小时，上清液对水透析，冷冻干燥后即得HABP粗品， HABP粗品1.6g，溶于25ml 0.1mol/L Tris-HCl(pH 7.3)中，加入5mg胰蛋 白酶，于37℃温育2小时，加入1mg大豆胰蛋白酶拟制因子，在上述HABP粗品 酶解液中，加入38g盐酸胍，用0.5mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液补足体积至50ml， 与亲和层析凝胶混合，置于透析袋中，对蒸馏水透析，4℃过夜，透析后将凝胶 装柱，依次用1mol/L和3mol/L的氯化钠(NaCl)梯度洗脱未吸附物及杂蛋白， 然后用4mol/L盐酸胍洗脱，分步收集洗脱液，各组份分别取少量与碘标记HA (¹²⁵I-HA)反应，合并与¹²⁵I-HA有结合的组份，对水透析后，用PEG20000进行 浓缩成3mg/ml，冻存于-15℃以下保存。

上述本发明的试剂盒中，所述的HA酶结合物中HABP抗体的制备方法如下： 采用常规免疫法将HABP按照0.5mg/kg的免疫剂量融合完全佐剂多点注射到大 耳白实验用兔子的背部皮下，间隔15天后相同方法、相同免疫剂量注射HABP 融合的不完全佐剂，共免疫5次，颈动脉取血，分离出血清，测定血清滴度， 硫酸铵2次分级沉淀得到兔IgG，透析于2000ml 50mmol/L pH7.4PB缓冲液中 过夜，透析4次后取出，冻存于-15℃以下备用。

上述本发明的试剂盒中，所述的HA酶结合物中酶标记HABP抗体的制备方 法如下：采用改良高碘酸钠氧化法将HABP抗体与辣根过氧化物酶(HRP)联结： 称取5mg HRP溶解于1ml蒸馏水中，加入0.2ml新配的0.1mol/L高碘酸钠(NaIO 4)溶液，室温下避光搅拌20分钟，将上述溶液装入透析袋中，对1mmol/L pH4.4 的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜，加20μl 0.2mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液， 使以上醛化HRP的pH升高到9.0～9.5，然后立即加入10mg HABP抗体在1ml 0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时，加0.1ml新配的4mg/ml硼 氢化钠(NaBH₄)液，混匀，再置4℃2小时，将上述液装入透析袋中，对0.15 mol/L pH7.4PB透析，4℃过夜。

上述本发明的试剂盒中，所述的化学发光底物液A的制备方法为：6mmol/L 过氧化氢，50mmol/L pH7.1Tris-HCL缓冲液；化学发光底物液B的制备方法 为：4mmol/L Luminol，1.2mmol/L p-iodophenol，50mmol/L pH8.6Tris-HCl 缓冲液。

上述本发明的试剂盒中，所述的数据拟合方法为以校准品的标示浓度的Log 值为横坐标，以(1-B/B₀)值为纵坐标的数学拟合方程。

上述本发明的试剂盒中，所述的HA校准品和HA酶结合物的加样量均为50 μl，一步法，反应时间为1小时。

上述本发明的试剂盒中，所述的与HA偶联的BSA可以被其它蛋白或多肽替 代；微孔板可以被其它适宜包被的材料，如塑料试管、塑料珠等替代；用于标 记的辣根过氧化物酶可以被碱性磷酸酶或其它荧光物质、化学发光标记物替代， 并用相应的仪器进行检测。

附图说明

附图1为本发明检测方法的流程图

附图2：本发明与北方所放射免疫试剂盒测值相关性比较图

具体实施方式

实施例1：制备本发明的透明质酸一步法化学发光定量检测试剂盒

一、HA校准品的制备。

1、50mmol/L pH7.4磷酸盐缓冲液(PB)：

Na₂HPO₄·12H₂O 14.5克

NaH₂PO₄·2H₂O  1.48克

溶解于1000ml去离子水中，测其pH值为7.4。

标准品稀释液中加5％小牛血清。

2、将HA浓抗原准确稀释成25，50，100，200，400，800ng/ml几个浓度， S0为校准品稀释液，共7瓶。

二、HA包被板的制备

缓冲液1：包被液

50mmol/L pH7.4PB

缓冲液2：封闭液

50mmol/L pH7.4PB

10％蔗糖

0.5％BSA

0.1％防腐剂。

包被板的制备：将HA-BSA按比例稀释到50mmol/L pH7.4PB包被液，100 μl/孔加到微孔板中，2～8℃放置过夜，扣干。加入封闭液150μl/孔，2～8℃ 放置过夜，弃去封闭液，扣干，待其自然干燥后，用铝箔袋真空密封后备用。

三、浓缩洗涤液的制备。

配方为：

15％NaCl

1％吐温(Tween 20)

50mmol/L pH7.4磷酸盐缓冲液

混合均匀，分别按20ml/瓶分装，2-8℃储存。

实施例2：本发明的透明质酸一步法化学发光定量检测试剂盒的操作方法。

以上实施例1制备的透明质酸一步法化学发光定量检测试剂盒的具体操作方法 为：

a.向微孔板各孔中加入50μl HA校准品或待测样本。

b.向微孔板各孔中加入50μl HA酶结合物。

c.将微孔板放置振荡器上，室温振荡反应60分钟。

d.弃去微孔板内液体，每孔加入洗涤液，静置30秒钟后吸干或甩干。如此反 复洗涤5次。结束后在纸上将微孔板扣干。

e.每孔各加入50μl(1滴)底物液A和底物液B，加样完毕后将微孔板震荡混 合。

f.在室温(14～28℃)环境下避光反应10分钟后在微孔发光仪上测量各孔发 光值。

实施例3本发明透明质酸一步法化学发光定量检测试剂盒的方法学鉴定 按照本领域常规制造及检定规程对实施例1中制备的试剂盒进行检定，结果见

表1。

表1试剂盒的方法学鉴定结果

说明本发明试剂盒的准确性，特异性，精密性，灵敏度和稳定性是完全合格的。

实施例4本发明透明质酸一步法化学发光定量检测试剂盒正常值的确定。

正常参考值指正常人(或动物)的某种生理常数，由于个体差异使这些生 理常数有一定的波动范围，因此一般采用正常参考值范围的概念。即要保证大 多数正常的观察值都在该范围内，习惯上可包括正常人的80％、90％、95％、99％ 等，最常用的是95％。就是说，如果正常百分界限采用95％，则在正常参考值范 围之外尚有5％。在确定正常值时，首先要保证样本的数量足够大(一般n≥100)， 在数据处理时则可近似用样本均数X和样本标准差S代替总体均数和总体标准 差来计算正常值范围。本试剂盒随机取350份健康体检人血清，用实施例1制 备的透明质酸一步法化学发光定量检测试剂盒进行检测，统计求得350份样品 的平均值av，标准偏差SD，同时以平均值加2倍SD作为正常值的上限。如下 表2所示。

表2试剂盒正常值结果

结果表明，本发明试剂盒的正常值的上限为小于等于100.0ng/ml。

实施例5本发明透明质酸一步法化学发光定量检测试剂盒北方所放射免疫试 剂盒临床检测结果一致性的比较。

使用实施例1制备的透明质酸一步法化学发光定量检测试剂盒和北京北方生 物技术研究所生产的透明质酸放射免疫分析药盒(批准文号为：国药准字 S20083010)测定160例临床样品，其中阳性病例达到10％以上。严格按试剂盒 说明书操作，对检验的结果进行t测验，相关系数r分析和四格表统计分析。 结果见表3。

表3本发明试剂盒与放免试剂盒测值结果一致性比较结果

综上所述，本发明试剂盒与放免试剂盒的测定结果具有很高的一致性。说明 两种方法具有同等的使用价值。