一种马尾松根际解磷真菌泡盛曲霉及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种马尾松根际解磷真菌泡盛曲霉 （Aspergillus awamori）及其应用。

背景技术

解磷微生物（phosphate-solubilizing microorganisms，PSMs）是土壤中能够 将难溶磷转化成植物能够吸收利用的可溶性磷的一类特殊的微生物功能类群，包 括解磷真菌、解磷细菌和解磷放线菌等。解磷真菌(Solubilizing phosphorus fungus) 虽然在数量和种类上都少于解磷细菌，但有研究表明解磷真菌的溶磷能力一般要 强于细菌，有时甚至是细菌的几十倍，而且遗传性状更加稳定。迄今为止，发现 的解磷微生物主要是集中在农作物和土壤中，少量报道有来自林地或牧草等生态 系统。且目前对解磷微生物的研究主要是集中在解磷细菌方面，对于解磷细菌的 分布、解磷能力以及解磷机制等都已较为清楚。而解磷真菌研究较少。

马尾松作为森林演替的先锋树种，是我国南方最具代表性的森林类型之一， 同时也是我国南方森林系统结构中面积最大的退化类型。造成这种现象的主要诱 因是土壤地力衰退。在马尾松林地衰退的过程中，磷素的供应不足是突出而具普 遍性的问题。在林业方面，磷对苗木质量影响较大，尤其是针叶树种更加明显。 磷有利于植物从营养生长顺利的转入生殖生长，促进繁殖器官的形成，可以提早 开花结实。磷有效地促进根系的发育，增强苗木根的吸收能力，加速苗木的生长， 并在一定程度上提高苗木的抗逆性及抗病性。解磷微生物不仅能改善植物磷素营 养，还能促进土壤中有益微生物的代谢活动，显著改善植物根部营养，达到增产 效果。利用微生物来提高土壤固态磷的利用率，无疑是行之有效的方法。目前， 如何利用解磷微生物开发和利用被土壤固定的磷素是我国农林业生产中急需解 决的问题，也是国内外土壤肥料及植物营养学界研究的热点之一。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供马尾松根际解 磷真菌泡盛曲霉JP-NJ1，其具有较强的解磷能力。本发明的另一目的是提供一 种马尾松根际解磷真菌泡盛曲霉JP-NJ1在促进马尾松生长中的应用。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种马尾松根际解磷真菌泡盛曲霉，其分类命名为泡盛曲霉（Aspergillus  awamori）JP-NJ1，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO： M2012166，保藏日期为：2012年5月14日，保藏地址为：中国武汉武汉大学。

泡盛曲霉JP-NJ1，是从南京林业大学校内的30-40年生马尾松的根际土壤中 筛选获得的。

JP-NJ1的生物学特征：如图1所示，菌落在PDA培养基上生长迅速，25℃ 培养7天直径在65mm左右，菌落呈黑色，菌落具有辐射状沟纹，质地丝绒状； 菌落反面稍微呈现淡黄色。分生孢子器幼时多呈辐射状，直径70-150um,老时疏 松，直径约为300-500um；分生孢子结构大量产生，在菌落中间位置最为密集， 呈黑褐色。分生孢子梗发生于基质，孢子梗约600-800um×10um，老时带淡褐 色，全部表面可育；产孢子结构双层，分生孢子球形或近球形，直径3.5-5um, 壁平滑。

如图2所示，该菌株在NBRIP培养基上，生长较缓慢，25℃培养7天，直 径35-40mm之间，溶磷圈直径46-65mm之间，质地丝绒状，菌丝较稀疏，分生 孢子产生较少，菌落中间最为密集，呈黑色。菌落反面无色，溶磷圈大而透明。

JP-NJ1菌株18SrDNA ITS序列，见SEQ ID NO.1所示。将序列与GenBank 数据库中的序列进行BLAST比对。结果表明，JP-NJ1菌株与Aspergillus awamori 的相似度为99%。结合形态特征和18SrDNA ITS序列分析，鉴定为泡盛曲霉 （Aspergillus awamori）。

上述的泡盛曲霉JP-NJ1对磷酸三钙具有很强的解磷能力，在促进马尾松苗 生长中有很好的应用。JP-NJ1菌剂盆栽接种试验表明，该菌剂可以明显的促进 马尾松苗的生长。

有益效果：本发明的泡盛曲霉JP-NJ1具有的优势包括：对难溶性的无机磷 酸盐磷酸三钙具有很强的溶解能力；通过盆栽试验证实菌剂接种马尾松苗可以明 显的促进马尾松的生长。因此，本发明的泡盛曲霉JP-NJ1能为开发微生物菌肥 提供优良的菌株资源，并具有良好的应用开发前景。

附图说明

图1是泡盛曲霉JP-NJ1菌株在PDA培养基上的菌落特征；

图2是泡盛曲霉JP-NJ1菌株在NBRIP培养基上的溶磷圈；其中，左图为背 面，右图为正面；

图3是泡盛曲霉JP-NJ1菌株在摇瓶中培养时解磷能力和pH值的动态变化结 果图；

图4是泡盛曲霉JP-NJ1菌株对马尾松苗生长的影响结果图；

图5是泡盛曲霉JP-NJ1菌株制成的菌剂对马尾松生长的影响的结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

以下实例中，PDA培养基的配方为：马铃薯20g，蔗糖20g，琼脂18g，蒸 馏水1000mL。磷酸盐生长培养基（NBRIP）的配方为：葡萄糖10g，Ca₃(PO₄)₂ 5g， MgCl₂.6H₂O 5g，KCl 0.2g，MgSO₄.7H₂O 0.25g，(NH₄)₂SO₄ 0.1g，蒸馏水1000mL， pH7.0。

实施例1

马尾松根际解磷真菌泡盛曲霉（Aspergillus awamori）JP-NJ1，是从南京林 业大学校内的30-40年生马尾松的根际土壤中筛选获得。如图1所示，菌落在 PDA培养基上生长迅速，25℃培养7天直径在65mm左右，菌落呈黑色，菌落 具有辐射状沟纹，质地丝绒状；菌落反面稍微呈现淡黄色。分生孢子器幼时多呈 辐射状，直径70-150um,老时疏松，直径约为300-500um；分生孢子结构大量产 生，在菌落中间位置最为密集，呈黑褐色。分生孢子梗发生于基质，孢子梗约 600-800um×10um，老时带淡褐色，全部表面可育；产孢子结构双层，分生孢子 球形或近球形，直径3.5-5um,壁平滑。

如图2所示，该菌株在NBRIP培养基上，生长较缓慢，25℃培养7d，直径 35-40mm之间，溶磷圈直径46-65mm之间，质地丝绒状，菌丝较稀疏，分生孢 子产生较少，菌落中间最为密集，呈黑色。菌落反面无色，溶磷圈大而透明。

实施例2

将泡盛曲霉JP-NJ1接种到NBRIP平板上，25℃培养，7～10d后，观察是否 仍有溶菌圈，测定菌落（D）和溶菌圈（d）的直径，并计算溶菌圈直径与菌落 直径的比值（d/D），可以初步的估计解磷真菌的解磷能力。一般比值越大，说明 真菌的解磷能力越强。依据表1，解磷能力为“++”的认为其解磷能力较强。按 上述方法测定泡盛曲霉JP-NJ1的d/D的值，结果测得比值为1.44，说明JP-NJ1 菌株具有很强的解磷能力。

表1  解磷真菌解磷能力分级标准

实施例3

将泡盛曲霉JP-NJ1菌株接种到PDA平板上，培养10d，活化后，在平板打 取菌块（直径60mm）接种到装有50mLNBRIP液体培养基的100mL的三角瓶 中，以未接菌的空白NBRIP培养基为对照（CK），每瓶均接种6各相同体积大 小的菌块，每个待测菌株设三个重复，25℃，200r·min^-1振荡培养，7d后，将 发酵液离心10min(4℃，10000r·min^-1)，采用钼锑抗比色法，即取上述离心得到 的上清液100uL加入50mL的容量瓶中，然后加入约25mL的去离子水后，再加 1~2滴2,4-二硝基酚指示剂，再加5mL钼锑抗显色剂，再加去离子水定容，混匀， 静置0.5h之后，测定OD值。并计算上清液中的有效磷含量和解磷率。结果如 表2所示。其中，解磷率（%）=（接菌可溶性磷含量－对照可溶性磷含量）÷ 加入磷酸三钙的量×100。

表2  解磷真菌泡盛曲霉JP-NJ1的解磷能力

注：P<0.05。

实施例4

在NBRIP上先活化JP-NJ1菌株，然后在PDA上活化2次，待JP-NJ1菌株 在PDA上生长7d后，用灭菌的打孔器在培养基上打取直径为6mm的菌块，接 种于含有50mL的NBRIP培养基100mL的三角瓶中，25℃，200r.min^-1振荡培养， 每个菌株做7个重复，以空白培养基作为对照。每隔24h，取发酵液，将发酵液 离心10min(4℃,10000r.min^-1),取离心得到的上清液100uL加入50mL的容量瓶 中，然后加入约25mL的去离子水后，再加1～2滴2，4-二硝基酚指示剂，再加 5ml钼锑抗显色剂，再加去离子水定容，混匀，静置半小时之后，测定OD值。 然后根据磷标准曲线换算菌株的解磷能力。每隔24h，取发酵液，直接用pH计 （Basic ph Meter PB-10）测定发酵液的PH值。

结果如图3所示，JP-NJ1菌株经过连续8d的解磷能力的动态测定，发现该 菌株在第2～6d的溶磷量逐渐升高，在第6d时达到最大值，为1363.57mg/L， 此后溶磷量出现逐渐下降趋势。在动态发酵过程中，还可以明显看出JP-NJ1菌 株随着溶磷量的提高，其发酵液的PH值有明显的下降趋势，在第7d的时候达 到最低值2.36，以后有稍微回升，但是仍保持在低PH水平。

实施例5

在NBRIP上先活化JP-NJ1菌株，然后在PDA上活化2次后，用打孔器在 培养基上打取直径为6mm的菌块，接种于含有50mL的PD培养基100mL的三 角瓶中，25℃，200r.min^-1振荡培养7d。发酵液（4℃，6000r.min^-1）离心5min， 菌丝体用磁力搅拌器打碎后，用无菌生理盐水调节菌悬液（7～8×10⁸cfu.mL^-1） 制成菌剂。离心后的上清液收集到无菌三角瓶中待用。

接种试验分为四种处理，每种处理均施入15mL对应物，A：菌悬液，B： 发酵液离心后得到的上清液，C：空白的培养基（PD），D：无菌生理盐水（CK）。 每个处理20个重复，接种后菌苗置于温室（20℃）统一管理，适时浇水。

待接种处理的马尾松苗生长150d后，进行植株苗高、地径、植株鲜重和根 重等的测定。

结果如图4和表3所示，JP-NJ1菌株无论是菌悬液还是发酵上清液都对马 尾松苗有明显的促生作用(p<0.05)。JP-NJ1菌株制成的菌剂对马尾松苗生长的促 进作用尤为显著，苗高和地径分别比CK增长了19.36%和27.83%，鲜重和根重 分别比CK增长了104.13%和153.12%。

表3  解磷真菌泡盛曲霉JP-NJ1对马尾松生长的影响

SEQUENCE LISTING

<110>  南京林业大学

<120>  一种马尾松根际解磷真菌泡盛曲霉及其应用

<130>  100

<160>  1    

<170>  PatentIn version 3.3

<210>  1

<211>  590

<212>  DNA

<213>  Aspergillus awamori

<400>  1

cctgcggaag gatcattacc gagtgcgggt cctttgggcc caacctccca tccgtgtcta     60

ttgtaccctg ttgcttcggc gggcccgccg cttgtcggcc gccggggggg cgcctctgcc    120

ccccgggccc gtgcccgccg gagaccccaa cacgaacact gtctgaaagc gtgcagtctg    180

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