一种酪啡肽、抗菌肽、糖巨肽和酪蛋白磷酸肽的联产工艺

技术领域

本发明属于化学技术领域，涉及一种酪啡肽、抗菌肽、糖巨肽和酪蛋白磷酸肽的联产工 艺，具体涉及一种将酪蛋白分步骤连续酶解制备酪啡肽、抗菌肽、糖巨肽和酪蛋白磷酸肽的 方法。

背景技术

乳是哺乳动物乳腺的分泌产物，是一种营养十分丰富的生物液体。乳的营养价值，对人 类和动物生长调节与免疫保护中的独特功能以及各成分之间的合适比例，是新生哺乳动物最 好的营养素。乳脂、乳糖和乳蛋白是乳的基本成份，牛乳中蛋白质含量约为3.3％～3.5％，人 乳中为1.4％。乳蛋白是一类营养全价的蛋白质，它种类多，含量丰富，分布广泛。乳蛋白 主要有酪蛋白(casein，CN)和乳清蛋白(wheyprotein)两大类，以及含量相对较少的乳脂 肪球膜蛋白(MFGMP)。酪蛋白是乳腺上皮细胞合成的一组含有大量磷和钙的蛋白质。在 pH为4.6，温度为20℃的条件下，即可从脱脂乳中沉淀得到酪蛋白。

酪蛋白是乳含量最丰富的蛋白质，占乳蛋白的76％～86％，含有人体生长发育所必须的 氨基酸。酪蛋白作为一种重要的营养物质，有着广泛的用途，如用于酪蛋白活性肽的制备， 食品的增稠剂和乳化剂等。目前为止，人们已从酪蛋白酶解物中发现了多种具有生物活性的 功能肽，如酪蛋白抗菌肽、酪蛋白磷酸肽、酪蛋白糖巨肽和酪蛋白酪啡肽等等。但在目前报 道中，都以某一功能肽为目标进行制备生产，没有关于分步骤联产4种活性肽的报道，对原 料和能源造成极大的浪费。

自1966年Katzir等人从凝乳酶酶解酪蛋白酶解产物中发现具有抗菌特性的物质以来， 酪蛋白活性肽活性肽日趋成为乳品领域的研究热点进展极为迅速。迄今为止，人们已经中发 现了数十种具有重要生理功能的酪蛋白生物活性肽，它们具有广泛而重要的生物学机能和机 体调节功能。目前的专利报道中，湖北武汉的邹远东报道了“用复合蛋白酶酶解酪蛋白制得 酪蛋白磷酸肽(CPPs)的制备方法和用途”的专利；日本卡尔皮斯株式会社山本直之等人报 道了“酪蛋白水解物及其生产过程与应用”，该专利涉及发明了一种含有在体内具有最低 酶分解性的游离氨基酸及体内非分解性的肽的酪蛋白水解物，预计它能够在活体内表现出诸 如降血压作用等功能；浙江工业大学的孟祥河等人发明了“一种酪蛋白糖巨肽的制备方法”； 但目前并没有联产4种酪蛋白活性肽研究的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服上述技术缺陷，提供一种酪啡肽、抗菌肽、糖巨肽和酪蛋白磷酸 肽的联产工艺，本发明所联产的4种活性肽，其中酪蛋白抗菌肽具有抗病毒、抗感染、抗寄 生虫、抗肿瘤等功能；酪蛋白磷酸肽(CPPs)具有促进钙铁锌等矿物元素的吸收、抗龋齿、 促进动物体外受精和增强机体免疫力等功能；酪蛋白酪啡肽具有镇静止痛、安眠和延迟胃排 空时间，抑制肠道运转消化物等生理作用；酪蛋白糖巨肽(CGMP)具有对益生菌的增殖作 用、免疫调节作用和抑制病毒和细菌等附着的作用。其技术方案为：

一种酪啡肽、抗菌肽、糖巨肽和酪蛋白磷酸肽的联产工艺，包括以下步骤：1)酪蛋白 抗菌肽的制备：在97份100mg/mL酪蛋白溶液中加入3份100mg/mL胰蛋白酶溶液，调节 酶解液pH为8.5，55℃恒温水解2.5h，之后使用分子量为3000和10000的超滤膜对水解液 进行超滤，收集分子量3000-10000的酶水解液冷冻干燥即得到酪蛋白抗菌肽；

2)酪蛋白磷酸肽(CPPs)的制备：取步骤1)中剩余的酶水解液继续水解1h，在4℃ 条件下，10000r/min离心20min除去未水解的大分子物质和溶液中的杂质，沉淀收集备用， 向上清液中加入10％(v/v)CaCl₂和无水乙醇，使两者在溶液中的终浓度分别为1％和50％， 上清液室温放置过夜，在4℃条件下，10000r/min离心20min，收集沉淀，用无水乙醇经过3 次洗涤沉淀，最终沉淀即是酪蛋白磷酸肽(CPPs)；

3)酪蛋白糖巨肽和酪蛋白酪啡肽的制备：取步骤1)和步骤2)中剩余的酶水解残留物 质，调节pH至1.6使沉淀溶解，配制成为10mg/ml溶液，按照胃蛋白酶与酶解液质量比1∶100 在温度55℃、pH值为1.6条件下水解2h，调节水解液pH为4.6，4℃条件下，10000r/min 离心20min，取上清液备用，回调pH到7.0，此时水解液中酪蛋白糖巨肽以多倍体存在，其 分子量为20000～40000之间，而酪蛋白酪啡肽分子量小于1000，使用分子量为1000的超滤 膜对上清液进行超滤分离，酪蛋白糖巨肽位于分子量大于1000的组分中，而酪蛋白酪啡肽 位于分子量小于1000的组分中，分别冷冻干燥两种组分。

步骤1)中以大肠杆菌为指示菌，测出其抑菌圈大小为19.43mm，得率为18.831mg/g。

步骤2)CPPs得率为11.41mg/g，氮磷比为10.27。

步骤3)中水解液中酪蛋白糖巨肽唾液酸回收率为40.13％，得率为1.693mg/g。β-酪啡 肽-5含量0.0297mg/mg，得率为0.1257mg/g，β-酪啡肽-7含量0.03054mg/mg，得率为 0.1292mg/g。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明一种酪啡肽、抗菌肽、糖巨肽和酪蛋白磷酸肽的联产工艺，充分利用了酪蛋白酶 和胃蛋白酶不同酶解条件，以及水解目的产物分子量不同的特点，分布水解得到抗菌肽、酪 蛋白磷酸肽、酪蛋白糖巨肽和酪蛋白酪啡肽。各种功能肽的产率均较高，且各种性质和生物 活性具有重现性和稳定性，弥补了已有生产工艺单一的不足。

附图说明

图1是蛋白抗菌肽在以大肠杆菌为指示菌株产生的抑菌圈；

图2是酪蛋白酪啡肽β-酪啡肽-5和β-酪啡肽-7的色谱图；

图3是酪蛋白抗菌肽抑菌图；

图4是验证实验酪蛋白抗菌肽抑菌图；

图5是酪蛋白酪啡肽色谱图；

图6是验证实验酪蛋白酪啡肽色谱图。

具体实施方式

下面结合附图与具体实施方式对本发明的制备方法作进一步详细地说明。

实施例1

1)酪蛋白抗菌肽的制备：在97份100mg/mL酪蛋白溶液中加入3份100mg/mL胰 蛋白酶溶液，调节酶解液pH为8.5，55℃恒温水解2.5h，之后使用分子量为3000和10000 的超滤膜对水解液进行超滤，收集分子量3000-10000的酶水解液冷冻干燥即得到酪蛋白 抗菌肽。以大肠杆菌为指示菌，测出其抑菌圈大小为19.43mm，得率为18.831mg/g。蛋 白抗菌肽在以大肠杆菌为指示菌株产生的抑菌圈如图1所示。

2)酪蛋白磷酸肽(CPPs)的制备：取步骤1)中剩余的酶水解液继续水解1h，在4 ℃条件下，10000r/min离心20min除去未水解的大分子物质和溶液中的杂质，沉淀收集 备用。向上清液中加入10％(v/v)CaCl₂和无水乙醇，使两者在溶液中的终浓度分别为 1％和50％。上清液室温放置过夜，在4℃条件下，10000r/min离心20min，收集沉淀， 用无水乙醇经过3次洗涤沉淀，最终沉淀即是酪蛋白磷酸肽(CPPs)，此时CPPs得率为 11.41mg/g，氮磷比为10.27。

3)酪蛋白糖巨肽和酪蛋白酪啡肽的制备：取步骤1)和步骤2)中剩余的酶水解残 留物质，调节pH至1.6使沉淀溶解，配制成为10mg/ml溶液，按照胃蛋白酶与酶解液质 量比1∶100在温度55℃、pH值为1.6条件下水解2h，调节水解液pH为4.6，4℃条件下， 10000r/min离心20min，取上清液备用。回调pH到7.0，此时水解液中酪蛋白糖巨肽以 多倍体存在，其分子量为20000～40000之间，而酪蛋白酪啡肽分子量小于1000。使用分 子量为1000的超滤膜对上清液进行超滤分离，酪蛋白糖巨肽位于分子量大于1000的组 分中，而酪蛋白酪啡肽位于分子量小于1000的组分中，分别冷冻干燥两种组分。此时水 解液中酪蛋白糖巨肽唾液酸回收率为40.13％，得率为1.693mg/g。β-酪啡肽-5含量 0.0297mg/mg，得率为0.1257mg/g，β-酪啡肽-7含量0.03054mg/mg，得率为0.1292mg/g， 色谱图见图2。

实施例2

1)酪蛋白抗菌肽的制备及检测：

配制浓度100mg/mL的酪蛋白溶液，以胰蛋白酶在酶底比3％、温度55℃、pH值为8..5 条件下水解，水解2.5h后，灭酶，经离心过滤、微滤去除未水解大分子物质，收集沉淀备 用。上清液分别使用分子量为3000和10000的超滤管对水解液进行超滤，分离酪蛋白抗菌 肽，据现有技术报道，酪蛋白抗菌肽分子量大于3000，故取分子量在3000-10000区间内的 水解液冷冻干燥，测定其得率，以大肠杆菌为指示菌，验证其抑菌性。利用水解2.5h后分 离出抗菌肽，冷冻干燥后各取1g样品溶于1mL蒸馏水(浓缩20倍)使用大肠杆菌验证抑菌性。 结果如表1、图3和图4所示。

表1酪蛋白抗菌肽实验结果

2)酪蛋白磷酸肽的制备

水解3.5h时，采用乙醇沉淀法分离出酪蛋白磷酸肽。并使用旋转蒸发仪回收水解液中的 乙醇。收集收集水解产生的酪蛋白磷酸肽冷冻干燥，计算其得率，测定其中氮含量、磷含量 以及氮磷比。水解3.5h后分离出酪蛋白磷酸肽，冷冻干燥，测定其中的氮元素、磷元素以 及氮磷比的值。结果如表2所示。

表2酪蛋白磷酸肽测定结果

3)酪蛋白糖巨肽及酪蛋白酪啡肽的制备

收集胰蛋白酶水解残留物质，测定其中干物质含量，调节pH使沉淀溶解，配制成为 10mg/mL溶液，使用胃蛋白酶在酶酶底比1％、温度55℃、pH值为1.6条件下水解，水解 2h，调节水解液pH为4.6，4℃条件下，10000r/min离心20min，取上清液备用。回调pH 到7.0，此时水解液中酪蛋白糖巨肽以多倍体存在。使用分子量为3000的超滤管对上清液进 行超滤分离，酪蛋白糖巨肽位于分子量大于3000的组分中，而酪蛋白酪啡肽位于分子量小 于3000的组分中，酪蛋白磷酸肽测定结果：水解3.5h后分离出酪蛋白磷酸肽，冷冻干燥， 测定其中的氮元素、磷元素以及氮磷比的值。结果如表3所示。

表3酪蛋白磷酸肽测定结果

酪蛋白糖巨肽测定结果胃蛋白酶水解2h后，分离出酪蛋白糖巨肽，通过间苯二酚-盐酸 法测定其中唾液酸回收率。实验结果如表4所示。

表4酪蛋白糖巨肽测定结果

酪蛋白酪啡肽测定结果：胃蛋白酶水解2h后，分离出酪蛋白酪啡肽，通过高效液相色 谱法测定其中酪蛋白酪啡肽的含量。实验结果如表5、图5和图6所示。

表5酪蛋白酪啡肽测定结果

实施例3酶解酪蛋白最佳水解条件的测定

单因素试验

(1)底物浓度与酪蛋白水解度的关系

水解条件：酶底比2％，pH＝8.0，温度55℃，水浴水解2h。实验结果如下：

表6底物浓度对水解度和水解速度的影响

从表6可以发现，在试验的底物浓度范围内，随着试验中酪蛋白底物浓度的增加，水解 度呈先上升后逐渐下降趋势。根据单底物酶促反应动力学理论，如果反应过程中没有出现底 物抑制现象，理论上水解度与底物浓度之间的关系应当是一种单调递增的正比例关系。水解 度随底物浓度的先增加而后逐渐减小的实验结果表明：底物浓度超过70mg/mL后，存在底 物抑制现象。

引起底物抑制现象的原因可能为：(1)随着底物浓度增高，底物分子之间的相互影响增 加，出现两个及两个以上的底物分子因争夺胃蛋白酶活性位点而分别占据了胃蛋白酶部分的 活性位点的现象，使得酪蛋白无法正常接受胃蛋白酶的催化作用，使水解度降低；同时底物 分子间通过疏水力等相互交联而凝聚，使酪蛋白被水解的位点减少，使水解度降低。(2)随 着底物浓度增高，粘度增大，胃蛋白酶与酪蛋白接触的难度随之增大，使水解度降低。

当底物浓度为70mg/mL水解度虽然最理想但是考虑到底物浓度过低可能会导致产物产 量过小，当底物浓度达到100mg/mL时水解度较高，同时水解速度也较快利于产物生成。故 最终选择底物浓度为100mg/mL。

(2)酶底比与酪蛋白水解度的关系

水解条件：底物浓度100mg/mL，pH＝8.0，温度55℃，水浴水解2h。实验结果如下：

表7酶底比对水解度和水解速度的影响

由表7可以看出，随着酶底比的增加，水解度呈上升趋势。当酶底比为2.5时，水解速 度和水解度增加的幅度趋于平缓，说明当酶底比为2.5时，底物的作用位点基本饱和，再增 加酶量，水解速度也不会明显增加。由米氏方程可知：当初始底物浓度[S]＞＞Km时，反应 速度v＝Km×[E]₀。在[E]₀达到饱和前，反应速率与酶浓度[E]₀呈非线性变化关系，这说明该 反应体系存在明显的竞争性抑制现象。但当酶底比达到2.5时曲线斜率开始减小。结合图像 以及从经济和成本的角度考虑，我们选择酶底比2.5较适宜。

(3)pH与酪蛋白水解度的关系

水解条件：底物浓度100mg/mL，酶底比2.5％，温度55℃，水浴水解2h。实验结果如 下：

表8pH对水解度和水解速度的影响

pH值对酶活性影响很大，在某一pH值时，酶具有最大活性，高于或低于此值，酶的 活性都将受到影响，通常此pH被称为酶反应的“最适pH”。在最适pH时，酶分子和底物分 子处于最合适电离状态，很容易结合生成中间复合物，因此反应速率达到最高。酶的最适 pH受底物种类和浓度、缓冲液种类和浓度等诸多因素的影响，因此最适pH只有在一定条 件下才有意义。从表8可以明显的看到pH在从pH7升到pH9的过程中，酪蛋白的水解度和 水解速度随pH的升高而呈现出先增加后降低的趋势，在pH8时水解度和水解速度都达到最 大峰值，酶活力得到了充分发挥，酶解效果较好，因此确定在此实验条件下的最适pH值为 8。

(4)温度与酪蛋白水解度的关系

水解条件：底物浓度100mg/mL，酶底比2.5％，pH＝8，水浴水解2h。实验结果如下：

表9温度对水解度和水解速度的影响

酶反应在一定的温度范围内，反应速率随着温度的升高而增大，但当温度超过一定的范 围后，反应速率反而下降，因此只有在某一温度下，酶反应的反应速率会达到最大，这一温 度就称为酶反应的最适温度。但温度对酶反应的影响与时间有密切关系，根本原因是温度促 使酶蛋白变性的反应随着时间累加的变得剧烈。在反应的最初阶段，酶蛋白变性尚未表现出 来，因此反应的速度随温度升高而增加，但是，随着反应时间延长时，酶蛋白变性程度逐渐 增大，反应速度随着温度升高的效应将逐渐被酶蛋白变性所带来的效应所“抵消”，因此在不 同反应时间内测得的“最适温度”也就不同。“最适温度”并不是酶的特征物理常数，因为一种 酶具有的最适宜温度会受到多种因素的影响，这些因素包括酶的浓度、激底物浓度、抑制剂 以及酶促反应时间等。因此，即使对同一种酶来讲，也应当说明是在什么条件下的“最适温 度”。由表9可以看出，随着温度的升高，水解度逐渐升高，当升高至55℃附近时，水解度 和水解速度达到最大峰值，继续升高温度将抑制酶的活性甚至使其失活，使得水解度降低。 所以，在此水解条件下选取最适温度55℃。

正交试验结果由以上单因素试验得出的结果，分析图以及各表选定各因素的三个水平， 其值如下表：

表10因素水平表

选定水解时间为2h，正交试验的结果如下表：

表11L₉(3⁴)正交实验结果

从因素的正交分析表中，可以得到各因素最佳水平组合为：A₃B₃C₂D₃

主次因素：D(酶底比)＞C(温度)＞A(底物浓度)＞B(pH)

根据单因素和正交表的结果再结合我们需要选取的最佳水解度值和经济因素最后确定 最佳水解方案为：酪蛋白底物浓度100mg/ml，酶底比3％，55℃，pH＝8.5。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本 技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化 或等效替换均落入本发明的保护范围内。