纤维蛋白胶复合人重组骨形态发生蛋白2微球的制备方法和用途

技术领域

本发明专利属于医用材料，主要通过局部注射应用，减少手术创伤，并不断补充局部骨形态发生蛋白2来促进成骨，加速骨折及骨不连的愈合过程。 

背景技术

骨折愈合是一个极其复杂的骨组织再生修复过程，许多因素可以影响骨折愈合，导致骨折延迟愈合或不愈合(骨不连)。科研人员以及临床医师一直致力于研究促进骨折愈合和减少骨折延迟愈合或不愈合的治疗方法。 

1965年，美国医生Urist(Urist MR.Bone：formation byautoinduction.Science，1965，150(698)：893-899)发现脱钙的骨间质有异位成骨作用，将新发现的具有诱导新骨形成的蛋白质命名为骨形态发生蛋白(Bone Morphogenetic protein，BMP)。随后，又发现了众多的BMP，除了BMP-1，它们都是TGF-beta超家族成员，无论在基因或者蛋白质结构上，还是在生物学功能上都非常相似。其中BMP-2的成骨作用研究的最多，产业化研究也最为广泛。天然的BMP-2在各种组织中的含量极低，需要采用基因重组的方法进行大量生产。 

大量的实验研究和临床实践证明：重组人骨形态发生蛋白2(recombinant human bone morphogenetic protein-2，rhBMP-2)等外源性生长因子在治疗骨不愈合、骨延迟愈合、骨缺损及脊柱融合过程中，其骨连接的速度和质量不仅优于单纯自体骨移植，而且能使那些自体骨移植失败的骨不连得以愈合。然而活性生长因子在体内的半衰期短，全身和局部应用很快被稀释代谢，达不到所期望的生物效应。 

聚乳酸一聚乙二醇共聚物(PLA-PEG，PLGA)不但具有生物相容性好、无免疫反应等特点，而且可通过调节聚乳酸和聚乙醇酸二单体的比例得到不同降解速率的载体材料，因而重组人骨形态发生蛋白2/聚乳酸-聚乙醇酸共聚物rhBMP-2/PLGA微球可以用作药物载体材料。尽管微球在药物缓释方面取得了可喜的成果。但在临床操作中，常存在着以下的问题：采用生理盐水溶解时，活性成分易于吸收、流失，不能在局部维持较高浓度；而采用静脉血或骨髓血溶解时凝固时间难以掌握，往往在体外已凝血，失去可注射性，操作不便，因此还需一种能控制凝固时间的缓释载体。纤维蛋白胶作为粘合剂已在外科临床得到广泛应用，是利用纤维蛋白原和凝血酶的反应制成具有强大粘合力的纤维蛋白胶凝块，可在体内快速成型，避免了骨诱导因子的流失问题，并具有抗原性低，降解性好，促进血管化和骨传导等多种特性和生理功能，可以作为微球的复合材料。 

发明内容

本发明专利针对骨形态发生蛋白2临床应用中的不足，构建具有很好降解性和成骨活性的rhBMP-2/PLGA微球/纤维蛋白胶复合材料。 

技术方案 

本发明专利的目的通过以下技术方案来实现： 

采用复乳-溶剂挥发法制备rhBMP-2/PLGA载药微球，对影响微球成球性及粒径的主要因素进行探讨，制备出粒径适宜的缓释微球。 

rhBMP-2干粉用盐酸胍溶液溶解，过滤，然后得到的盐酸胍溶液稀释到磷酸盐缓冲液中形成溶液，并加入牛血清白蛋白做保护剂，混匀，形成内水相。 

PLGA微球溶于二氯甲烷中形成油相， 

内水相加入油相中冰浴超声乳化，形成初乳， 

将初乳加入到外水相中， 

搅拌挥尽溶剂，过滤，蒸馏水洗涤，真空冻干，储存。 

并对微球的理化特性进行研究。然后构建rhBMP-2/PLGA微球/纤维蛋白胶复合材料，观察其微观结构，分析其化学构成，检测材料溶解特性及rhBMP-2与材料复合后的释放规律，探讨rhBMP-2/PLGA微球/纤维蛋白胶临床实际应用的可行性。 

rhBMP-2来自于：解放军军事医学科学院(赵明，王会信，周廷冲.重组人骨形态发生蛋白-2成熟肽在大肠杆菌中的表达及其诱导成骨活性，生物化学杂志，1994，10(3)：319-324). 

PLGA来自于：PLA/PGA 75/25，MW＝3000，山东省医疗器械研究所 

纤维蛋白胶来自于：杭州普济公司 

技术方案的具体工艺步骤采用复乳-溶剂挥发法制备： 

rhBMP-2干粉10mg用4M盐酸胍溶液0.5ml溶解，过滤，然后得到的盐酸胍溶液稀释到10mM的pbs磷酸盐缓冲液中形成约为10mg/ml的溶液。并加入1％的牛血清白蛋白1mg做保护剂，混匀，形成内水相。 

100mg的PLGA溶于0.7ml含2.5％司盘-20的二氯甲烷中形成油相， 

1ml内水相加入0.7ml油相中冰浴超声乳化，形成初乳， 

将1.7ml初乳加入到10ml含1％聚乙烯醇PVA、0.5％吐温-20的外水相中， 

800r/min搅拌4h挥尽溶剂，过滤，蒸馏水洗涤，真空冻干，4～8℃储存。 

扫描电镜观察可见微球形态规整均匀，近似圆形，无粘连。 

将20mg微球溶于0.5ml纤维蛋白胶的凝血酶溶液中(浓度500U/ml)，然后与纤维蛋 白原溶液(浓度50mg/ml)以1∶1体积比混合，按其缓释微球的载药率得出最终聚合的材料中含有rhBMP-2为1mg/ml。 

本发明专利与现有技术相比可以在局部注射应用，既可减少手术的创伤，又可通过不断补充局部骨形态发生蛋白来加速骨折及骨不连的愈合过程。 

附图说明

本发明专利的附图说明如下： 

图1：本发明专利微球扫描电镜照片。 

图2：本发明专利纤维蛋白胶复合人重组骨形态发生蛋白2微球的体外释放曲线。 

图3：本发明专利纤维蛋白胶复合人重组骨形态发生蛋白2微球复合材料的能谱分析。 

图4：本发明专利对犬骨髓基质细胞分化的影响。 

图5：本发明专利治疗犬股骨颈骨折的X线片检查结果。 

图6：本发明专利治疗犬股骨颈骨折的组织学观察结果。 

图7：本发明专利治疗犬股骨颈骨折同位素骨扫描结果。 

具体实施方式

纤维蛋白胶复合人重组骨形态发生蛋白2微球复合材料术中使用时，预先将BMP微球溶于FSG的主体胶部分，再以医用生物蛋白胶产品配备的双管注射器将其与凝血酶部分共同注患处，迅速形成凝胶粘附于骨折部位，可在止血的同时避免活性成分因患处出血而流失，维持局部有效浓度，达到预期的治疗效果。 

下面结合附图对本发明专利作进一步的说明： 

具体实施例1 

rhBMP-2干粉10mg用4M盐酸胍溶液0.5ml溶解，过滤，然后得到的盐酸胍溶液稀释到10mM的pbs磷酸盐缓冲液中形成约为10mg/ml的溶液。并加入1％的牛血清白蛋白1mg做保护剂，混匀，形成内水相。 

100mg的PLGA溶于0.7ml含2.5％司盘-20的二氯甲烷中形成油相， 

1ml内水相加入0.7ml油相中冰浴超声乳化，形成初乳， 

将1.7ml初乳加入到10ml含1％聚乙烯醇PVA、0.5％吐温-20的外水相中， 

800r/min搅拌4h挥尽溶剂，过滤，蒸馏水洗涤，真空冻干，4～8℃储存。 

扫描电镜观察可见微球形态规整均匀，近似圆形，无粘连。 

将20mg微球溶于0.5ml纤维蛋白胶的凝血酶溶液中(浓度500U/ml)；然后与纤维蛋白原溶液(浓度50mg/ml)以1∶1体积比混合，按其缓释微球的载药率得出最终聚合的材料中含有rhBMP-2为1mg/ml。 

扫描电镜观察可见微球形态规整均匀，近似圆形，无粘连(图1)。微球粒径呈正态分布主要集中在50～60μm。使用加权法求得平均粒径及标准差为：53.2±2.1μm，包封率约为(37.52±4.31)％，微球载药率为(5.12±1.32)％。 

具体实施例2 

从图2中可以看出：各种材料的rhBMP-2释放均成双相，rhBMP-2/PLGA微球在前4天爆发释放，释药量超过27.005％，主要由于吸附在微球表面的rhBMP-2大量释放，这时期2h、8h、24h、2d释放rhBMP-2量分别为3.65％、5.17％、8.95％、11.76％。随后的3-42d呈持续缓慢释放，42天释放rhBMP-2量达到91.75％。 

rhBMP-2/PLGA微球/纤维蛋白胶在2h、8h、24h释放BMP量分别为1.15％、1.75％、6.68％。在同一时间点均低于rhBMP-2/PLGA微球组。2dBMP释放量达到16.76％，随后的3-42d也呈持续缓慢释放，但释放量均较rhBMP-2/PLGA微球组少，42天释放rhBMP-2量达到76.75％。这种方式有利于在局部持续形成rhBMP-2有效浓度，随后的缓慢释放则可保持有效浓度，从而可以更好的促进骨的修复。 

具体实施例3 

如图3所示：PLGA微球中碳元素占71.26％，氧元素占28.74％，没有发现氮元素。纤维蛋白胶的多肽链大部分由C、N、O元素组成，其中碳元素占67.68％，氮元素占8.34％，氧元素占23.98％，纤维蛋白胶复合微球后，碳元素升高至68.54％，氧元素27.02％，然而氮元素降低至4.44％。纤维蛋白胶中非极性基团(C-C和C-H)为41.88％，其中O＝C-NH基团为36.21％，没有C-NH2和COOH(可能两种基团在纤维蛋白胶中成分较少)，极性基团为21.91％。在微球混入纤维蛋白胶后基团发生了改变C-C/C-H(52.61％)，C-OH(33.39％)和O＝C-NH(14.00％)，通过能谱分析我们发现微球混入纤维蛋白胶后优化了释放过程。纤维蛋白胶的极性基团，影响了BMP的释放，BMP吸附在纤维蛋白胶的极性基团，延长了其释放时间。 

具体实施例4 

如图4所示：分别为rhBMP-2/PLGA微球组、rhBMP-2/PLGA微球/FS材料组、空白对照组的骨髓基质细胞I型胶原染色结果。具体染色步骤：①3％H₂O₂：室温孵育10min，消除内源性过氧化物酶的活性，蒸馏水洗3次；②滴加正常山羊血清封闭液，室温20min，甩去多余液体；③滴加适当稀释的一抗(本实验中应用抗体的浓度为1∶100)，37℃孵育2h，PBS洗2min×3次；④滴加生物素化山羊抗兔IgG 20-37℃20min PBS洗2min×3次；⑤滴加SABC试剂20-37℃20min，PBS洗2min×4次；⑥使用DAB显色试剂盒显色：将试剂盒中A，B，C试剂各1滴加入1ml蒸馏水中，混匀后滴加至爬片。室温显色，镜下控制反应时间，蒸馏水洗涤；⑦脱水，透明，封片，显微镜观察染色结果并照相。 

从中可以看出，正常骨髓基质细胞细胞浆中有I型胶原表达，但含量较低，而采用rhBMP-2/PLGA微球，rhBMP-2/PLGA/FS作用后的骨髓基质细胞阳染颗粒增多，染色明显。rhBMP-2/PLGA微球/FS组高于rhBMP-2/PLGA微球组。 

具体实施例5 

股骨颈骨折动物模型的建立及rhBMP-2/PLGA微球/FS材料组对于犬股骨颈骨折的治疗方法，用量，时间及X-线检查。 

健康成年杂种犬18只，雌雄不限，体重16-20Kg，解放军总医院实验动物中心提供(许可证号SCXK(京)2007-0004)。每只杂种犬左右两侧股骨头、颈分别作为对照侧与实验侧。实验侧应用中空加压螺钉复合可注射BMP缓释载体，对照侧单纯植入中空加压螺钉，分4、8、12周三个时段进行观察。 

①麻醉及术前准备：手术前禁食水，10％戊巴比妥钠25mg/kg，静脉注射。术中维持静脉通道并常规输液、给予青霉素静脉滴注。 

②手术方法：实验犬侧卧位、右侧后肢常规备皮，触摸大粗隆，划线做标记，碘伏消毒，铺无菌巾，贴无菌手术贴膜。取髋部(后肢)外侧弧形切口，长约10cm，依次切开皮肤、皮下、深筋膜，逐层进入，助手外旋患肢，可见坐骨神经和外旋肌群，保护坐骨神经，切断外旋肌群，其深面即为关节囊。十字切开关节囊，显露股骨颈，在与钉孔相对应部位用锐利骨刀横行截断股骨颈造成骨折，随之直视下复位，先用细克氏针临时固定，确认骨折复位满意，经股骨矩向股骨头钻孔、测深度，攻丝后拧入一枚改良中空加压螺钉，务必使螺丝钉螺纹越过骨折线。然后重新消毒铺单按无菌手术原则进行另外一侧手术，手术时确保两侧入路软组织损伤程度、出血量、凿断股骨颈时所用力量、造成的骨折移位程度、手术时间复位及固定质量一致。术中检查骨折对位好，髋关节活动自如，固定牢靠后双氧水、生理盐水冲洗伤口，修复关节囊和切断的外旋肌群依次缝合肌肉、深筋膜、皮肤，伤口内放置庆大霉素注射液8万单位。实验侧通过钉尾注入2mlrhBMP-2/PLGA/纤维蛋白胶。 

③术后处理：动物从麻醉中苏醒后允许自由活动，自由饮食。术后给予肌注青霉素80万单位，1次/日，连给3天。每天观察动物髋关节的肿胀情况、动物的活动、精神、饮食。有无皮肤红肿、感染、渗液以及脓肿，切口愈合情况，手术后两周拆除伤口缝线，完成动物模型的制备。 

实验动物分别于手术后4周、8周和12周于麻醉状态下(速眠新II号1ml/Kg体重，肌肉注射麻醉)髋关节正位X线片，所有摄片均采用同批底片，曝光条件相同(电压55KV、电流55mA，曝光时间0.3s，焦距90cm)，观察股骨颈骨折愈合过程及股骨头密度变化。术后X光平片观察，实验侧和对照侧骨折皆对位良好，无错位。 

术后4周：X线示实验侧骨折断端边缘密度高，但范围较小，骨折端愈合形成的新骨密度均匀，骨折线已经较模糊，外周愈合好；对照侧断端边缘密度增高，新骨形成稀疏，可见骨折线，外周皮质骨愈合不整齐。 

术后8周：X线示实验侧断端边缘密度与周边一致，愈合组织密度与周围骨组织近似，骨折线十分模糊，外周光滑；对照侧断端边缘密度较前略低，断端间密度与周边骨较一致，骨折线变得模糊，外周皮质愈合平整，表面不光滑。 

术后12周：X线示实验侧断端边缘密度和断端间密度与正常骨组织之间无明显差异，无骨折线影，外周光滑；对照侧断端边缘密度同前，局部新骨密度较正常组织为高，骨折线基本消失，断端间密度与周边骨较一致。 

具体实施例6治疗犬股骨颈骨折的组织学观察结果 

①在手术后4，8，12周分三次取材，每次取材随机处死6只动物，方法为静脉麻醉后股动脉放血处死实验动物，将双侧股骨完整取出，然后沿股骨颈轴线冠状面纵行剖开股骨头和股骨颈，肉眼观察其形态、大小、颜色及骨折愈合情况，并比较两侧有无差别。 

②脱钙切片制作：将标本从甲醛固定液中取出，流水冲洗过夜，置于10％的EDTA溶液中，室温下脱钙处理，每隔3天更换一次脱钙液，脱钙标准的判定采用草酸溶液滴定和针刺结合的方法，即2％的草酸滴定脱钙液无沉淀及针刺易穿入即可。脱钙时间大约持续两周。标本流水冲洗过夜，乙醇梯度脱水、透明、浸蜡、包埋、切片，切片厚约5um，常规HE染色，光镜下观察术后各时相点骨折的愈合、股骨头缺血反应及修复过程。 

术后4周：组织切片示实验侧骨折断端间出现板层骨，编织骨减少，骨折区成骨细胞和成纤维细胞丰富，炎性细胞减少。骨基质样物质较多，骨小梁密集，破骨细胞增多，软骨成分少见，骨小梁边缘是成骨细胞；对照侧断端间仍见大量软骨成分，编织骨开始增多，骨折区成骨细胞和成纤维细胞数目增多，但骨折端仍有大量炎性细胞浸润，新生骨小梁间距较大，排列紊乱。 

术后8周：实验侧骨折断端由板层骨构成，编织骨已少见，软骨成分很少，骨折区骨基质丰富，骨小梁密集，成骨细胞和成纤维细胞丰富，骨基质中还有较多的骨细胞，破骨细胞数目也较多，炎性细胞较少见。对照侧编织骨成分多，板层骨少，软骨成分也较多，骨折区仍见较多炎性细胞，成骨细胞和成纤维细胞也较多，骨基质样物质增多，骨小梁较为密集，排列不规则，骨基质中也可见不少破骨细胞。 

术后12周：组织切片示实验侧骨折区接近临近正常骨组织结构，新骨密度与正常骨组织一致，骨基质中骨细胞数目接近正常。骨小梁密集，排列与临近骨组织中骨小梁相似；对照侧骨组织排列稀疏成片，表现为编织骨，骨小梁较密集，呈网状，成骨细胞减少，破骨细胞 亦减少。 

具体实施例7治疗犬股骨颈骨折同位素骨扫描结果 

实验动物分别于术后4，8，12周分3次行核素显像检查。3％戊巴比妥钠1ml/kg静脉麻醉，将实验动物呈蛙位固定于检查床上，双侧髋关节对称地置于γ照相机探头下(配低能高分辨平行孔准直器)，自导管“弹丸”式注射^99mTc一羟基亚甲基二磷酸盐(MDP 1毫居/1kg)，3h后分别行局部静态采集，为延迟相。然后对静态相单位时间内双侧股骨头，股骨干“感兴趣区”(ROI)的放射性计数进行侧定，并计算出头、干比值(头/干比)。所得数据应用SPSS 10.0统计软件进行统计学处理，行计量资料的配对t检验(a取0.01)。 

术后4周：静态骨相两侧均有核素浓聚，实验侧和对照侧浓聚程度高于正常骨组织，其中实验侧在骨折线周围出现核素浓聚，强度明显较对照组强。实验侧ROI为264.23，对照侧为119.37，股骨干ROI为20.05。实验侧头/干比值为13.18，对照侧为5.95。 

术后8周：静态骨相核素浓聚，中心及边缘核素浓聚较4w时减弱，但仍高于正常组织。实验侧的核素浓聚较对照组明显，对照侧也有核素浓聚出现。实验侧ROI为153.48，对照侧为75.06，股骨干ROI为18.15。实验侧头/干比值为8.46，对照侧为4.14。 

术后12周：实验侧和对照侧静态骨相两侧核素浓聚变弱，但仍高于周围正常骨组织密度水平。对照侧核素浓聚高于实验组。实验侧ROI为61.72，对照侧为137.65，股骨干ROI为18.65。实验侧头/干比值为3.31，对照侧为7.38。