玉米自交系弯孢菌叶斑病抗性的早期鉴定方法

技术领域

本发明属于抗病育种领域，具体涉及玉米自交系弯孢菌叶斑病抗性的早期鉴定方法。

背景技术

玉米弯孢菌叶斑病(Corn Curvularia Leaf Spot Disease)是20世纪八十年代中后期在华北地区发生的一种危害较大的新病害，主要危害叶片，也危害叶鞘和苞叶。抽雄后病害迅速扩展蔓延，植株布满病斑，叶片提早干枯，一般减产20～30％，严重地块减产50％以上，甚至绝收。

玉米弯孢菌叶斑病的病原菌为新月弯孢菌(Curvularia lunata(Wakker)Boed)和不等弯孢霉(Curvularia inaeguacis)，属半知菌亚门弯孢霉属。对玉米弯孢菌叶斑病的防治主要是抗病育种、耕作栽培、化学药剂等方法，其中培育抗病品种是最经济有效的方法。在抗玉米弯孢菌叶斑病育种中，对其抗病性的鉴定主要是采用人工接种弯孢菌孢子悬浮液，然后利用病斑数、产孢量等病情指数进行抗性评价的方法(王宏等.沈阳农业大学学报，2000，31(5)：476-478；赵来顺等.河北农业大学学报，1995，18(4)：36-38)，这种鉴定方法工作量较大，且易受其他病害及地域的影响(刁毅等.南方农业学报，2011，42(2)：161-163；冷廷瑞等.现代农业科技，2010，(17)：159-161，163)；其他的抗病性鉴定方法是采用同工酶分析、酶联免疫检测等，这些方法虽然精确，但步骤繁琐，成本较高，难以进行大规模的鉴定和筛选，因此迫切需要寻找一种简单可靠、且可在室内鉴定玉米自交系弯孢菌叶斑病抗性的方法。

新月弯孢菌(Curvularia lunata(Wakker)Boed)毒素是玉米弯孢菌叶斑病的主要致病因子，是植物病程中起着决定作用的有毒物质，在玉米弯孢菌叶斑病病害的发生、发展过程中具有明显的致病作用(李富华等.植物保护，2004，30(6)：5-10)。经新月弯孢菌毒素处理后，玉米叶片组织结构明显受到伤害，细胞壁结构断裂，细胞膜结构破裂，基粒和基质片层释放，线粒体内含物消解，发生空泡化，从而严重干扰叶片的正常光合作用和呼吸作用(张欣芳等.玉米科学，2009，17(6)：118-120，123)。

植物的保护反应是复杂的新陈代谢过程，植物受到病原物侵染后，抗、感品种之间苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase，简称为PAL)、多酚氧化酶(polyphenol oxidase，简称为PPO)、过氧化物酶(horseradishperoxidase，简称为POD)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，简称为SOD)以及其它重要酶类的活性变化有明显差异(Shoresh等.PlantPhysiology，2008，147：2147-2163；Segarra等.Proteomics，2007，7(21)：3943-3952；何祖华等.植物生理学报，2001，27(4)：281-290)。用玉米弯孢菌叶斑病毒素处理玉米幼苗后，抗病品种的PAL和POD对玉米弯孢菌叶斑病毒素较感病品种敏感，抗病品种的酶峰出现时间提前或峰值大于感病品种；而玉米弯孢菌叶斑病毒素能刺激感病品种SOD活性增加，抑制了抗病品种的SOD活性(陈捷等.植物病理学报，2002，32(1)：43-48)。因此，经新月弯孢菌毒素诱导处理后，保护反应中酶系活性的变化也可作为玉米自交系弯孢菌叶斑病抗性的鉴定和筛选的指标。

发明内容

本发明的目的在于提供一种玉米自交系弯孢菌叶斑病抗性的早期鉴定方法。利用该方法可在室内完成抗弯孢菌叶斑病玉米自交系的鉴定和筛选，打破季节限制并减少田间抗病性鉴定的繁杂工作，提高工作效率。

本发明所提供的玉米自交系弯孢菌叶斑病抗性的早期鉴定方法，按照如下方法进行：

(1)将3叶期的玉米自交系幼苗自根茎处剪下，放入浓度为20～100μg/mL玉米新月弯孢菌毒素溶液中，利用真空泵产生的200mmHg负压力进行渗透6～48h，然后于25℃恒温箱中静置18h；

(2)取步骤(1)中经过玉米新月弯孢菌毒素处理过的玉米自交系幼苗的第3片叶(上部叶片)，剪去叶尖，取叶片中上部，用滤纸吸干水，称取叶片1.0g和石英砂0.1g，放入研钵中，加入pH 8.8、0.05mol/L的硼酸钠缓冲液2.0ml，研磨成匀浆，将匀浆转入离心管中，并用硼酸钠缓冲液2.0mL冲洗研钵上的残留部分，转入离心管，搅动5min；然后在4℃、12000g下离心30min，取上清液；将3ml上清液用pH 8.8、0.05mol/L硼酸钠缓冲液稀释成15ml，得稀释的上清液，-4℃下保存；其中所述的硼酸钠缓冲液中含有5mmol/L巯基乙醇和1mmo1/L EDTA；所述的上清液为苯丙氨酸解氨酶、过氧化物酶和超氧化物歧化酶的混合粗提液；

(3)分别测定步骤(2)中所得的稀释的上清液中苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)的酶活性(U)；并计算出每种酶的比活力，比活力计算公式为：比活力＝酶活性/蛋白含量，再按照下述公式分别计算玉米自交系抗病性的抗性等级数值x₁、x₂和x₃，

y₁＝22.13x₁+35.17               (公式1)；

y₂＝50.17x₂²-136.9x₂+222.5      (公式2)；

y₃＝-4.432x₃+38.04              (公式3)；

其中y₁为苯丙氨酸解氨酶(PAL)的比活力；y₂为过氧化物酶(POD)的比活力；其中y₃为超氧化物歧化酶(SOD)的比活力；

(4)计算x₁、x₂和x₃的平均值x，即x＝(x₁+x₂+x₃)/3，选取x≥3的玉米自交系，即为抗玉米弯孢菌叶斑病的自交系。

上述方法步骤(1)中所述的玉米新月弯孢菌毒素溶液，按照如下方法制备(参见肖淑芹等.玉米科学，2006，14(4)：138-140)：将玉米新月弯孢菌菌株培养在PDA培养基上(PDA培养基的组成成分及其重量比为：每1L蒸馏水中含马铃薯200g和葡萄糖15g)，培养7d后用打孔器(Φ＝0.7cm)在培养的菌落上打孔，将6个新月弯孢菌菌片接于100mL改良Fries液体培养基(其组成成分及其比例为：每1L蒸馏水中含蔗糖20g、酒石酸氨5g、NH₄NO₃ 1g、KH₂PO₄1g、氯化钠0.1g、七水硫酸镁0.5g、氯化钙0.13g和酵母膏1g，pH6.2)中，于25℃、120rpm下培养振荡培养10～15d；用活性炭柱(4cm×46.5cm，颗粒活性炭30g)过滤上述液体培养基，流速为4.2mL/min，用300mL甲醇洗脱炭柱3次，每次100mL；每次甲醇洗脱后再用100mL蒸馏水洗涤，混合3次甲醇洗脱液，于60～70℃水浴锅中浓缩至大约10mL；在25～65℃恒温箱中蒸干，获得浆状物；将所得浆状物溶于50mL温度在25～37℃的甲醇中；过滤，除去不溶物，取滤液，加3倍体积的氯仿混合，在25℃下静置过夜，蒸干甲醇、氯仿溶解层，获得黄褐色晶体，即为新月弯孢菌粗毒素；加蒸馏水溶解，制成浓度为20～100μg/mL新月弯孢菌毒素溶液。

上述方法步骤(1)中所述的3叶期的玉米自交系幼苗，按照如下方法获得：选择饱满的自交系的种子，经0.1％HgCl₂消毒10min，用蒸馏水冲洗干净，于25℃下吸胀24h，转移到垫有6层湿润滤纸的白磁盘中，于28℃/25℃(昼/夜)下暗萌发72h；萌发后转移至光照培养箱中继续培养，培养条件为28℃/25℃(昼/夜)，光照强度为200mmol/m²·s，每天光照时间12h，培养2～3周，得3叶期的玉米自交系幼苗。

上述方法步骤(3)中所述的苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的测定，按照Koukol等(Koukol J等.Journal of Biology Chemistry，1961，236：2692-2698)公开的方法进行。取上述方法步骤(2)中所得的稀释的上清液1ml，然后以L-苯丙氨酸为底物，在290nm处测定苯丙氨酸解氨酶的酶活；以每小时使OD₂₉₀增加0.01的酶量定为一个酶活单位(U)，计算苯丙氨酸解氨酶的比活力。

上述方法步骤(3)中所述的过氧化物酶(POD)活性的测定，按照愈创木酚法(参见张志良等.植物生理学实验指导[M].北京：高等教育出版社，2003，123-124)进行；取上述方法步骤(2)中所得的稀释的上清液1ml，然后以愈创木酚(guaiacol)作底物，在470nm处测OD值；以每分钟每毫克蛋白OD₄₇₀增加值表示酶的活性，计算过氧化物酶的比活力。

上述方法步骤(3)中所述的超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定，取步骤(2)中稀释的上清液0.1ml，按照氮蓝四唑(NBT)光化还原法测定SOD活力(参见王爱国等.植物生理学报，1983，9(1)：77-84)。找出抑制NBT 50％光化学还原的酶液量，定为一个酶活单位(U)，计算超氧化物歧化酶的比活力。

上述方法步骤(3)中所述蛋白含量的测定方法：取步骤(2)中的稀释的上清液，利用考马斯亮兰G-250微量法测定其蛋白含量(具体方法参见张志良等.植物生理学实验指导[M].北京：高等教育出版社，2003，159-160)。

玉米自交系弯孢菌叶斑病性评价标准(参见王宏等.沈阳农业大学学报，2000，31(5)：476-478；赵来顺等.河北农业大学学报，1995，18(4)：36-38)为抗病：病斑类型为R或M，严重度1级；中抗：病斑类型为R或M，严重度2级；中感：病斑类型S或M，严重度3级；感病：病斑类型S，严重度4级。

上述方法步骤(3)中所述的PAL、POD及SOD比活力与抗病性的回归方程的建立方法：以典型的抗病玉米自交系BC2433，中抗玉米自交系178，中感玉米自交系H21，感病玉米自交系掖478为材料，按照前述方法测得新月弯孢菌毒素处理后玉米幼苗的PAL、POD和SOD比活力值。以抗性等级为x，1表示感病自交系抗性，2表示中感自交系抗性，3表示中抗自交系抗性，4表示抗性自交系抗性，以PAL、POD和SOD比活力数据为y，先利用数据分析软件Excel2007做出表示x和y关系的散点图，初步判断x和y关系，再利用DPS(DataProcessing System，即DPS统计软件，该软件是实验设计及统计分析的多功能统计分析软件)7.05根据散点图进行线性回归或二次多项式回归分析，建立PAL、POD及SOD比活力与抗病性的回归方程，结果分别为：

y₁＝22.13x₁+35.17                  (公式1)；

y₂＝50.17x₂²-136.9x₂+222.5         (公式2)；

y₃＝-4.432x₃+38.04                 (公式3)；

其中y₁为苯丙氨酸解氨酶(PAL)的比活力；y₂为过氧化物酶(POD)的比活力；其中y₃为超氧化物歧化酶(SOD)的比活力；其中x₁、x₂和x₃为玉米自交系抗病性的抗性等级数值。

对建立的3个回归方程是否成立进行假设检验，结果显示PAL比活力与玉米自交系抗病性存在极显著线性正相关关系，线性方程y₁＝22.13x₁+35.17(R²＝0.955，P＜0.01)；POD比活力与抗病性存在曲线正相关，回归方程为y₂＝50.17x₂²-136.9x₂+222.5(R²＝0.996，P＝0.058)；SOD比活力与玉米抗病性存在极显著线性负相关，回归方程为y₃＝-4.432x₃+38.04(R²＝0.961，P＜0.01)。

所述的估算玉米自交系弯孢菌叶斑病的抗性水平的方法为根据PAL、POD及SOD比活力与抗病性的回归方程计算出x₁、x₂和x₃，取其平均值x，根据1≤x＜2表示为感病自交系、2≤x＜3表示中感自交系，3≤x＜4表示中抗自交系，x≥4表示抗病自交系判断玉米自交系的抗性。选择x≥3的，即为抗玉米弯孢菌叶斑病的自交系。

与现有技术相比，本发明具有如下的优点或有益效果：(1)本发明方法准确、可靠。(2)本发明方法可在室内完成玉米自交系弯孢菌叶斑病抗性的鉴定和筛选，无需在田间进行抗病性鉴定，不受外界环境条件的限制。(3)本发明方法在苗期进行抗病性鉴定，无需在成株期鉴定，打破了季节限制，并且缩短了鉴定所需的时间。(4)本发明减少田间抗病性鉴定的繁杂工作，工作效率高。

具体实施方式

实施例1  玉米新月弯孢菌毒素溶液的制备

1.将玉米新月弯孢菌菌株(该菌株由青岛农业大学植物病理教研室鄢洪海老师分离鉴定)培养在PDA培养基上(其组成成分及其重量比为：每1L蒸馏水中含马铃薯200g和葡萄糖15g)，培养7d后用打孔器(Φ＝0.7cm)在培养的菌落上打孔，将6个新月弯孢菌菌片接于100mL改良Fries液体培养基中(其组成成分及其重量比为：每1L蒸馏水中含蔗糖20g、酒石酸氨5g、NH₄NO₃ 1g、KH₂PO₄ 1g、氯化钠0.1g、七水硫酸镁0.5g、氯化钙0.13g和酵母膏1g，pH6.2)，于25℃、120rpm下培养振荡培养15d；用活性炭柱(4cm×46.5cm，颗粒活性炭30g)过滤上述液体培养基，流速为4.2mL/min，用300mL甲醇洗脱炭柱3次，每次100mL；每次甲醇洗脱后再用100mL蒸馏水洗涤，混合3次甲醇洗脱液，于60～70℃水浴锅中浓缩至大约10mL；在37℃恒温箱中蒸干，获得浆状物；将所得浆状物溶于50mL 37℃甲醇中；纱布过滤，除去不溶物，取滤液，加3倍体积的氯仿混合，在25℃下静置过夜，蒸干甲醇、氯仿溶解层，获得黄褐色晶体，即为新月弯孢菌粗毒素，加蒸馏水溶解，制成浓度为50μg/mL玉米新月弯孢菌毒素溶液。

实施例2  玉米自交系弯孢菌叶斑病抗性的早期鉴定对比试验

按照如下方法进行：

试验材料：10个玉米自交系：齐319、Q58、昌7-2、郑58、美26800、丹340、郑0510、陕814、189、丹黄25。

试验设计：

试验方法：(一)室内幼苗鉴定试验

(1)选择饱满的自交系的种子，经0.1％HgCl₂消毒10min，用蒸馏水冲洗干净，于25℃下吸胀24h，转移到垫有6层湿润滤纸的白磁盘中于28℃/25℃(昼/夜)下暗萌发72h；萌发后转移至光照培养箱中继续培养，培养条件为28℃/25℃(昼/夜)，光照强度为200mmol/m²·s，每天光照时间12h，培养2～3周，得3叶期的玉米自交系幼苗。

(2)选择均匀一致的3叶期的玉米自交系幼苗自根茎处剪下放入50mL试管中，每个试管5株，加实施例1中制备的浓度为50μg/mL新月弯孢菌毒素溶液50mL，200mmHg负压力下渗透12h，25℃恒温箱中静置18h，取第3叶进行酶活性的检测。

(3)将(2)中经过新月弯孢菌毒素溶液处理的玉米幼苗的第3叶，剪去叶尖，取叶片中上部，用滤纸吸干水后，称取1.0g叶片，加pH8.8、0.05mol/L硼酸钠缓冲液(内含5mmol/L巯基乙醇，1mmol/L EDTA)2.0ml，加石英砂0.1g研磨成匀浆，将匀浆转入离心管，用2.0mL硼酸钠缓冲液冲洗残留部分，转入离心管；搅动5min，然后在4℃、12 000×g下离心30min，取上清液；再取上清液3ml用pH8.8、0.05mol/L硼酸钠缓冲液稀释到15ml，得稀释的上清液(或称酶液)，-4℃冰柜中保存。

(4)(a)苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性测定：取步骤(3)中稀释上清液1ml，按照Koukol等(Koukol J等.Journal of Biology Chemistry，1961，236：2692-2698)所述的方法进行PAL活性的测定，具体结果见表1。

表1玉米自交系苯丙氨酸解氨酶活性测定结果

(b)过氧化物酶(POD)活性测定：取(3)中的稀释的上清液1ml以愈创木酚(guaiacol)作底物，按照张志良等方法(张志良等.植物生理学实验指导[M].北京：高等教育出版社，2003，123-124)进行过氧化物酶(POD)活性的测定，具体结果见表2。

表2玉米自交系过氧化物酶活性测定结果

(c)超氧化物歧化酶(SOD)活性测定：取(3)中的稀释的上清液0.1ml，按照氮蓝四唑(NBT)光化还原法(参见王爱国等.植物生理学报，1983，9(1)：77-84)测定SOD酶活，具体结果见表3。

表3玉米自交系超氧化物歧化酶活性测定结果

(d)稀释酶液中蛋白质含量的测定：准确量取稀释上清液2mL利用考马斯亮兰G-250微量法测酶液中蛋白质含量(具体方法参见张志良等.植物生理学实验指导[M].北京：高等教育出版社，2003，159-160)，测得蛋白含量为12.73 mg(蛋白)/g(鲜重)，计算出玉米自交系PAL、POD和SOD的比活力，结果见表4。

表4玉米自交系PAL、POD和SOD的比活力结果

(5)定义玉米自交系PAL、POD和SOD的比活力分别为y₁，y₂，y₃，根据y₁＝22.13x₁+35.17，y₂＝50.17x₂²-136.9x₂+222.5及y₃＝-4.432x₃+38.04计算自交系的抗病性x₁、x₂、x₃和x。结果见表5。

表5玉米自交系的室内鉴定的抗性水平结果

(二)田间抗性鉴定对比试验

(1)将从染玉米新月弯孢菌病的玉米植株上分离保存的玉米新月弯孢菌菌株培养在PDA培养基，28℃恒温箱培养7-14d，然后用适量的无菌水洗涤(加吐温适量)，用双层纱布过滤，制成混合孢悬液。成株期接种浓度约为2.0×10⁵个孢子/ml。

(2)将供试材料齐319、郑58、Q58、昌7-2、美26800、丹340、郑0510、丹黄25、陕814和189播种于地势平坦、肥力均匀的田块，种植2行，每行15穴，株行距为0.5m×0.8m，双株留苗，3次重复。按常规方法对玉米自交系进行田间管理。

(3)用手持喷雾器于喇叭口期喷雾接种，接种后捆扎保湿48h，以后逐日观察记载潜育期，待病情稳定后，逐株记载病斑反应型、病斑数、病斑大小和严重度。各项指标调查和测量方法如下：(1)潜育期：接种后，每日观察各品种症状出现日期，接种至出现明显症状的天数记为潜育期。(2)病斑类型：固定果穗位上1叶为调查对象，逐株调查病斑类型。方法参照赵来顺等方法(赵来顺等.玉米黄斑病研究II.症状类型[J].河北农业大学学报，1995，18(4)：36-38)。(3)严重度：待田间病情稳定后，取果穗叶以上3叶逐株调查严重度。分级标准参照王宏等方法(王宏等.玉米杂交种对弯孢菌叶斑病抗性鉴定[J].沈阳农业大学学报，2000，31(5)：476-478)。(4)病斑数：待病情稳定后，测定每株13叶左右单位面积上的病斑数。结果见表6。

表6玉米自交系的田间抗病性鉴定结果

室内幼苗鉴定结果(见表5)表明：齐319、郑58、Q58、昌7-2、美26800、丹340和郑0510的室内抗病等级＞3，为抗病自交系；丹黄25、陕814和189的抗性等级＜3，为感病自交系。室外田间鉴定结果(见表6)表明齐319、郑58、Q58和昌7-2的田间抗病性为抗病自交系，美26800、丹340和郑0510为中抗自交系，丹黄25、陕814和189为中感自交系。

综合上述室内幼苗和田间鉴定结果：齐319、郑58、Q58、昌7-2、美26800、丹340和郑0510为抗病自交系，丹黄25、陕814和189为感病自交系，两者鉴定结果基本一致，说明本发明在室内幼苗阶段对玉米自交系的抗弯孢菌叶斑病的抗性鉴定的方法准确、快速，而且该方法不受季节限制、并能减少田间鉴定所需大量的试验用地和人力、财力，节约成本和劳力。