关于对聚乙二醇干扰素和利巴韦林应答的与预治疗血清IP-10定量结合的IL28B基因多态性的预测值相比这些生物标记中任何单独一种增强

本发明涉及一种方法，所述方法将IL28B基因型测定与IP-10的预治疗血清水平测量结合，以预测感染HCV的个体患者对聚乙二醇干扰素和利巴韦林持续病毒应答(SVR)或不应答的结果。

作为黄病毒科的成员的丙型肝炎病毒(HCV)是一种能导致慢性肝炎的血源性病毒，并可导致肝纤维化、肝硬变和癌症。世界范围内约1亿7000万人感染HCV，但治疗选择有限。治疗慢性丙型肝炎目前的护理标准由每周注射一次聚乙二醇化干扰素α(IFN-α)和每日口服两次利巴韦林构成(Fried和Hadziyannis, 2004, Semin Liver Dis 24 Suppl 2, 47-54)。然而，接受48周疗程后，仅40-50%的感染基因型1或4的患者达到持续的病毒应答(SVR)，相比之下感染基因型2或3的患者为80%。由此可见，显然病毒基因型部分决定IFN-α/利巴韦林治疗应答。此外，当前的护理标准通常伴随副作用，例如抑郁和贫血 (Fried和Hadziyannis, 2004)。因此对HCV患者而言，存在对新型更有效更安全治疗的选择的未满足医学需要。

因而对治疗HCV基因型1的护理标准目前包括服用48周的聚乙二醇IFN-α和利巴韦林，24周的随访以确定是否达到持续病毒应答。持续病毒应答(SVR)定义为治疗停止后至少24周检测不到HCV RNA。关于利用这些药剂治疗的持续时间、费用和死亡率已在本领域构成以下需求：更好地理解应答和提前识别可从修改治疗策略中受益的患者。

近期已产生的资料显示对IFN-α应答的遗传贡献(genetic contribution)，其中在来自不同种族背景的HCV感染个体中IL28B多态性与临床测定的病毒清除率之间有很强的关联。该资料支持宿主部分决定先前与细胞因子血清标记相关的治疗失败，其中最相关的是在开始治疗前测定的IP-10血清水平。

显示抗HCV活性的IFN-λ蛋白质由IL28A/B和IL29基因编码(Kotenko,等，2003, Nature Immunol. 4:69; Sheppard等，2003, Nature Immunol. 4:63)，而IL28B基因编码干扰素-λ3 (IFN-λ3)。近期研究已识别了一种单核苷酸多态性（SNP）(rs12979860, SEQ ID NO: 1) ，其位于IL28B基因上游3千碱基(3kb)处，可作为治疗应答的潜在预测标记(Ge等，2009, Nature 461:399)。该发现由其他使用其他临近IL28B基因的SNP标记(rs12980275, SEQ ID NO: 2和rs8099917, SEQ ID NO: 3)的独立研究所证实(Suppiah等，2009, Nature Genetics 41:1100; Tanaka等，2009,Nature Genetics 41:1105)。有利的突体显示与多于应答HCV药物治疗的两倍差异紧密关联。在多种族群体中，约80%具有两个有利变体拷贝的患者在IFN-α治疗期间清除了病毒，并且在治疗后24周时间中仍不存在病毒。该遗传关联似乎在包括欧洲、非洲和亚洲患者在内的所研究的所有族群中的应答预测都是重要的。这些研究也提供了以下初步证据：在外周血单核细胞(PBMC)中IL28B mRNA表达受与对IFN-α治疗的增强应答相关的IL28B基因型影响。在后期的研究中，该基因型也显示大大地增强了在欧洲和非洲裔个体中HCV感染的自然分辨率(natural resolution) (Thomas等，2009,Nature 461:798)。这些研究还为在个性化医学设定中预测对的IFN-α的应答提供了一定希望。

在将IFN-γ诱导蛋白10(IP-10或CXCL10)识别为非应答的标记之前，肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素(IL) 1B、IL-10和IL-8被识别为对IFN-α治疗不应答的血清标记。IP-10在HCV患者肝脏和血清中显示提升，并且发现其水平在对IFN-α不应答的HCV患者中相比应答者中提高更多。该发现也在包括欧洲高加索裔DITTO-研究在内的更大数据集中被证实，其中基线水平为对治疗应答预测的最重要的决定因子(Romero等，2006, JID 194:895; Lagging等， 2006, Hepatology 44:1617)。后来，关于IP-10的发现延伸到HCV/HIV共感染的患者(Zeremski等，2007, JAIDS 45:262)，其随后在二次研究中证实并且还与这些患者中肝炎和纤维化相关(Reiberger等，2008, Antivir Ther 13:969)。所述IP-10关联性也在不同的种族群体中显示(Fried等，AASLD 2008, poster 1223)。

本领域出现了这样的一种普遍性的观点，即在RNA、细胞或蛋白水平显示的免疫应答的提升可表明对IFN-α/利巴韦林疗法的应答不强，尽管这没有达到在临床使用的分析或先进技术水平。尽管标记是已知的，但关于不应答的机制仍然未知。此外，尽管有前景，但IL28B基因型没有解释干扰素应答的所有方面，并且该发现与其他已知生物标记(如病毒基因型、病毒载量、重量、纤维化和IP-10)如何联系起来还不清楚。在IL28B基因产物IFN-λ3的活性和免疫基因表达之间的分子联系表明：IL28B和下游细胞因子和趋化因子水平应为独立的，因而下游血清标记例如IP-10可有效描述同样的基因型现象。

最近报导的IL28B遗传多态性极其令人振奋，其可以产生关于对聚乙二醇干扰素和利巴韦林治疗实现持续病毒应答的重要预后信息。然而，其作为独立试验的临床实用性仍为有限的。对于CC基因型，SVR的似然率(likelihood)估计为约80%。相比之下，对于TC杂合子，应答的似然率降低到约50%。因而，该基因分型试验的阳性或阴性预测值相对低，这可弱化其在抗病毒治疗决策中的应用。建立于其预测能力的方法(遗传试验与抗病毒应答的其他易得标记联用)可改进阳性或阴性预测值并改善临床实用性。

本发明的一部分为高加索人和非裔美国人的HCV样品分析，其中意想不到地确定，IP-10血清水平和IL28B 基因型互为补充且为独立的应答预测物，特别地对于IL28B 基因型杂合的或对不应答者基因型纯合的感染HCV的患者中测量的IP-10水平为在测定对IFN-α治疗的应答方面提供了另外的价值。

对来自VIRAHEP-C （NIH资助的临床试验）的80名参与者使用ABI TaqMan等位区分试剂盒测试IL28B多态性标记rs12979860。基因分型的患者为子研究的一部分，为其在归档血清中测定一组血清因子(Fried 等， EASL 2008)。本群体包括40名SVR和40名不应答者，其中39名为高加索人，41名为非裔美国人。CC、CT或TT基因型分别以19%、61%和20%存在，其相应的SVR率分别为87%、47%和25%(χ²=13.4, p=0.0012)，其与Ge等的初始报告一致(2009, Nature 461:399)。

平均血清IP-10水平是相似的，且似乎与IL28B基因型不相关(p=0.28)。在IP-10水平低(<600 pg/ml)的患者中发现78%的SVR率，相比之下IP-10水平高(>600 pg/ml)的患者的SVR率为36% (χ²=17.1, p<0.0001)。

在IL28B基因型群体中血清IP-10水平提供关于SVR似然率的另外和独立的信息(χ²=27.5, p<0.0001)。更具体而言，IP-10水平低的CT携带者SVR为79%，相比之下高IP-10水平为34%。在TT携带者其中，确定到相似的关系(低IP-10的50%对比高IP-10的10%)。

所以当IL28B基因型与在非CC基因型中预治疗血清IP-10测量值相结合时，患者个体的预测值由在对聚乙二醇干扰素和利巴韦林SVR和不应答之间进一步区分而改进。更具体而言，SVR的广义线性模型拟合(generalized linear model fitting)包括IL28B 基因型和血清IP-10两者，因为解释性的变量显示IL28B 基因型(p<0.0013)和血清IP-10(p<0.0016)的显著贡献作用，但未显示在估计持续病毒应答中IL28B和IP-10(p=0.75)之间的相互作用。

因此，本发明涉及一种方法，其将IL28B基因型测定与IP-10的预治疗血清水平测量结合，以预测感染HCV的个体患者对聚乙二醇干扰素和利巴韦林持续病毒应答(SVR)或不应答的结果。

在更广的层面，本发明涉及一种方法，其结合两种或更多种选自以下的参数以预测感染HCV的个体患者对聚乙二醇干扰素和利巴韦林持续病毒应答(SVR)或不应答的结果：IP-10的预治疗血清水平测量值、IL28B 基因型测定结果、种族或的丙型肝炎病毒载量测定结果。

在该方法中，将IL28B基因型测定与IP-10的预治疗血清水平测量相结合，其中可加入种族或丙型肝炎病毒载量两种参数任一者或两者，以预测感染HCV的个体患者对聚乙二醇干扰素和利巴韦林持续病毒应答(SVR)或不应答的结果。

本发明进一步的方面中，IL28B 基因型包括多态性标记rs12979860、rs12980275和/或rs8099917，或任何其它与这些标记连锁不平衡的遗传标记。

本发明还涉及：与这两种单独标记(IL28B基因型、血清IP-10水平)中任一种相比，进一步区分感染HCV的个体患者对聚乙二醇干扰素和利巴韦林的SVR和不应答。

意想不到的是，将IL28B基因型和血清IP-10的结果结合改善了在TT和TC基因型中对持续病毒应答的阴性预测值。

本发明的一部分也为一种诊断测定产品(diagnostic assay)，其包括用于至少测定或测量在HCV感染患者血清中IL28B多态性和IP-10水平的工具(means)。

本发明另一个实施方案为包含建模软件的计算机系统，其使用从本发明方法获得的结果信息，用于预测感染HCV的个体患者对聚乙二醇干扰素和利巴韦林的持续病毒应答(SVR)或不应答。

实施例部分

实施例1

患者和治疗

VIRAHEP-C研究为慢性丙型肝炎的聚乙二醇干扰素和利巴韦林结合疗法的多中心研究，其设计用来评估基因型1感染的AA和CA之间应答的比率和预测物，并确定对治疗不应答的原因。VIRAHEP-C试验的设计和主要结果已在其他地方报道[Conjeevaram, H.S.等， Peginterferon and ribavirin treatment in African American and Caucasian American patients with hepatitis C genotype 1. Gastroenterology, 2006. 131(2): 第470-7页]。18岁以上的如下患者适合参与：未曾接受治疗、感染有基因型1病毒、具有可检测的HCV RNA且具有慢性HCV的组织学证据。以下患者被排除在外：具有每天饮酒超过两杯或等量的（20g）历史的或在早前6个月被证明滥用酒精的。在登记18个月内所有患者都经历肝脏活组织检查。患者根据自我汇报按种族分为非裔美国人或高加索人，或是按族群分为要么西班牙裔或非西班牙裔。所有参与者需要在美国出生。

患者至少在24周内每周接受180μg聚乙二醇干扰素α-2a(Pegasys,Roche Pharmaceuticals, Nutley, NJ)和每日1000-1200 mg利巴韦林(Copegus, Roche Pharmaceuticals, Nutley,NJ)。在第24周前HCV RNA转阴的患者继续接受治疗，总共持续48周，然而那些仍为HCV RNA阳性的患者停止治疗，并认为是不应答者(NR)。该实验的主要终点(primary endpoint)为持续病毒应答(SVR)，其定义为在停止治疗后至少24周没有检测到HCV RNA。

包括IP-10的血清因子分析

从VIRAHEP-C群体选出50名对抗病毒治疗持续病毒应答者(SVR)和50名对抗病毒治疗不应答者(NR)，进行细胞因子分析。在该追溯分析(retrospective analysis)中不包括经过48周基于IFN的治疗的复发者。该群体由51名非裔美国人(AA)和49名高加索裔美国人(CA)组成。群体包括41名女性和59名男性。

根据厂商的说明书，在Luminex系统上使用市售的人23-plex和27-plex谱细胞因子BioPlex测定(BioRad, 产品号分别为#171-A11123和#171-A11127)，在基线处测量收集的血清样品中50种不同的细胞因子。在基线处多重测定中分析的50种细胞因子中，37种可在大多数样品中可靠地定量。应特别注意血清IP-10水平的分析，其作为人细胞因子27-plex谱BioPlex测定中的一部分进行测定。该测定中IP-10测量值动态范围为3.1 - 50,938 pg/ml，检出限为6.5 pg/ml。

IL28B基因分型

对80名患者（40名应答者，40名不应答者）亚组实施基因分型，对其血清IP-10浓度进行分析(参见上文内容)。该患者亚组包括39名AA和41名CA。

如在Thomas等(Nature, 461:798-802, 2009)中描述，使用ABI TaqMan等位基因区分试剂盒和ABI7900HT Sequence Detection System(Applied Biosystems)测试IL28B多态性标记rs12979860。

统计分析

使用SAS或JMP软件(SAS Institute Inc)实行统计分析。使用Tibco Spotfire软件或GraphPad Prism 4软件制作图表。

IP10与SVR相关联

使用50种细胞因子和趋化因子的综合阵列(comprehensive array)评估经历HCV治疗的VIRAHEP-C群体中100名患者的血清样品，从而测定所选细胞因子的预治疗概况(profile)是否可在充分表征的美国人群体中预测治疗应答(持续病毒应答, SVR)。如在图1中应答者对比不应答者的热图分析(heat map analysis)所描述，在50种分析的细胞因子中，37种可以可靠地测量。除了IP-10之外(参见下文)，所有细胞因子的基线水平在应答者和不应答者之间没有显著差异。

与不应答者相比，应答者中基线处的平均血清IP-10浓度显著更低(687 ± 68 pg/ml对比1149 ± 85 pg/ml, p<0.001) (图2A)。为了评估IP-10测量的潜在预测值，根据600pg/ml的阈值对患者分级(stratify)，这与在其他早前研究中所应用的类似。[Zeremski, M.,等，Interferon gamma-inducible protein 10: a predictive marker of successful treatment response in hepatitis C virus/HIV-coinfected patients. J Acquir Immune Defic Syndr, 2007. 45(3): 第262-8页 // Butera, D., 等，Plasma chemokine levels correlate with the outcome of antiviral therapy in patients with hepatitis C. Blood, 2005. 106(4): 第1175-82页.  //  Diago, M., 等，Association of pretreatment serum interferon gamma inducible protein 10 levels with sustained virological response to peginterferon plus ribavirin therapy in genotype 1 infected patients with chronic hepatitis C. Gut, 2006. 55(3): 第374-9页  //  Lagging, M., 等，IP-10 predicts viral response and therapeutic outcome in difficult-to-treat patients with HCV genotype 1 infection. Hepatology, 2006. 44(6): 第1617-25页.  //  Narumi, S., 等，Expression of IFN-inducible protein-10 in chronic hepatitis. J Immunol, 1997. 158(11): 第5536-44页.  //  Romero, A.I., 等，Interferon (IFN)-gamma-inducible protein-10: association with histological results, viral kinetics, and outcome during treatment with pegylated IFN-alpha 2α and ribavirin for chronic hepatitis C virus infection. J Infect Dis, 2006. 194(7): 第895-903页]。

79％(26/33)的具有低基线IP-10水平(<600 pg/ml)的个体为应答者（阳性预测值=79％），而64% (43/67)具有高基线IP-10水平(>600 pg/ml)的个体为治疗不应答者(阴性预测值= 64%) (图2B)。总之，这导致基于预治疗血清IP-10水平的预测治疗应答的试验具有52％(26/50)的特异性和86％(43/50)的灵敏度。

基于使用所评估的37种细胞因子的相关性矩阵分析，没有其他细胞因子在基线处与IP-10相关(图3)。注意到，几组细胞因子在基线处彼此相关，但无一与治疗应答相关。重要的是，使用交叉验证模型对这37种细胞因子的分析显示加入到基线IP-10的细胞因子没有改善其应答者相比不应答者的错误分类率(约为30%)。

IL28B基因型与SVR相关联

根据IL28B基因型对患者群体分级显示与治疗应答的显著相关性（似然率χ²；p<0.0012）(图4)，并且CC基因型与高SVR率相关(在CC基因型中SVR为87%)，而TT基因型与不应答者相关(TT基因型中不应答者为75%)。

IP10血清水平和IL28B基因型的累加和独立作用

平均血清IP-10水平在三个IL28B基因型群体中没有显著差异，当CC基因型与结合的CT及TT基因型的群体相比时也没有显著差异（图5）。

然后，根据高于或低于600 pg/ml阈值的IP-10水平对患者进行分级，所述阈值曾在先前的若干研究中使用(参见上文）。然后结合IL28B基因型分析基于预治疗血清IP-10水平的分级。该结合分析的数据列成表格，在图6中提供。

该发现证实通过结合分析IL28B基因型和预治疗血清IP-10浓度，可以显著地改进个体患者对聚乙二醇干扰素和利巴韦林疗法(不)应答的预测性(predictivity)。

更具体而言，IP-10低的CT携带者SVR为79% ，相比之下高IP-10水平为34%。在TT携带者中，也识别到相似的关系(低IP-10的SVR=50%相比高IP-10的SVR=10%)。(见表1)

表1 与疗效结果有关的IL28B基因型和血清IP-10浓度(高于或低于600 pg/ml)的结合分析结果的总表

图7提供了单个分析(IL28B基因型和IP-10水平)和结合分析的比较概况。所实施的一致性χ²检验检查了两个或更多个群体(例如不同的IL28B基因型群体)是否具有共同特征(例如SVR应答)观察结果的相同比率。两种单个分析都能显著地预测治疗应答。然而当结合两种标记，存在明显的累加作用，导致个体患者治疗应答和不应答两者预测值改善。该结合分析导致应答者相比不应答者高度显著的分级。更具体而言，SVR的广义线性建模(SAS proc genmod)(包括IL28B基因型和血清IP-10两者（高于或低于600 pg/ml）作为解释性的变量)证明了在评估持续病毒应答中，IL28B基因型(p<0.0013)和血清IP-10 (p<0.0016)显著的贡献作用，而不存在IL28B和IP-10 (p=0.75)之间的相互作用。

最后，基于血清IP-10水平(作为连续变量)和IL28B基因型(作为类型变量(categorical variable))的SVR应答逻辑回归建模根据血清IP-10水平明显地将应答者和不应答者分开，在应答曲线中存在IL28B基因型依赖性移动(图8)。

总之，这些发现证实在预测对聚乙二醇干扰素和利巴韦林疗法的持续病毒应答中，预治疗血清IP-10水平和IL28B基因型结合的预测值优于每种单独的标记，其具有指导HCV患者个性化用药的前景。

实施例2

在该研究中，在来自VIRAHEP-C群体的272名患者(115名不应答者和157名SVR)的血清样品中测量预治疗IP-10水平。该分析证实在CA和AA患者两者中IP-10同等地预测SVR。然后将预治疗血清IP-10水平和IL28B基因型的组合作为该群体中应答聚乙二醇IFN和利巴韦林的预测物进行评估。

患者和方法

患者 VIRAHEP-C研究为慢性丙型肝炎的聚乙二醇IFN和利巴韦林结合疗法的多中心研究，其设计用来评估基因型1感染的AA和CA之间应答的比率和预测物，并确定对治疗不应答的原因。VIRAHEP-C试验的设计和主要结果已在其他地方报道[Conjeevaram, H.S., 等，Peginterferon and ribavirn treatment in African American and Caucasian American patients with hepatitis C genotype 1. Gastroenterology, 2006. 131(2): 第470-7页]。未曾接受治疗的、感染有基因型1病毒、具有可探测的HCV RNA、且具有慢性HCV的组织学证据的成人适合参与。患者根据自我汇报按种族分为非裔美国人或高加索人，或按族群分为要么西班牙裔或非西班牙裔。所有参与者需要在美国出生。在2002年7月和2003年12月之间，来自全美国8个临床中心的401名患者登记并开始接受治疗。

本研究中，血清样品由来自整个VIRAHEP-C群体的272名患者的亚组获得，其包括157名持续病毒应答者(SVR) (104名CA，53名AA)和115名应答者(34名CA，81名AA)。本研究中所分析的所有样本均按照IRB认可的实验方案获得，据此参与者需要提供书面的知情同意书，包括同意遗传检测的同意书。

治疗 在至少在24周内患者每周接受180μg的聚乙二醇干扰素α-2a(Pegasys, Roche Pharmaceuticals, Nutley, NJ)和每日1000-1200 mg的利巴韦林(Copegus, Roche Pharmaceuticals, Nutley, NJ)。在第24周前HCV RNA转阴的患者继续接受治疗，总共持续48周，然而保持HCV RNA阳性的那些患者停止治疗，并认为是不应答者。该实验的主要终点为SVR，其定义为在停止治疗后至少24周没有检测到HCV RNA。

HCV RNA定量 使用Cobas Amplicor Assay(灵敏度为 50 IU/ml: Roche Molecular Diagnostics, Alameda, CA),在中心实验室实施HCV RNA 测试(SeraCare BioServices, Gaithersburg, MD)。通过Cobas Amplicor Monitor Assay测试所选样品的HCV RNA水平，通过Versant HCV Genotype Assay测试HCV RNA的基因型(Bayer, Tarrytown, NY)。

肝脏组织学 所有的患者在18个月的筛选内均经历肝脏活组织检查，其由中心的病理学家盲读(read blind）。通过使用Ishak氏修改的组织学活性指数（HAI）评分系统对炎症分级并对纤维化分期，从而评估所有活组织检查的丙型肝炎严重程度。

对血清 IP-10进行定量 在开始治疗前，使用市售Quantikine人CXCL10/IP-10免疫测试(R&D 系统)，在基线处测量收集的血清样品中干扰素γ诱导的蛋白质-10 (IP-10)的水平。所有的样品按1:2稀释，并平行重复分析。本测试中IP-10测量值的线性动态范围为8 - 500 pg/ml，检出限为7.8 pg/ml。IP-10浓度高于1000 pg/ml的样品按1:5稀释并重新分析。

IL28B的基因分型 如Thomas等，(Nature, 461:798-802, 2009)所描述，使用ABI TaqMan等位基因区分试剂盒和ABI7900HT Sequence Detection System(Applied Biosystems)，分析IL28B多态性标记rs12979860。对来自我们群体的210名患者的DNA样品进行基因分型。

统计方法 使用JMP 7.0.2或版本 9.1的SAS软件(均来自SAS Institute, Inc)，实施标准的统计分析。IP-10浓度在用于统计测试前作对数变换，以满足分布正态性假设。可公共获得的R软件包(版本 2.8.0)用于评估不同的分类模型（对角线性判别分析、随机森林、支持向量机(support vector machine)和bagging）以及接受者工作特性(ROC)曲线分析。分别使用SAS中proc logistic和proc genmod程序实施拟合逻辑回归模型和广义线性模型。利用用到的统计软件工具或GraphPad Prism 4 (GraphPad Software, Inc)制作图表。

结果

研究群体中的患者

来自VIRAHEP-C群体的157名对抗病毒治疗持续病毒应答者(SVR)和115名不应答者的血清样品包括在本研究内。SVR和不应答者的定义在上一段提供。病毒复发、幸免(breakthrough)或可得的病毒资料少于12周的患者被排除在外。群体由134名AA和138名CA组成。该群体的基线患者特征如下：年龄48.4 ±7.4岁；病毒载量4.6±5.7 X10⁶ IU/ml；血小板计数214±73×10⁶细胞/mm³；丙氨酸转氨酶(ALT)90.9±72.9 IU/l；总胆红素0.70 ±0.35mg/dl；白蛋白4.1 ± 0.40 g/dl；和血细胞比容43.2±3.8 %(所有数据表示为平均值±SD)。该群体包括96名女性和176名男性，且19%的Ishak氏纤维化分数为4-6。我们群体的272名患者中210名的样品可用于IL28B基因分型，其中123名SVR和87名不应答者中111名为CA并且99名为AA。 

基线血清IP-10测量值和治疗应答

在SVR中平均血清IP-10水平显著低于不应答患者(437±31 pg/ml对比704±44pg/ml,p<0.001) (图9A, 表2)。为了评估IP-10测量的潜在预测值，我们根据先前研究使用的600 pg/ml的阈值对患者进行分级。69％(129/188)的具有低基线IP-10水平(<600 pg/ml)的个体为应答者(阳性预测值，PPV = 69%)，而67% (56/83)的具有高基线IP-10水平(>600 pg/ml)的个体为对治疗的不应答者（阴性预测值，NPV = 67%）(图9B)。总之，这导致基于预治疗血清IP-10水平预测对治疗应答的试验具有82% (129/157)的特异性和49%(56/115)的灵敏度。

我们通过计算具有基于ROC曲线分析的最佳区分能力的截断值，从而评估用于识别SVR患者的600pg/ml的IP-10阈值。在我们的数据集中，370 pg/ml的阈浓度显示在预测SVR患者中特异性(80%)和灵敏度(56%)的最优组合。然后，我们测定我们的最优IP-10水平以正确地预测SVR和不应答。550 pg/ml的阈值生产了最高比率的真阳性或真阴性(69%)，这与之前文献中用到的600 pg/ml的截断值充分相关（在我们数据集中预测到68%的真阳性或阴性）。最后，对预治疗IP-10浓度的逻辑回归分析使得SVR概率与在患者个体中测量的特异IP-10水平拟合，并且证实了IP-10高度显著性效果(p<0.0001;图10, 灰色曲线)。

种族对血清IP-10水平的影响

当比较CA和AA的预治疗IP-10血清水平时，在应答者(p=0.75)和不应答者(p=0.97)的单独分析中，观察不到显著差异(表2)。在整个研究群体中观察到的CA和AA之间基线血清IP-10水平的显著差异(p=0.015)最可能通过不平衡的群体构成来解释（相比AA亚组中的40％，CA亚组中IFN疗法应答率为75%）。在CA和AA两者中发现在对IFN疗法的应答者和不应答者之间IP-10血清水平存在高度显著差异(表2)。使用基线IP-10水平的逻辑回归分析得到CA和AA患者的治疗应答曲线(图10)。AA和CA患者的应答曲线揭示了IP-10 (p<0.0001)和种族(p<0.0001)两者的显著影响，但未见IP-10和种族之间的显著相互作用(p=0.08)。

IL28B基因型和治疗应答

在210名基因分型的患者中，30%为CC，49%为CT，21％为TT。在IL28B基因型和治疗应答之间观察到显著关联：相应的SVR率为对CC为87%，对CT为50%，对TT为39%(p<0.0001) (表3)。对于高加索裔美国人，49%为具有91%的SVR的CC，41%为具有67%的SVR的CT，并且10%为具有45%的SVR的TT(p<0.001)。对于非裔美国人，只有9%为具有67%的SVR的CC，58%为具有35%的SVR的CT，并且33%为具有36%的SVR的TT(p=0.20)。

IL28B基因型和预治疗的IP-10水平与治疗应答的关联

不论IL28B基因型，平均血清IP-10水平在高加索人(p=0.27)和非裔美国人(p=0.58)中对所有患者是相似的(图11)。血清IP-10和IL28B基因型之间缺乏关联表明对这两种标记观察到的与SVR的关联性是独立的。使用600 pg/ml的预治疗IP-10水平截断值，血清IP-10 和IL28B基因型两种数据均可得到的患者群体(n=210)的SVR率为：69%，对于那些具有低IP-10水平(<600 pg/ml)的患者而言；35%，对于那些具有高IP-10水平(>600pg/ml)的患者而言(p<0.0001)。

在名义逻辑斯谛回归中对SVR作为IL28B基因型和血清IP-10的函数建模揭示了在预测SVR (χ²=55, p<0.001)中IL28B基因型(p<0.0001)和血清IP-10(p<0.0015)两者显著的累加作用，但是没观察到IL28B 和IP-10 (p=0.66)之间的相互作用。

图12显示了在IL28B基因型群体中基线IP-10水平提供了关于SVR率的附加和独立的信息。更具体而言，基线IP-10水平在IL28B T-等位基因携带者中最有用。CT携带者的总应答率为50%，但对于那些具有低IP-10水平的，SVR为64%，相比之下高IP-10水平的为24%。对于TT基因型，39%具有SVR，其中48%在低预治疗IP-10水平组中，20%在高IP-10组中。基于作为连续变量的血清IP-10水平和IL28B基因型对SVR应答的斯谛回归建模，使得能够根据血清IP-10水平更个体化地预测SVR概率，其中在应答曲线中存在附加和显著的IL28B基因型性移动（图13）。补充的接受者工作特性(ROC)曲线分析(其使得能对预测模型更定量地比较)揭示了单独基于预治疗血清IP-10(0.71)对比IL28B基因型(0.70)的模型的相似的ROC曲线下面积(AUC)值。然而，对于结合两种标记的模型，可达到更高的ROC 曲线下面积(AUC)值(0.80) (图14)。总之，这些数据证实了结合IL28B基因型和预治疗血清IP-10测量值明显地改善了SVR的预测值，特别是在非-CC基因型中。

按照每个种族群体执行分析时，也发现同样显著的趋势(表4)。例如在非裔美国人中，对于CT和TT IL28B基因型，基线IP-10水平的差异更显著。对于低IP-10的CT携带者，SVR为48%，相比之下高IP-10的SVR为17%，然而对于低IP-10的TT携带者，SVR为43%，相比之下高IP-10的SVR为25%。

IL28B基因型和预治疗的IP-10水平与其他基线参数结合预测治疗应答

我们评估除了IL28B基因型和血清IP-10以外，是否还有其他基线参数可显著改进对SVR的预测。在本分析中，我们在逻辑斯谛回归模型中加入了年龄、性别、种族、预治疗病毒载量、Ishak氏纤维化评分、ALT、脂肪变性和组织活性指数。在所选的所有参数中，只有预治疗的病毒载量 (p<0.0001)、IL28B基因型 (p=0.0004)、基线IP-10水平(p=0.0033)和种族(p=0.0011)对模型有显著贡献。任何变量对之间都没有显著的相互作用(对所有的，p>0.1)。当所有变量当作类型变量时(例如IP-10高于或低于600 pg/ml,而非作为连续变量)，得到的广义线性模型包括相同的四种显著变量加上ISHAK氏纤维化评分(图15)。

实施ROC曲线分析以比较包括在这些多变量分析中识别的最显著变量的模型的预测能力(图14)。结合IL28B基因型和血清IP-10模型的AUC(AUC 0.80)明显优于基于单个变量的模型，包括单独基于IL28B基因型的模型(AUC 0.70)。种族和基线病毒载量的加入进一步改进了该模型，虽然获得的改进不多(AUC达到了0.85)。

表2.根据种族和干扰素治疗应答(SVR)分级的HCV患者中预治疗血清IP-10水平(pg/ml)。对整个群体，在CA和AA之间发现了显著差异(p=0.015)，但在应答者或不应答者的亚组中没有发现。

表3. 根据整个群体中IL28B基因型并按照种族群体分级的SVR率。

表4. 根据IL28B基因型和预治疗血清IP-10水平的组合(<600 pg/ml: 低; >600 pg/ml:高)并按照种族群体分级的SVR率(%)。数据表示为% SVR (n SVR/总数 n)。实施似然率χ²分析以测试样品组之间的应答一致性。

附图1-15说明

图1. 热图，其表示在对干扰素α/利巴韦林疗法50名应答(SVR)和50名不应答HCV患者中测量的37种细胞因子的预治疗血清浓度。

图2. 在对IFN疗法应答者相比不应答者中在基线处的IP-10测量值。[A] 与不应答者相比，在对IFN治疗应答的患者中在基线处观察到显著更低的IP-10血清水平(p<0.001)。水平线代表每组的平均值。为了评估IP-10测量值的潜在预测值，根据600pg/ml的阈值对个体进行分级(虚线)。[B] 相比不应答者群体，在应答者中具有高IP-10水平(>600 pg/ml)的受试者比例显著更小(Pearson χ²=16.3, p<0.001)。

图3. 包括在100名HCV患者（预治疗样品）中基线处测量的37种细胞因子的相关矩阵。蓝框表示细胞因子之间的相关性分别为：高于60% (浅蓝)，70% (中蓝)，或80% (深蓝)。红框表示IP-10与其他所有36种细胞因子的相关性（均低于60%）。

图4. 在对IFNα+利巴韦林治疗的应答者和不应答者中IL28B基因型(rs12979860)的分布。数据分别表示为患者数目(n)或应答者或不应答者的百分比(排%)。在附图右侧显示示意图。

图5. 在80名HCV患者中，与预治疗血清IP-10浓度相关的IL28B基因型(rs12979860)。患者按IL28B基因型（左侧）分组，或通过比较CC基因型和CT/TT基因型（右侧）进行分组。没有观察到IL28B基因型相关的显著差异。

图6. 与治疗结果有关的对IL28B基因型和血清IP-10浓度(高于或低于600 pg/ml)的结合分析。该图显示对干扰素α/利巴韦林治疗应答或不应答的每种基因型和IP-10水平的患者的数目(N) (左边表格)和所占的分数（表示为%）。

图7. 比较HCV患者治疗结果预测值的图表总结，其分别基于:单独IL28B基因型(上部表格)、单独IP-10血清水平(中间表格)和IL28B基因型和血清IP-10水平的结合分析。方框中百分数表示SVR应答者在特定的亚组所占的分数。在每个亚组(方框)中患者的总数目在方框右侧显示。

图8. 基于血清IP-10水平将持续病毒应答(SVR)与聚乙二醇干扰素和利巴韦林治疗拟合的逻辑斯谛回归分析的示意图（灰色曲线）。随后，将IL28B基因型添加到模型中，从而产生对每一种基因型(CC: 蓝 CT: 红, TT: 绿)的回归曲线。在每一亚组中患者数目相对小可解释只有血清IP-10贡献显示为本模型中的显著贡献因子(p=0.017)，而非IL28B基因型(p=0.31)或者IP-10与IL28B (p=0.93)之间的相互作用。每名患者样品在该图的上部 (应答者)或底部(不应答者)表示为环圈；而环圈的颜色表示IL28B基因型。

图9. 在应答者(SVR)和不应答者患者中预治疗血清IP-10 (pg/ml)。 (A) IP-10数据的分布图; (B)基于IP-10水平(根据高于或低于600 pg/ml分级)和治疗应答结果的镶嵌图。

图10. 在整个群体中（灰色曲线）或按种族群体分级的(高加索裔美国人：红，非裔美国人：蓝)基于预治疗血清IP-10水平(pg/ml)拟合作为应答者(SVR)概率的逻辑斯谛回归分析的图示。每个患者样本在该图的上部(SVR)或底部(不应答者)表示为环圈。该逻辑斯谛回归模型显示IP-10 (p<0.0001)和种族(p<0.0001)的显著影响，但IP-10和种族(p=0.08)之间不存在显著相互作用。

图11. 在根据(A)高加索裔美国人和(B)非裔美国人的IL28B基因型分级的HCV患者中预治疗血清 IP-10 (pg/ml)。单向ANOVA证实根据IL28B基因型IP-10水平不存在显著差异。

图12. 根据预治疗血清IP-10(高于600 pg/ml相比低于600 pg/ml)和IL28B基因型分级的HCV患者中持续病毒应答(SVR)比率(%)。根据单独血清IP-10或单独IL28B基因型的SVR比率在图表的垂直柱形中示出(白色字体)。对于每个亚组，患者的SVR比率和数目(n SVR/n 总亚群)在方框内示出。似然率χ²分析证实了样品组之间的应答不一致性(χ² = 55; p<0.0001)。

图13. 仅基于血清IP-10水平（灰色曲线），或基于血清IP-10水平(pg/ml)和IL28B基因型(CC:红, CT:绿, TT:蓝)组合的将持续病毒应答(SVR)与聚乙二醇干扰素和利巴韦林治疗拟合的逻辑斯谛回归分析的图示。每个患者样本在该图的上部 (SVR)或底部(不应答者)表示为环圈；而环圈的颜色表示IL28B基因型。该逻辑斯谛回归模型显示IP-10(p<0.0001)和IL28B基因型(p<0.0001)的显著作用，但IP-10 和IL28B基因型(p=0.3)之间不存在显著相互作用。

图14. 在预测对聚乙二醇干扰素和利巴韦林治疗的SVR中,对于预治疗血清IP-10、IL28B基因型、种族、基线HCV病毒载量或这些参数的组合的接受者工作特性(ROC)曲线分析。图解中的数字表示ROC曲线下面积(AUC)统计量，其可用于模型间比较。

图15. 对聚乙二醇IFN和利巴韦林疗法的持续病毒应答(SVR)的预测因子。根据包括如下的逻辑斯谛回归模型计算优势比：IL28B基因型和IP-10的基线（预治疗）测量值、HCV病毒载量、纤维化阶段(ISHAK)、年龄、性别、丙氨酸转氨酶(ALT)、脂肪变性(脂肪分数)和肝门及小叶的组织学活性指数(HAI)。