组织特异性表达的24-脱氢胆固醇还原酶编码重组腺病毒

技术领域

本发明涉及阿尔茨海默症基因治疗法与治疗领域。更具体地，本发明涉及利用基因工程技术构建含有dhcr24基因的复制缺陷型重组腺病毒，以及这些腺病毒载体在将dhcr24基因转移入细胞以及实现DHCR24蛋白在神经细胞等细胞中特异性过表达的应用。制备的重组腺病毒有望在阿尔茨海默症以及糖尿病等疾病的基因治疗中获得肯定的疗效。 

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer Disease，AD)是一种起病隐袭的神经系统退行性疾病，临床上以记忆与认知功能障碍为特征，是老年痴呆病中最常见的类型。有关专家预言，至2025年全世界将有2200 万人口罹患AD；另据估计，2012 年该治疗领域的市场价值可达200亿美元。WHO已将老年痴呆症定为21世纪五大重点疾病之一。寻找治疗老年痴呆症的有效药物，成为世界医学界的研究热点之一。但是由于AD的发病机制尚不明了，目前临床上还没有一种疗效确切的治疗药物。 

20世纪80年代以来出现的“β淀粉样蛋白(Aβ)学说”作为AD的治病病理学说被广泛接受。该学说认为β淀粉样蛋白(Aβ)在脑组织中的沉积可能是阿尔茨海默病发生、发展的中心环节。Aβ是淀粉样前体蛋白(APP)的水解产物。Aβ的增加和聚集所形成的老年斑具有神经毒性，可通过引起氧化应激或者内质网应激导致广泛的神经元变性或死亡。例如Aβ的蓄积能通过直接引发神经细胞内钙离子的释放而诱发内质网应激和神经毒性。因此，凡能减少Aβ产生，加快其清除，或阻止其聚集，或对抗Aβ的毒性引发的氧化应激或内质网应激引起的细胞凋亡的治疗阿尔茨海默病的策略，已经成为目前国际上研究最热门的治疗阿尔茨海默病药物研发方向。但是目前该项研究尚未取得突破性进展，还没有此类药物进入市场。 

近年来，关于AD患者脑内胆固醇代谢的特征及其与AD病程进展的关系的研究取得了很多进展。在脑组织中，胆固醇的作用尤为重要：胆固醇对神经轴突的信号传递、神经生长、修复和重塑起重要作用，神经元载体的功能及突触的发生，成熟及可塑性的维持也都离不开胆固醇的参与。而神经元培养研究显示， 胆固醇水平的减少会抑制树突的延伸和突触的生成， 并认为这可能与tau蛋白(一种与AD发病有关的微管蛋白)的磷酸化有关。正常的脑功能需要恒定的胆固醇水平。脑胆固醇不能从血中摄取，只能由自身合成，其脑内含量与血清胆固醇无关，只与其自身合成量和转出量有关。胆固醇是细胞膜上超微结构脂质筏（Lipid raft）及细胞窖（caveolae）的主要构成成分，参与多数细胞信号转导。研究显示多种神经营养因子作用如NGF、GDNF、EGF 和 FGF 等都需要依赖其受体在脂质筏中的定位而实现。大多数突触生成需要的胆固醇主要来自星型胶质细胞的大量合成，并由含载脂蛋白ApoE的脂蛋白运输到神经元。研究发现ApoE的基因结构具有明显的遗传多态性， 其中ApoE4 (ApoE中HDL新生能及胆固醇供给能最小的基因型) 是迟发性家族性老年性痴呆和散发性老年性痴呆的主要危险因子。ApoE4的基因敲除小鼠突触细胞膜的胆固醇含量比正常组显著增高。而DHCR24是胆固醇合成的最终阶段链甾醇desmonsterol还原为胆固醇过程的关键酶。脑内胆固醇在24S-羟化酶(CYP46)的作用下降解为24S-羟胆固醇，通过血脑屏障，由LDL转运至肝脏代谢。AD患者脑内胆固醇代谢存在明显异常。例如Heverin等指出24S-羟胆固醇的含量在全脑各区均下降，胆固醇／24S-羟胆固醇的比值与之类似，提示AD患者脑内胆固醇含量的降低。尽管有一些证据表明血清胆固醇含量的增加可能增加寡聚Aβ（oligomeric Aβ）的产生和蓄积，但是这种Aβ蓄积反之也会引发胆固醇从神经细胞膜的流失从而导致tau的过度磷酸化及突触可塑性的损伤，提示胆固醇从神经细胞膜的流失很可能是最终导致AD发病的重要因素。由此可见，胆固醇代谢异常几乎与所有重要的AD发病机制有关。因此调节胆固醇代谢合成代谢过程中的某些靶点，将有可能突破AD药物研究的瓶颈，促使新治疗方法的诞生。 

基因疗法是指将健康和正常的基因，通过某种载体，导入人体细胞中有缺损或有变异基因的部份，以替代缺损或变异的基因，从而治疗疾病的一种方法，10多年来，已经不断在新领域取得成功，预计到2010年或2020年，基因疗法将成为一种普通的治疗方法。目前市场上应用基因疗法以治疗AD的药物还没有出现，正在试验中的基因疗法药物也寥寥无几，其根本原因在于AD发病机理的复杂性决定了很难用一种基因的补充达到治疗AD的目的。而本发明的基因疗法的靶点24-脱氢胆固醇还原酶DHCR24，则在近年来神经细胞保护研究方面趋于热点。DHCR24可以从多个方面发挥抗神经细胞凋亡的神经细胞保护作用，其理论依据阐述如下。 

DHCR24是一种具有胆固醇合成作用和抗细胞凋亡作用的多功能蛋白。Greeve等研究发现DHCR24的mRNA水平在AD患者脑部受影响区域（大脑颞叶）显著降低，而且证明DHCR24过表达的神经细胞对β-淀粉样蛋白沉着引起的细胞凋亡有抑制作用（Greeve等人，J. Neurosci，20: 7345，2000）；Crameri A等人利用DHCR24基因敲除小鼠证明DHCR24的缺失通过破坏以胆固醇为主要组成成分的脂质筏（lipid  raft）的成分促进了淀粉样前体蛋白(APP)降解为Aβ，反之DHCR24的过表达通过增加细胞膜胆固醇的含量减少了Aβ的产生，提示hDHCR24依赖性胆固醇合成与维持神经细胞内Aβ的低水平相关（Crameri A等人，EMBO J， 25: 432，2006）；而包括我们自己在内的几个研究小组也在近期先后证明DHCR24可以通过清除过氧化氢或增加胆固醇含量等直接或间接的方式对抗神经细胞的慢性及急性氧化应激（包括Aβ）导致的细胞凋亡（Lu等人，Endocrinology，149: 3267， 2008；Cecchi， C等人，J Cell Mol Med， 2008； Kuehnle，K.等人，Mol Cell Biol，28: 539，2008）；近年来，有研究者提出AD症可以被称为3型糖尿病的观点，持这种观点的研究小组发现AD患者存在胰岛素抵抗的症状及相关的分子生物学病理基础（Craft等人， Neurobiol Aging， 17: 123，1996；Steen，E.等人，J Alzheimers Dis，7: 63，2005）。我们的研究证明胰岛素样生长因子受体的神经细胞保护作用需要其受体在细胞窖中的存在（Lu等人，Exp Cell Res， 314: 342， 2008），而且DHCR24通过维持细胞窖的正常结构在insulin-Akt-Bad生存级联中发挥重要作用（Lu等人，Endocrinology，147: 3123，2006）。最新研究发现雌激素疗法对AD 病人具有的抗忧郁焦虑、扩张改善脑循环、调节炎性反应、恢复神经元功能等神经保护作用，与上调DHCR24表达有关（Benvenuti等人，J Clin Endocrinol Metab， 90: 1775， 2005）。综上，DHCR24可以从减少Aβ产生、对抗由Aβ蓄积产生的细胞应激而诱导的神经细胞凋亡、以及增敏神经细胞的胰岛素信号通路等多个方面发挥神经细胞保护作用，从而使DHCR24基因成为AD治疗的新的靶点。 

发明内容

由于DHCR24是一个在体内多种组织细胞中广泛表达的基因，在考虑以DHCR24为靶点进行阿尔茨海默症的治疗时，为了避免DHCR24过表达在其他组织细胞中可能造成的胆固醇合成过多而产生的副作用，如果能够实现DHCR24在神经细胞的特异性靶向表达，则为首选的治疗策略。因此本发明的第一个目的，在于神经细胞特异性表达启动子驱动下至少含有一个编码24-脱氢胆固醇还原酶DHCR24的异源DNA片段的缺失重组腺病毒或其一种衍生物。其次，由于DHCR24在人体各个组织细胞中表达的广泛性，随着研究的深入，DHCR24将有可能被发现在除神经细胞外的很多组织细胞类型中，通过其胆固醇合成作用以及其自身的活性氧清除作用，发挥重要的类似的细胞保护作用，这暗示了DHCR24在未来治疗以氧化应激或内质网应激等细胞应激为共通分子机制的一些其他常见疾病中作为基因治疗靶点的可能性。因此利用重组腺病毒为载体将DHCR24靶向性地实现组织细胞特异性表达，将有可能成为未来的治疗策略。 

在本发明的意义上，24-脱氢胆固醇还原酶DHCR24的衍生物是指由DHCR24多肽衍生的保持DHCR24胆固醇还原酶功能和抗氧化活性的任何类似物、片段或者突变形式。不同的衍生物可以自然存在，这些衍生物可以是等位基因变异，其特征在于编码DHCR24的结构基因的核苷酸序列的不同，或可以由不同剪接或翻译后修饰得到。这些衍生物可以由一种或多种氨基酸残基经置换、缺失、插入和/或修饰得到。可以采用本领域技术人员已知的任何技术进行这些修饰。 

在本发明范围内产生的DHCR24蛋白或其衍生物可以是cDNA，基因组DNA（gDNA），或一种例如由其中被插入一个或多个内含子的cDNA组成的杂合构建体，还可能涉及合成序列或者半合成序列。有力地，使用cDNA或gDNA序列。特别地，使用gDNA在人的细胞中能更好地表达。 

根据第一个实施方式，涉及人源的DHCR24的编码cDNA序列，为本发明的优选方式。 

用于本发明范围内的腺病毒是重组腺病毒，即含有异源DNA序列的腺病毒。有利地，涉及缺失重组腺病毒，即不能在靶细胞中自主复制的腺病毒。 

对于本发明腺病毒的构建体，可以是人源或者是动物源的。关于人源的腺病毒，优选的可以列举C组的腺病毒，特别是Ad2，Ad5，Ad7或Ad12类腺病毒。在动物源的不同腺病毒中，优选地可以列举犬源腺病毒，特别是所有CAV2腺病毒株（如曼哈顿株或A26/61（ATCC VR-800））。 

腺病毒基因组特别地含有处在每个端部的末端反向重复序列（ITR）、衣壳化的序列，早期基因和晚期基因，主要的早期基因包含在E1、E2、E3和E4区中，其中E1区中所包含的基因对于病毒繁殖尤其是必不可少的。主要的晚期基因包含在L1至L5区中。Ad腺病毒基因组被完全测序，并且基于已知数据是可得到的（具体参见Genbank M73260）。同样地，部分，甚至全部其他的腺病毒基因组（Ad2、Ad7、Ad12）也都被测序。 

正如前面所指出的，本发明的腺病毒存在缺陷，因此在靶细胞中是不能自主性被复制的。为此，曾制备出由腺病毒衍生的不同构建体，同时加入不同的治疗基因。在每一种这种构建体中，该腺病毒被修饰，以便使其在感染细胞中不能复制。于是，在现有技术中描述的构建体是病毒复制必不可少的E1区中缺损的腺病毒，异源DNA序列已插入该区中（Levrero等人，基因（gene）杂志， 101（1991）195；Gosh-Choudhury等人，基因（gene）杂志，50（1986）161）。另外，为了改善载体的性质，曾提出在腺病毒基因组中产生其他缺失或修饰。于是，曾在ts125突变体中导入热敏点突变，这样能够使DNA链的72KDa的蛋白失活（DBP）（Van der Vlier等人，病毒学杂志（J. Virol.， 1975， 15(2)348-354）。 其他载体含有对复制和/或病毒繁殖必不可少的另一区，E4区的缺失。事实上在调节晚期基因表达，在晚期核RNA的稳定性、在消除宿主细胞蛋白表达中和在病毒DNA复制的效率方面都涉及E4区。其中E1和E4区缺失的腺病毒载体因此具有非常低的转录水平和病毒基因表达。这样一些载体是现在通用的腺病毒载体。 

在一个本发明的优选实施方式中，重组腺病毒是C组的人腺病毒。更优选地，涉及Ad2或者Ad5腺病毒。 

有利地，本发明范围内使用的重组腺病毒包含在其基因组的E1区中的一处缺失。更优选地，它包含E1a和E1b区的一处缺失。作为实例，可以列举影响核苷酸454-3328、386-3446、459-3510或357-4020（对于Ad5基因组）的缺失。 

例如可以涉及所述的第三代重组腺病毒，即全部或部分E1或者E4区，以及任选地E3区是缺损的。本发明特定的变化方式由使用带有影响全部或部分下述功能区的缺失的腺病毒构成： 

-E1、E4和E3区，

-E1、E4和E2区，

-E1、E4、E2和E3区，

-上述区以及腺病毒（L1-L5）晚期功能的编码基因的全部或部分，或

-全部病毒编码区。

对于同时不具备晚期功能的腺病毒（最小载体）或全部编码区（没有生气的载体），例如Parks等人在PNAS杂志93（1996），第13565页和Lieber等人在病毒学杂志（J.Virol.）70(1996)， 第8944页中描述过他们的构建。 

包含DHCR24的DNA序列及其上游的神经特异性表达启动子序列（表达盒）可以插入到重组体基因组的不同位点。该盒可以插入E1，E3或E4区，置换缺失的序列或添加。该盒还可以顺式插入在产生病毒必不可少的序列（ITR序列和衣壳化序列）之外的任何其他部位。 

在本发明的意义上，术语表达盒应当理解为是核酸，其可以被插入载体中特定限制性位点的DNA片段；DNA片段还含有编码RNA或目标多肽的核苷酸序列，表达所述有意义序列必需的序列（增强子、启动子、聚腺苷酸化序列）。可以设想DNA片段和限制性位点来保证在转录和/或翻译的适当可读框内插入所述片段。 

在衣壳化细胞系中，即能够在重组腺病毒基因组中反式互补一个或多个不足功能的细胞系，产生这些重组腺病毒。在本领域技术人员已知的衣壳化的细胞系中，可以列举293细胞系，其中一部分腺病毒基因组被整合。更确切地说，293细胞系是含有血清型5腺病毒基因组（Ad5）左端（约11-12%）的肾的人胚细胞系，包含左ITR区、衣壳化区、其中包括E1a和E1b的E1区，pIX蛋白编码区和一部分pIVa蛋白编码区，这种细胞系能够与E1区缺损，即没有全部或部分的E1区缺损重组腺病毒反式互补，还能够产生具有高效价的病毒原种。特别地基于A549人的肺癌细胞（WO 94/28152），或基于人的眼癌(人基因治疗（Hum.Gen.Ther.）(1996)215)，描述了能够与E1区互补的其他细胞系。另外，也描述了能够反式互补多个腺病毒功能的细胞系。特别地，可以列举E1和E4区互补的细胞系等(Yeh等人，病毒学杂志（J.Virol.），第70卷（1996），第559-565页)。和E1与E2互补的细胞系（WO94/28152， WO 95/02697）或适用于生产最小腺病毒的细胞系得到的细胞系，其原因尤其在于他们还表现在这样病毒构建体中涉及的特异性位点重组酶的活性。 

这些重组腺病毒通常是通过在衣壳化的细胞系中导入病毒DNA，接着在约2-3天后溶解细胞得到的（腺病毒循环动力学是24-48小时）。为了实施该方法，导入的病毒DNA可以是完全的重组病毒基因组，该基因组任选地在细菌中或在酵母中构建，在细胞中感染。还可能涉及感染衣壳化细胞系所使用的重组腺病毒。病毒DNA还能够以每个都带一部分重组腺病毒基因组和一个同源区的片段形式导入，在导入衣壳化细胞中之后，他们能够通过在不同片段之间的同源重组重新构建重组病毒基因组。 

在溶解细胞之后，重组腺病毒颗粒可以采用任何已知的技术进行分离，例如氯化铯梯度离心法分离或色谱法或市售腺病毒提取试剂盒进行分离。 

组织特异性表达调节序列。在任何组织特异性表达调节序列例如像启动子或启动子/增强子的控制下，DHCR24的编码基因发挥功能，提供在特异性的组织细胞中靶向表达。 

本发明中列举的神经特异性表达调节序列，是指能够使驱动的靶基因在神经细胞及神经组织中优势表达的调节序列。在可被用于本发明范围内的启动子中，可以列举神经组织特异性启动子，选自神经元特异性烯醇化酶Neuron-specific enolase（NSE）的调节序列（Adrian E. Morelli等人，Journal of General Virology (1999)，80，571-583）以及突触蛋白1 synapsin 1（SYN1）的调节序列（Sherif Boulosa 等人，. brain  research ，2006）。但是本发明不限于神经细胞特异性表达DHCR24重组腺病毒的构建，其他组织特异性启动子或调节序列和DHCR24的DNA序列组成的表达盒都在本发明的限定之列。如在胰岛β细胞中是胰岛素基因调节序列（Hanahan，1985，自然，315:115-122），淋巴样细胞中是免疫球蛋白的表达调节序列（Grosschedl等人，1984，细胞，38:647-658），在肝脏中是活性的白蛋白基因调节序列（Pinkert等人，1987，基因和进展，1:268-276）、活性的甲胎蛋白基因调节序列（Krumlauf等人，1985，分子细胞生物学，5:1639-1648）、活性的a1-抗胰蛋白酶基因调节序列（Kerlsey等人，1987，基因和进展，1:161-171），在骨髓细胞中是活性的b-球蛋白基因调节序列（Mogram等人，1985，自然，315:338-340），在脑少突胶质细胞中是活性的碱性髓磷脂基因调节序列（Readhead等人，1987，细胞，48:703-712），在骨骼肌内是活性的肌球蛋白轻链2基因的调节序列（Sani，1985，自然，314：283-286），和在下丘脑中是活性的促性腺激素释放激素的基因的调节序列（Masonden等，1986，科学，234:1372-1378）。 

在本发明的特别实施方式中，优选地选自突触蛋白1 synapsin 1（SYN）的调节序列的控制下，使用DHCR24编码基因的缺损重组腺病毒。 

附图说明

图1a，是含有PSYN1调节序列与DHCR24cDNA序列的表达盒的构建图； 

图中，图左侧含有DHCR24 cDNA序列的pcDNA3.1A myc his质粒载体为申请者之前构建，详细信息参见申请者发表于美国内分泌学杂志的（Endocrinology，149: 3267，2008）中所描述的。其连入的外源基因DHCR24cDNA序列的N端多克隆位点部位含有KpnI和BstXI酶切位点。图右侧的人源SYN1的启动子调节序列PSYN1来源于人的HEK293细胞的基因组DNA经PCR扩增得到。得到的PCR片段经TA克隆、测序，确定阳性克隆后，所得T载体再行扩增、提取后得到。

图1b，是由图1a所得的含有神经特异性启动子表达盒的质粒载体经Kpn及PmeI酶切后连接入经KpnI与ECOR V双酶切的pshuttle穿梭载体中的构建图； 

图中，PmeI酶切位点与EcoR V的连接为平末端连接。所得含有DHCR24表达盒的穿梭载体再经线性化、电转、挑选阳性克隆后，经由293细胞包装获得最后的重组腺病毒。有关线性化以及电转等详细过程见图2。

图2，是所得pShuttle-PSYN1-DHCR24穿梭载体经PacI酶切线性化后经电转化与预先负荷了腺病毒5型基因组骨架的大肠杆菌中，进行同源重组构建图； 

图中，该腺病毒骨架为E1区与E3区同时缺损型。转化后的克隆经酶切鉴定为阳性的克隆，进一步扩增，并提纯其含有插入了外源基因dhcr24表达盒的重组腺病毒基因组骨架质粒。该质粒再经PacI酶切线性化，所得质粒部分提纯后转染HEK293细胞进行腺病毒包装。

图3，是神经特异性过表达DHCR24的重组腺病毒在各细胞类型中诱导DHCR24表达情况； 

图中，MIN6细胞培养基为含有10%FBS和双抗的高糖DMEM培养基。N2A细胞培养基为含有10%FBS和双抗的DMEM/F12培养基。使用Ad-PSYN1-DHCR24载体以20 moi（感染复数，multiplicity of infection）感染细胞48小时后，收集细胞，提取细胞总蛋白。使用Ad-CMV-DHCR24做对照（以CMV泛表达启动子驱动DHCR24表达的重组腺病毒，详细信息见于Lu等发表于的文献Endocrinology，149: 3267，2008）。然后用蛋白西方印迹技术Western Blotting 检测DHCR24蛋白的表达情况。一抗使用鼠源anti-myc抗体（Cell signaling， myc为DHCR24蛋白C端标签序列）。二抗使用Anti-mouse IgG（Cell signaling）。

图4：Ad-PSYN1-DHCR24的神经细胞保护作用图； 

图中，使用Ad-PSYN1-DHCR24载体以20 moi感染N2A神经细胞，并且以重组腺病毒Ad-CMV-LacZ（LacZ，β-半乳糖苷酶，一种细菌蛋白）做对照。腺病毒感染48小时后，细胞被分别施加200 μM过氧化氢（氧化应激诱导剂），1μg/ml衣霉素（内质网应激诱导剂）以及1μM Aβ_1-40（阿尔茨海默症典型病理因子可导致神经细胞凋亡）刺激，48小时后细胞被分别用相差显微镜照相并计数，统计结果如图所示。

材料与方法 

分子生物学的一般技术

分子生物学中使用的常规方法，例如DNA的制备提取，以氯化铯梯度表示的质粒DNA离心分离，采用琼脂糖或丙烯胺凝胶进行的电泳，采用电洗脱进行的DNA片段纯化，用酚或酚-氯仿提取蛋白，用乙醇或异丙醇在盐介质中沉淀DNA，在大肠杆菌中转化质粒等，都是本领域技术人员熟知的，并且文献做了大量描述。

关于连接，根据DNA片段的大小，采用琼脂糖或丙烯酰胺凝胶电泳分离这些DNA片段，用苯酚或苯酚、氯仿混合物提取，在乙醇中沉淀，然后根据供应商提供的DNA连接酶进行孵育连接。 

根据生产者的说明书，使用PCR仪，采用所述的PCR技术进行DNA片段的酶促扩增获取DNA片段。 

采用Sanger等人研制的方法，使用Amersham提供的试剂盒，确认核苷酸序列（测序）。 

具体实施方式

实施例1：构建表达DHCR24的编码基因（参见Genbank ）的缺损腺病毒。

该实施例描述构建带有DHCR24编码基因的缺损重组腺病毒载体，该基因以基因工程技术与SYN启动子连接。 

首先以HEK293 genome DNA（ATCC CRL-1573）为模板，以Kpn I 以及BstX I酶切位点加入到上下游引物后，经巢式PCR两步扩增得到长度为500bp的SYN1的启动子序列（P SYN1）。 

hSYN1-Ex S:   5-gcctgtgtggatgtgggagactaat-3 

 hSYN1-Ex AS: 5-tgcaggtctgtcatgtacccatttg-3 

 hSYN1-In S-KpnI: 5-ggtacctgacgaccgaccccg-3

 hSYN1-In AS-BstXI: 5ccagtgtggtggggctgcgacttgggg-3 

所得PSYN1的PCR扩增产物经TA克隆、测序，所得阳性克隆经大肠杆菌扩增，DNA提取纯化。纯化后的pGEMT-easy-PSYN1质粒经KpnI及BstXI双酶切后，所得PSYN1片段经琼脂糖胶提纯备用。

然后将含有人的dhcr24的基因序列的cDNA片段连同myc标签序列以及组氨酸标签序列从pcDNA3.1 myc his-DHCR24质粒(Lu等人，Endocrinology，149: 3267，2008)中用KpnＩ和BstXI双酶切。得到的质粒片段与上述所得PSYN1片段由T4连接酶连接，得到重组质粒pcDNA3.1A myc his-PSYN1-DHCR24 (如图1a所示) 。 

将分别由pShuttle质粒载体经KpnI以及EcoRV双酶切后所得质粒片段以及将上述pcDNA3.1A myc his-PSYN1-DHCR24重组质粒由Kpn I和Pme I双酶切后所得外源基因片段经T4连接酶连接，得到pshuttle-PSYN1-DHCR24重组穿梭载体（如图1b所示）。 

得到的穿梭质粒pshuttle-PSYN1-hDHCR24在经Pme I线性化后，电转染至预先负荷了pAdEasy-1腺病毒骨架的大肠杆菌（Agilent Technologies）中，实现同源重组，将带有P SYN1神经特异性启动子和hDHCR24(带有myc和his标签)的表达盒重组到腺病毒的基因组骨架中，得到重组腺病毒骨架质粒。该腺病毒骨架为Ad5型，E1和E3区缺损。经酶切验证后，挑选阳性克隆，大肠杆菌扩增，DNA提纯，得到的大量重组腺病毒骨架质粒由PacI线性化后，在图2中描述了这种构建的原理。由这种重组产生的pAd质粒含有E1和E3缺损5型腺病毒基因组，该基因组还含有PSYN1-DHCR24-myc-his表达盒（如图2所示）。 

通过由293细胞系（ATCC CRL-1573）中被Pac I消化的pAd的DNA感染产生了Ad-PSYN1-hDHCR24腺病毒。得到的病毒颗粒然后在此同样的细胞系中扩增，得到的病毒原种采用氯化铯双梯度进行纯化。 

这些病毒颗粒然后用于研究在神经细胞以及其他细胞系中DHCR24的表达。 

实施例2：在体外由Ad-DHCR24载体感染神经细胞以及其他细胞系中DHCR24基因的表达。

对不同细胞系试验了用Ad-PSYN1-hDHCR24载体感染细胞后DHCR24的表达情况：神经母细胞瘤细胞株（N2A）以及胰岛β细胞株（MIN6）。 

使用Ad-PSYN1-DHCR24载体以20 moi（感染复数，multiplicity of infection）感染细胞48小时后，收集细胞，提取细胞总蛋白。使用Ad-CMV-DHCR24做对照（以CMV泛表达启动子驱动DHCR24表达的重组腺病毒，详细信息见于Lu等发表于的文献Endocrinology，149: 3267，2008）。然后用蛋白西方印迹技术Western Blotting 检测DHCR24蛋白的表达情况。抗体使用anti-myc抗体（myc为DHCR24蛋白C端标签序列）。结果如图3所示，在Ad-CMV-DHCR24转染组，N2A神经细胞以及MIN6胰岛β细胞均显现出过表达，而在Ad-PSYN1-DHCR24转染组，只有N2A细胞显示出过表达，MIN6胰岛β细胞未检测出特异性条带，证明没有外源DHCR24的过表达。我们的结果有力证明，重组腺病毒Ad-PSYN1-DHCR24的转染能够产生特异性地靶向神经细胞的使DHCR24过量表达的作用。 

实施例3：Ad-PSYN1-DHCR24的神经细胞保护作用研究。

使用Ad-PSYN1-DHCR24载体以20 moi感染N2A神经细胞，并且以重组腺病毒Ad-CMV-LacZ（LacZ，β-半乳糖苷酶， 一种细菌蛋白）做对照。腺病毒感染48小时后，细胞被分别施加200μM过氧化氢（氧化应激诱导剂），1μg /ml衣霉素（内质网应激诱导剂）以及1μM Aβ_1-40（阿尔茨海默症典型病理因子可导致神经细胞凋亡）刺激，48小时后细胞被分别用相差显微镜照相并计数，统计结果如图4所示。Ad-PSYN1-DHCR24转染组细胞在三种刺激中，与对照组Ad-CMV-lacZ相比，均表现出较多的存活细胞数，证明DHCR24具有显著的神经细胞保护作用。 

所有这些结果证明： 

1、腺病毒载体是一种对dhcr24基因特别有效的载体；

2、使用这样的载体，在神经特异性启动子的驱动下，可以实现DHCR24蛋白在神经细胞中的靶向性过表达。

使用能够实现神经特异性表达DHCR24的重组腺病毒具有显著的神经细胞保护作用。