一种锌指蛋白基因在调节水稻根系发育中的应用

技术领域   

本发明属于植物基因工程领域。具体涉及一种锌指蛋白基因在调节水稻根系发育中的应用。

背景技术   

根在植物生长发育中具有吸收、固着、输导、合成、储藏和繁殖等重要作用；同时，根也是赤霉素、细胞分裂素和植物碱等一些重要生物活性物质的合成部位，这些物质对植物地上部位的组织细胞生长、器官形态建成有很大影响。因此，根系发育的好坏直接影响着植物的生长发育状况。利用大量的根发育突变体进行研究，目前双子叶植物根发育的分子调控机制已取得了一定的进展。研究表明，生长素、细胞分裂素等植物激素在调节植物根的发育起重要作用，许多影响根系形态发育的基因是通过参与激素信号途径来调控根系发育 (Hirota et al., 2007；Okushima et al., 2007；Kubo et al., 1999;Rogg et al., 2001)。与双子叶植物相比，水稻等单子叶植物根发育的分子调控机制的研究相对落后(Lo et al., 2008; Zhaoet al., 2009)。由于单、双子叶植物根系结构和组成不同，推测控制两者根系发育的分子调控机制可能不完全相同。因此，开展水稻等单子叶植物的分子遗传的研究具有重要意义。

水稻是重要的粮食作物，而根系是水稻的重要营养器官，是决定水稻生长、产量、以及抗性的重要部分。但目前对水稻根系发育分子遗传的研究不多。与双子叶植物一样，目前报道的几个影响水稻根系形态建成的基因中，多数参与了植物激素信号途径从而影响到根系的发育。其中，影响水稻不定根生长发育的WOX11基因可能通过生长素信号途径和细胞分裂途径调控水稻不定根的生长发育(Zhaoet al., 2009)；CRL1（CROWN ROOTLESS 1）是水稻根形态建成的重要因子，该基因突变影响不定根的生长，其表达水平受生长素作用因子调节(Inukaiet al., 2005)。 

C₂H₂型锌指蛋白是一类普遍存在于植物中、具有指状结构域的转录因子，在植物等真核生物基因组中数量多、且分布广泛。尽管目前已有的研究表明，C₂H₂型锌指蛋白对植物的生长发育、抗逆、抗病等方面均起重要作用，但绝大多数锌指基因的具体功能并不清楚。特别是，有关C₂H₂型锌指蛋白基因参与调节植物根系发育的方面的报道还很少。最近，从拟南芥从克隆了一个受Pi饥饿诱导表达的C₂H₂型锌指基因ZAT6。该基因被认为是第一个报道、涉及调节根发育与养分应激反应过程有关的C₂H₂型锌指基因。ZAT6过表达降低了Pi的吸收从而影响根的发育、阻碍幼苗的生长，推测该基因的主要功能是抑制初生根的生长、控制根的结构从而动态调节植物对Pi的吸收 (Devaiah et al., 2007)。此外，玉晓红等（2011）的研究表明，过量表达OsZRL的转基因幼苗因根系不能正常发育而死亡，初步推测OsZRL可能与水稻根系发育有关。 

发明内容  

本发明目的在于提供一种锌指蛋白基因在调节水稻根系发育中的应用，该水稻根系发育控制基因为C₂H₂型锌指蛋白基因OsZPT5-07，该基因能够调节水稻根的发育，这为改良水稻的根部性状提供了新的途径。

本发明的技术方案如下： 

所述锌指蛋白基因为C₂H₂型锌指蛋白基因OsZPT5-07，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示，该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2 所示。

将含有OsZPT5-07基因的过表达真核重组质粒或含有OsZPT5-07基因的RNA干涉表达真核重组质粒转化水稻，获得转基因植株。 

所述过表达真核重组质粒是将OsZPT5-07基因全长编码序列插入到真核表达载体中获得。所述真核表达载体为pTCK303。 

所述RNA干涉表达真核重组质粒是由OsZPT5-07基因片段和真核表达载体构成；所述OsZPT5-07基因片段是位于起始密码子下游335bp至917bp的核苷酸序列，将所述OsZPT5-07基因片段分别以正向和反向插入到真核表达载体中，正向插入的基因片段和反向插入的基因片段之间存在有478bp的内含子序列。 

所述真核表达载体为pTCK303。 

本发明所述控制水稻根系发育的基因命名为OsZPT5-07 (Oryza sativa zinc-finger protein，位于水稻第5染色体上的第7个锌指蛋白基因)，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示，所编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，具有一个C₂H₂型锌指结构域。根据水稻基因组注释的mRNA序列（基因序列名称为 LOC_Os05g20930，从水稻基因组数据库下载获得），利用互联网提供的在线引物设计软件Web-Primer，设计了一对扩增OsZPT5-07基因的特异引物。因该基因无内含子序列，利用PCR技术从粳稻品种日本晴的基因组的DNA中分离到OsZPT5-07的编码序列。 

将含上述基因的过量表达和干涉表达重组质粒转化水稻，获得转基因植株。实验结果表明：与野生型比较，过量表达的转基因阳性植株的根系发达，而降低表达的转基因阳性植株的根系生长明显受到抑制，表明该基因能够调节水稻根的发育，并可在水稻性状改良中应用。 

附图说明   

图1：构建OsZPT5-07基因的过量表达载体UBQ:OsZPT5-07；其中图1中A：OsZPT5-07基因过量载体的结构示意图；图1中B：中间载体pMDT18-T-OsZPT5-07菌液的PCR检测（分子量标记：BM5000，箭头所示为1029bp的目标条带）；图1中C：双酶切检测量表达载体Ubi: OsZPT5-07（Marker：BM5000，箭头所示为1029bp的目标条带）。Hyg: 潮霉素抗性基因; Nos: 一种终止子; UBI-1: 一种启动子; GUS: β-葡萄糖苷酸酶基因; LB, RB: 载体的左、右边界。

图2：构建OsZPT5-07的干扰载体OsZPT5-07-RNAi；其中图2中A：OsZPT5-07的干扰载体的结构示意图；图2中B：中间载体pTCK303-OsZPT5-07-1的双酶切检测（分子量标记：BM2000，箭头所示为0.6kb左右的目标条带）；图2中C：质粒pTCK303-OsZPT5-07的双酶切检测（Marker：BM2000，箭头所示为1.7kb左右的目标条带）。Hyg: 潮霉素抗性基因; Nos: 一种终止子; UBI-1: 一种启动子; GUS: β-葡萄糖苷酸酶基因; LB, RB: 载体的左、右边界；Intron，一种水稻内含子。 

图3：增强OsZPT5-07表达的转基因植株的检测及其表型特征；其中图3中A：转基因植株的潮霉素抗性基因片段的鉴定（Marker：BM5000；1-4：4个转基因株系）；图3中B：半定量RT-PCR检测过量表达转基因植株中OsZPT5-07的表达水平；图3中C：转基因植株的表型。ACTIN：一种水稻基因；wildtype：非转基因水稻。 

图4  抑制OsZPT5-07表达的转基因植株的检测及其表型特征；其中图4中A：转基因植株的潮霉素鉴定（Marker：BM5000；1-6：6个转基因植株）；图4中B：半定量RT-PCR检测2株OsZPT5-07-RNAi植株的表达水平；图4中C：发芽7天的T1代转基因植株与对照的根部形态特征。ACTIN：一种水稻基因；wildtype：非转基因水稻。 

具体实施方式：

下面结合实例，对本发明作进一步说明。

本实施例中所用引物由上海生物工程公司合成，序列测定由北京三博生物科技有限公司完成。各种DNA 聚合酶，限制性内切酶，T4 DNA连接酶，克隆载体pMD18-T-Simple vector，均购自TaKaRa公司，DNA回收试剂盒购自Promega公司。 

实施例1：构建OsZPT5-07基因过量表达载体

用SDS法提取水稻日本晴基因组DNA。因OsZPT5-07基因（基因序列名称为 LOC_Os05g20930，从水稻基因组数据库下载获得）无内含子序列，可用PCR方法从水稻基因组DNA中扩增出该基因的ORF序列。利用OsZPT5-07的基因组序列设计一对引物，以日本晴基因组DNA为模板PCR扩增出长度为1029bp的基因序列并插入到含pTCK303质粒中UBI启动子的下游，构建了如图1中A所示的过量表达载体UBQ:OsZPT5-07。PCR扩增目的基因序列所用的引物是（下划线部分为KpnⅠ和SacⅠ的酶切位点）：

上游引物KpnⅠ：GGGGTACCATGGATCCAGCAAGGTACT

下游引物SacⅠ：CGAGCTC GAAACACGAGTGGTGAATAA。

PCR扩增产物回收后与中间载体pMDT18-T连接，随后转化入大肠杆菌感受态细胞中；挑取转化后的大肠杆菌单菌落培养，菌液经PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳检测显示有一条如图1中B所示的1029bp条带。该序列经测序确认完全正确后，提取中间载体pMDT18-T-OsZPT5-07，用两种内切酶KpnⅠ/SacⅠ同时酶切质粒pMDT18-T-OsZPT5-07和pTCK303，将两者分别用胶回收试剂盒回收。将两种回收产物混匀后于16℃过夜连接后转化入大肠杆菌中。挑取大肠杆菌单菌落培养，后提取质粒pTCK303-OsZPT5-07，用KpnⅠ/SacⅠ双酶切该质粒，琼脂糖凝胶电泳检测显示有一条如图1中C所示的1kb左右的特异条带，说明目的基因已经连入表达载体。提取该质粒，并利用冻融法转入农杆菌EHA105感受态细胞中，挑选出阳性克隆用于水稻遗传转化。

PCR扩增OsZPT5-07基因序列全长的反应体系为：将48ul 超纯水、8ul 10×Buffer、9ul dntp(2.5 mm)、7ul 引物、4ul ExTaq 和4ul 基因组DNA混匀，总体积为80ul。PCR反应程序为：94℃预变性4min，94℃变性1min，65℃退火50s，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸10min，10℃保存。 

所用的酶切体系为：30ul PCR产物或者质粒，8ul 1×L Buffer，KpnⅠ及SacⅠ各3ul，超纯水36ul，总体积80ul，混浴后放于37℃水浴锅保温4-6小时。 

大肠杆菌感受态细胞制备的方法是：接种受体菌DH5α，挑取单菌落于无抗生素的LB液体培养基中37℃摇床培养过夜；取1ml过夜培养菌液于100ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时；将0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷；吸取1.4ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10min；于4℃、5000rpm冷冻离心10min；弃去上清，加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液，重新悬浮细胞，在冰放置30min；4℃、5000rpm冷冻离心10min；弃上清液，加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液，重新悬浮细胞。细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加15% - 20%甘油后于超低温冷冻贮存备用。 

大肠杆菌细胞的热激法转化法是：取出制备好的感受态细胞，放在冰上融化；每100 μl感受态细胞加入约5μl连接产物混匀，在冰上放置20min；将离心管放置42℃水浴，热击60－90秒；快速将离心管转移至冰浴，放置1－2min；每管加400 μl 预热至37℃的LB液体培养基，在37℃摇床温和摇动温育60min；取适当体积均匀涂布于含IPTG、X-gal和抗生素的LB平板；倒置培养皿，于37℃培养12－16小时即可观察到转化菌落。 

质粒DNA提取方法是：取含有质粒的大肠杆菌菌液于LB培养基上37℃过夜培养；用接种针挑取单菌落，接种于含有抗生素的LB培养基中，37℃摇床~200 r/min过夜培养；吸取1.5 ml菌液至离心管中，12000 g离心1min，收集菌体，倒掉菌液；加入120 μl溶液 I振荡打匀，重新悬浮细胞，震荡混匀，冰上放置2－3min；加入240 μl溶液II，轻柔颠倒混匀，冰上放置5min；加入180 μl溶液III颠倒混匀，放置于冰上5min；12000 g离心5 min；将上清夜转移至另一干净离心管中，加入等体积的苯酚氯仿抽提溶液中的蛋白等杂质。室温离心3min，再将上清液转移至另一干净的离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，－20度下放置20min；12000 g 常温离心5min；倒尽上清，加75％乙醇浸洗；12000 g 常温离心5min；超净台上风干DNA；根据实验的目的加入10－20μl RNase A的水溶解，37°C消化半小时，质粒于-20℃保存备用。 

根癌农杆菌EHA105感受态细胞制备方法是：挑取单菌落接种于5ml含rif的YEB液体培养基中，28℃，振荡培养过夜；取2ml菌液转入50mlYEB液体培养基中，继续培养至OD值为0.3-0.4；转入无菌离心管，冰浴30min；5000rpm离心5min，去上清；加入1ml 20mmol/LCaCl2重悬菌液；5000rpm离心5min，去上清；加入200μl 20mmol/L CaCl2重悬菌液, 细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂后超低温冷冻贮存备用。 

农杆菌细胞的冻融法转化方法是：取5 μl纯化的质粒DNA，加入200μl感受态细胞，混匀；冰浴15min，转入液氮冷冻1min，迅速置37℃水浴温浴5min；加入600μlYEB液体培养基，28℃，250r/min预表达4-5h；取适当体积均匀涂布于含有抗生素YEB平板；28℃培养2天，即可观察到转化子。 

实施例2：构建OsZPT5-07基因干涉表达载体

利用OsZPT5-07的基因组序列设计出两对含不同酶切位点的特异引物，以日本晴基因组DNA为模板PCR扩增出两段OsZPT5-07基因的干涉表达片段，将这两段基因组序列分别以正向和反向连接的方式插入到pTCK303质粒中一段水稻内含子的两侧，构建了如图2中A所示的OsZPT5-07基因的干涉表达载体OsZPT5-07- RNAi。PCR扩增正向和反向连接片段所用的引物分别是（下划线部分分别为KpnⅠ/BamHⅠ和SpeⅠ/SacⅠ的酶切位点）：

正向连接:  GGGGTACCGCCAAACCAAAACTACATGA

CGGGATCCTCTAGTTCTTCAACCGAGGA，

反向连接:  GGACTAGTGCCAAACCAAAACTACATGA

CGAGCTC TCTAGTTCTTCAACCGAGGA。

以日本晴基因组DNA模板和正向连接序列引物PCR扩增出582bp的OsZPT5-07正向连接片段。用KpnⅠ/BamHⅠ同时双酶切PCR产物及pTCK303载体。将两者用胶回收试剂盒分别回收后，回收产物按照一定比例混匀、于16℃过夜连接后转化入大肠杆菌中。挑取大肠杆菌单菌落培养后提取质粒，用KpnⅠ/BamHⅠ双酶切后电泳检测结果显示有一条如图2中B所示的580bp左右的条带，表明OsZPT5-07的干扰片段已经正向连接入载体pTCK303中，暂将该中间载体命名为pTCK303-OsZPT5-07-1。 

以日本晴的基因组DNA模板和反向连接序列引物PCR扩增出582bp的 ZOS5-07序列。用SpeⅠ/SacⅠ同时双酶切该PCR产物和中间载体pTCK303-OsZPT5-07-1。将两者用胶回收试剂盒分别回收后，将两种回收产物按照一定比例混匀、于16℃过夜连接后转化入大肠杆菌中。挑取大肠杆菌单菌落摇菌培养后提取质粒，用BamHⅠ/SacⅠ双酶切后电泳检测结果显示有一条如图2中C所示的1.7kb左右的条带（包括两段OsZPT5-07的干扰片段和pTCK303质粒上原有的一段水稻内含子序列），表明OsZPT5-07的干扰片段已经反向连接入中间载体pTCK303-OsZPT5-07-1中。至此，两段OsZPT5-07的干扰片段分别以正向和反向连接入pTCK303质粒中，提取该质粒并转入农杆菌EHA105中，挑选出阳性克隆用于水稻遗传转化。

扩增OsZPT5-07干扰片段的PCR反应体系是：将48ul超纯水、8ul 10×ExTaq Buffer、9ul dntp（2.5 mm）、7ul引物、4ul ExTaq酶和4ul基因组DNA充分混匀，总体积为80ul。PCR反应程序为：94℃预变性4min，94℃变性1min，65℃退火30s，72℃延伸40s，32个循环，72℃延伸10min，10℃保存。 

所用的酶切体系为：30ul PCR产物或者质粒，8ul 1×L Buffer，每种内切酶3ul， 无菌水 36 ul，总体积80ul。混匀后放于37℃水浴锅保温4-6小时。 

质粒DNA的提取、大肠杆菌感受态细胞制备和与热激法转化、根癌农杆菌EHA105感受态细胞制备与冻融法转化的方法同实施例1。 

实施例3：过量表达和干涉表达重组质粒转化水稻

⑴水稻遗传转化：

将粳稻品种中花15的种子放入50ml的三角瓶中，用70%的乙醇消毒2分钟后加入3%的次氯酸继续消毒灭菌25min；种子用无菌水清洗2-3次后转入无菌的滤纸上于超净工作台上晾干；将种子接到NB培养基上，每皿以15～20粒为宜，置于27°C恒温箱中暗培养2周；将种子长出的芽和根掐掉，留下的愈伤组织经过1-2次继代培养；挑选生长迅速、颜色鲜黄、表面光滑、质地致密、直径大小为2-3mm的胚性愈伤组织颗粒用于遗传转化。

将挑选出的愈伤组织置于27℃预培养3～5天；分别将活化好的带有过量表达和干涉表达重组质粒的农杆菌EHA105悬浮于添加有100uM乙酰丁香酮的AMM液体培养基中，于超净台中混匀后静置1～2h形成农杆菌悬浮液；将预培养3～5天的愈伤转入农杆菌悬浮液中，30min后倒掉菌液，将愈伤组织置于无菌纸上晾干后转入添加有100uM乙酰丁香酮的NB培养基上，于25℃条件下暗培养3天；用含潮霉素和抗生素的无菌水将愈伤组织经表面的农杆菌洗脱后置于在含有30 mg/L 潮霉素的筛选培养基上培养15天，后再重复筛选培养一次； 30天后，将筛选出的愈伤组织转至含有50 mg/L 潮霉素的筛选培养基上继续筛选一周。将继续增生分裂的抗性愈伤转入分化培养基上于光照条件下培养，一周后愈伤开始转绿，三周后开始长出幼芽和根，当芽长至2-3cm时，移至1/2MS培养基上；待幼苗在生根培养基上生长10天、在水中炼苗3天后再移至大田。 

⑵增强OsZPT5-07表达的转基因植株表型

利用农杆菌介导法将OsZPT5-07基因过量表达的重组质粒转化中花15后分化出23个T₀株系。提取叶片的DNA，用潮霉素抗性基因的特异引物对T₀株系进行PCR检测（转基因水稻能扩增出780bp的片段）。结果显示有18个T₀株系能扩增出一条如图3中A所示的780bp左右的特异条带，说明这18个T₀株系就是转基因植株，按单株收获其种子。同时，提取这些转基因T₀植株根系的RNA，用半定量RT-PCR分析OsZPT5-07在转基因水稻中的表达水平。结果如图3中B所示，所有检测的转基因植株中OsZPT5-07的表达水平明显增强。

用于检测转基因水稻的PCR扩增潮霉素抗性基因片段的引物是：上游引物为 ATGCCTGAACTCACCGCGAC，下游引物为CTATTCCTTTGCCCTCGGAC。PCR扩增的体系为：超纯水13 ul，10×ExTaq Buffer2ul，2.5 mm dNTP 0.4ul，引物1.6ul，ExTaq 酶0.2ul，基因组DNA 1.6ul。PCR反应程序为：94℃预变性4min，94℃变性1min，68℃退火40s，72℃延伸40s，32个循环，72℃延伸10min，10℃保存。 

半定量RT-PCR分析方法是：用TRIZOL法(Invitrogen) 提取水稻幼根中的总RNA。用SYBR^R Primescript^TM RT-PCR kit将总RNA反转录成cDNA，稀释10倍后用于半定量RT-PCR分析，并以ACTIN基因作对照。半定量RT-PCR分析所用OsZPT5-07基因的引物序列是：上游引物为GCCAAACCAAAACTACATGA，和下游引物为TCTAGTTCTTCAACCGAGGA；半定量RT-PCR分析所用ACTIN引物序列是：上游引物为CCAGATCATGTTTGAGACCT，下游引物为GTACCACCACTGAGAACGAT。 

为了观察OsZPT5-07过量表达对水稻根系发育的影响，将6个转基因T₁株系的种子发芽后用自来水于28℃光照培养箱中进行水培；一周后每个株系选取生长基本一致的植株，换用营养液继续培养2周。同时提取幼苗叶片DNA，用潮霉素特异引物进行PCR鉴定，将T₁株系中的植株区分为转基因植株与非转基因植株。结果如图3中C所示，转基因水稻幼苗的根系生长明显旺盛，其主根的平均长度比对照长～3cm（转基因幼苗的主根长度平均5.52±0.87cm，非转基因幼苗主根长度平均2.55±0.69cm），而且侧根的数量也比对照明显增多。表明增强OsZPT5-07的表达明显促进了稻幼苗的根系的生长。 

⑶减少OsZPT5-07基因表达的转基因植株表型

利用农杆菌介导法将干扰OsZPT5-07基因表达的重组质粒转化中花15后分化出37个T₀株系。提取叶片的DNA，用潮霉素抗性基因特异引物对这些T₀株系进行PCR检测。结果显示有21个T₀株系能扩增出一条如图4中A所示的780bp左右的特异条带，说明这21个T₀株系就是转基因植株，按单株收获其种子。同时，提取这些转基因T₀植株根系的RNA，用半定量RT-PCR分析OsZPT5-07在转基因水稻中的表达水平。结果如图4中B所示，所有检测的转基因植株中OsZPT5-07基因在根系中的表达量明显下降。转基因植株的鉴定和OsZPT5-07基因表达水平的半定量RT-PCR分析方法与上述⑵相同。

为了观察干扰OsZPT5-07表达对水稻根系发育的影响，将21个转基因T₁株系中的8个株系的种子发芽后用自来水于28℃光照培养箱中进行水培。从发芽后3天起，每隔2天记录单株的幼苗的根部形态。同时，提取幼苗叶片DNA，用潮霉素特异引物进行PCR鉴定，将T₁株系中的植株区分为转基因植株与非转基因植株。结果如图4中C所示，降低ZOS5-07表达的转基因水稻幼苗的根系生长明显受到抑制。其中，发芽后7天的转ZOS5-07-RNAi幼苗根平均为4.18±0.57㎝，比对照非转基因幼苗主根（平均为6.43±0.81㎝）短～2cm（图3中C）；同时，转基因水稻幼苗侧根的数目和长度也比对照明显减少。表明降低OsZPT5-07表达明显抑制了水稻幼苗根系的生长。 

参考文献：

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<170>  PatentIn version 3.3

<210>  1

<211>  1029

<212>  DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<400>  1

atggatccag caaggtactg gatcttggcc aggaggaagc tgggagatca gaaggcgcct     60

ctcttcccca cccctcacat caccatcggc gccggcggca gctccacctc ctactacgag    120

tcatgggagg aacgtgcctt cgcggaagac tccgcagggc atctcggggg ctgcatctgg    180

ccgccgaggt cctactcctg cagcttctgc ggccgtgagt tccggtcggc gcaggcgctg    240

ggcgggcaca tgaacgtcca ccggagggac cgggcaaggc tcaagctctc tggggttgtg    300

gaggacggca ccggcggcga aagccacggc atgccgccaa accaaaacta catgatacaa    360

ccatgccctc cccaaattgg caccctgcag cacgcctaca gcccaaaccc tagaagtggc    420

agtattctcg ctgctgacac taaccctaat tccatatgtg atgttgtcgc gtaccctgct    480

agatccttgc ttcaagttgc agctgctaga actgccttgg gcaaacaagt cctgaacgcc    540

cctcttgtct catcgaagtc gccgtcggct ggtagagaac atggtaagag ggagacgttg    600

tttcttggtg ctgttcgatt ggcacaggat catgacacgg tgagttctaa tcttgacctg    660

cgtgttggga aaaatgaatt gaagataact actgttttgg ggtgccgatc aagaagggac    720

tttatgtacg ataacgaccg cgcggatgat gaaaagactg ttgaagcaag tcacaagaaa    780

agaagaatcg atttggaggt aaaccccctg attctaactt cttcaaccag taatcatcaa    840

cagcaagatg gtggtgatga ccaacatcat gaaaagatac taaaacttta tcgtagctcc    900

tcggttgaag aactagatct tgagcttaga ctcggggaag ccccaaaaga acagtagatt    960

tcatatccac tgttgtatct caacttgatt acaaatgttt aatttgtatt tattcaccac   1020

tcgtgtttc                                                           1029

<210>  2

<211>  318

<212>  PRT

<213> 水稻（Oryza sativa）

<400>  2

MET Asp Pro Ala Arg Tyr Trp Ile Leu Ala Arg Arg Lys Leu Gly

                    5                       10                     15

Asp Gln Lys Ala Pro Leu Phe Pro Thr Pro His Ile Thr Ile Gly

                    20                      25                     30

Ala Gly Gly Ser Ser Thr Ser Tyr Tyr Glu Ser Trp Glu Glu Arg

                    35                      40                     45

Ala Phe Ala Glu Asp Ser Ala Gly His Leu Gly Gly Cys Ile Trp

                    50                      55                     60

Pro Pro Arg Ser Tyr Ser Cys Ser Phe Cys Gly Arg Glu Phe Arg

                    65                      70                     75

Ser Ala Gln Ala Leu Gly Gly His MET Asn Val His Arg Arg Asp

                    80                      85                     90

Arg Ala Arg Leu Lys Leu Ser Gly Val Val Glu Asp Gly Thr Gly

                    95                     100                    105

Gly Glu Ser His Gly MET Pro Pro Asn Gln Asn Tyr MET Ile Gln

                   110                     115                    120

Pro Cys Pro Pro Gln Ile Gly Thr Leu Gln His Ala Tyr Ser Pro

                   125                     130                    135

Asn Pro Arg Ser Gly Ser Ile Leu Ala Ala Asp Thr Asn Pro Asn

                   140                     145                    150

Ser Ile Cys Asp Val Val Ala Tyr Pro Ala Arg Ser Leu Leu Gln

                   155                     160                    165

Val Ala Ala Ala Arg Thr Ala Leu Gly Lys Gln Val Leu Asn Ala

                   170                     175                    180

Pro Leu Val Ser Ser Lys Ser Pro Ser Ala Gly Arg Glu His Gly

                   185                    190                     195

Lys Arg Glu Thr Leu Phe Leu Gly Ala Val Arg Leu Ala Gln Asp

                   200                    205                     210

His Asp Thr Val Ser Ser Asn Leu Asp Leu Arg Val Gly Lys Asn

                   215                    220                     225

Glu Leu Lys Ile Thr Thr Val Leu Gly Cys Arg Ser Arg Arg Asp

                   230                    235                     240

Phe MET Tyr Asp Asn Asp Arg Ala Asp Asp Glu Lys Thr Val Glu

                   245                    250                     255

Ala Ser His Lys Lys Arg Arg Ile Asp Leu Glu Val Asn Pro Leu

                   260                    265                     270

Ile Leu Thr Ser Ser Thr Ser Asn His Gln Gln Gln Asp Gly Gly

                   275                    280                     285

Asp Asp Gln His His Glu Lys Ile Leu Lys Leu Tyr Arg Ser Ser

                   290                    295                     300

Ser Val Glu Glu Leu Asp Leu Glu Leu Arg Leu Gly Glu Ala Pro

                   305                    310                     315

Lys Glu Gln

<210>  3

<211>  27

<212>  DNA

<213> 人工序列

<400>  3

ggggtaccat ggatccagca aggtact                                         27

<210>  4

<211>  27

<212>  DNA

<213> 人工序列

<400>  4

cgagctcgaa acacgagtgg tgaataa                                         27

<210>  5

<211>  28

<212>  DNA

<213> 人工序列

<400>  5

ggggtaccgc caaaccaaaa ctacatga                                        28

<210>  6

<211>  28

<212>  DNA

<213> 人工序列

<400>  6

cgggatcctc tagttcttca accgagga                                        28

<210>  7

<211>  28

<212>  DNA

<213> 人工序列

<400>  7

ggactagtgc caaaccaaaa ctacatga                                        28

<210>  8

<211>  27

<212>  DNA

<213> 人工序列

<400>  8

cgagctctct agttcttcaa ccgagga                                         27

<210>  9

<211>  20

<212>  DNA

<213> 人工序列

<400>  9

atgcctgaac tcaccgcgac                                                 20

<210>  10

<211>  20

<212>  DNA

<213> 人工序列

<400>  10

ctattccttt gccctcggac                                                 20

<210>  11

<211>  20

<212>  DNA

<213> 人工序列

<400>  11

gccaaaccaa aactacatga                                                 20

<210>  12

<211>  20

<212>  DNA

<213> 人工序列

<400>  12

tctagttctt caaccgagga                                                 20

<210>  13

<211>  20

<212>  DNA

<213> 人工序列

<400>  13

ccagatcatg tttgagacct                                                 20

<210>  14

<211>  20

<212>  DNA

<213> 人工序列

<400>  14

gtaccaccac tgagaacgat                                                 20