水稻MYB家族转录因子OsMYB84基因编码序列及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种在水稻中表达的MYB家族转录因子OsMYB84基因编码序列及其应用。具体包括：MYB家族转录因子OsMYB84基因的核苷酸编码序列的克隆，序列的同源比对，表达载体构建，对水稻此基因内源的不同器官、组织的空间表达模式，低温、干旱、高盐胁迫以及植物激素处理后的表达模式变化进行分析鉴定，以及转化此基因于水稻Nipponbare（Oryza sativa Japonica）内，进行分子鉴定和胁迫实验，检测其基因表达量变化及抗性改变等。

背景技术

转录因子又称反式作用因子，是指能与真核基因启动子区域中的顺式作用元件发生特异结合，通过它们之间以及与其他相关蛋白之间的相互作用，激活或抑制转录，从而保证目的基因以特定的强度、在特定的时间与空间表达的蛋白质分子（刘蕾等，2008）。

MYB家族转录因子广泛存在于高等植物中，是植物中最大的转录因子家族之一。MYB转录因子以其N端特有的MYB保守结构域而得名，MYB结构域是1段约51~52个氨基酸的肽段，由一系列高度保守的氨基酸残基和间隔序列组成，每个MYB结构域折叠成螺旋一转角一螺旋（HTH）空间结构，其中含有3个色氨酸残基，这3个残基被18～19个氨基酸残基隔开，起着疏水核心的作用（Zhong Rui-qin et al, 2007）。MYB转录因子一般有三个保守的功能域组成（Framton J. et al, 2004），其中DNA结合结构域最为保守，一般包含1~3个不完全重复序列（R）。根据重复片段的大小，通常可以把MYB转录因子分为单一MYB结构蛋白（R1/R2），2R蛋白（R2R3）和3R蛋白（R1R2R3）。其中，含2个MYB结构域的MYB蛋白占绝大多数（Jin H, 1999）。

目前已在拟南芥、玉米、水稻等真核生物中发现存在着大量的MYB转录因子。例如，拟南芥中已发现大约130个成员（Stracke R, 2001），玉米中大约有100个成员（Rabinowicz PD et al, 1999）等，新的MYB家族成员也在不断地发现中。

MYB家族转录因子作用广泛。它们参与植物对环境因子，如干旱（Cominelli E et al, 2005）、低温（Vannini C et al, 2004）、高盐（Dai X et al, 2007）等的应答，也参与一些激素，如脱落酸（Abe H et al, 2003）、水杨酸（Raffaele S et al, 2006）等的响应，并参与植物次生代谢的调控（Gong ZZ et al, 1999）、抗病菌的调节（Vailleau F et al, 2002）等，从而对细胞分化、器官的形成、植物叶片的形态建成等（Singh K et al, 2002）具有重要的调节作用。

发明内容

本发明的目的在于提出一种新的水稻基因，还提供该水稻基因的蛋白编码序列，并提供该水稻基因的应用。

本发明提供的水稻中表达的MYB家族转录因子OsMYB84基因编码序列及其应用，具体包括：MYB家族转录因子OsMYB84基因的核苷酸编码序列的克隆，序列的同源比对，表达载体构建，对水稻此基因内源的不同器官、组织的空间表达模式，低温、干旱、高盐胁迫以及植物激素处理后的表达模式变化进行分析鉴定，以及转化此基因于水稻Nipponbare（Oryza sativa Japonica）内，进行分子鉴定和胁迫实验，检测其基因表达量变化及抗性改变等。

本发明通过克隆水稻脂MYB家族转录因子基因OsMYB84，对其时空表达模式及胁迫响应方式进行确定，结果显示基因在各个器官中组成型表达。在接受ABA和6-BA激素处理后，OsMYB84的表达量上升；盐胁迫处理1天、干旱处理4天后，OsMYB84的表达量上升；在IAA、KT、 GA激素、低温和JA处理后，OsMYB84的表达量并没有变化。将OsMYB84转入水稻Nipponbare（Oryza sativa Japonica）中后，观察到转基因株系株高变矮，以及对ABA的敏感程度与高盐耐性的改变，这为水稻在高盐土壤环境下生存并最终为产量提高提供基因来源与技术支持。

本发明首先从水稻中克隆出一种新的MYB家族转录因子基因，命名为OsMYB84。为具有特定序列的DNA分子，其中开放阅读框为966bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供这种水稻OsMYB84蛋白编码序列，有321个氨基酸残基，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示，与其他物种中MYB家族基因中的成员进行同源性比对。

本发明还提供用于调取获得水稻样品中基因OsMYB84的一对核苷酸引物。该引物根据基因OsMYB84设计，使用此对引物对水稻样品cDNA进行PCR扩增可获得长966bp的基因片段。具体的引物序列为：

Forward Primer：5'GAGATAGAGGATAACCCAC 3'  （SEQ ID NO.3）

Reverse Primer：5'AAGAGAGTAGAGGAAAATA 3'  （SEQ ID NO.4）

本发明提供了一种检测水稻基因OsMYB84在不同器官表达模式的方法，即利用所述基因OsMYB84的核苷酸序列作为设计探针引物的保守区段，调取其序列的引物序列：

Forward Primer：5'AGGAATTCGTTTGCCCTAATAACGCTG3' (EcoRⅠ)（SEQ ID NO.7）

Reverse Primer：5'CGTCTAGATGAAGACACCTGGAAAAT3'  (XbaⅠ)（SEQ ID NO.8），

对水稻cDNA样品进行Real-timePCR, 然后检测该基因在花、茎、叶、根中的表达；样品为水稻的RNA 经过逆转录后所得cDNA；其步骤如下：

（1）提取水稻器官的总RNA(Trizol，市售)。

（2）利用反转录试剂盒（市售）将总RNA反转录成cDNA ，根据SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8设计引物，根据SEQ ID NO.1，跨越ORF区和3`UTR的268bp作为PCR产物，进行实时定量PCR检测。

本发明提供了一种检测水稻基因OsMYB84在高盐、低温、干旱胁迫以及激素处理下的表达模式变化的方法，即将水稻进行高盐、低温、干旱胁迫以及激素处理后，提取水稻叶片中的RNA；利用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，利用引物SEQ ID NO.7与SEQ ID NO.8，进行定量PCR检测。其步骤如下：

（1）将两周大的水稻苗置于200μM氯化钠溶液中，28oC培养1d、4d以进行高盐胁迫处理；置于水中，4oC培养1d以进行低温处理；置于10μM IAA、10μM KT、50μM ABA、5μM GA、10μM 6-BA中，28oC分别培养24h以进行激素处理；置于10%PEG中，28oC培养1d、4d以进行干旱胁迫处理；置于100μM JA中，28oC培养1d进行处理；置于水中，28oC培养1d、4d作为对照。

（2）提取前述个处理的水稻苗的叶和根中的总RNA(Trizol，市售)。

（3）利用反转录试剂盒（市售）将总RNA反转录成cDNA ，根据SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8设计引物，根据SEQ ID NO.1，跨越ORF区和3`UTR的268bp作为PCR产物，进行实时定量PCR检测。 

本发明提供了一种构建pCAMBIA1304 -OsMYB84表达载体的方法，其步骤如下：

（1）以pCRBlunt-OsMYB84载体质粒为模板，利用：

Forward Primer：5'CGCAGATCTAGGAGATAGAGGATAACCCAC 3'(BglⅡ)

（SEQ ID NO.5）

Reverse Primer：5'CACTAGTCTGCATCCCGAGGTCAG 3'(SpeⅠ)（SEQ ID NO.6）

设计引物，克隆出含有SEQ ID NO.1的序列；

（2）将上述序列构建到pCAMBIA 1304载体中，酶切位点分别为5'- BglⅡ，3' -SpeⅠ。经转化，进行阳性克隆的PCR验证。

本发明提供了一种检测转入外源OsMYB84基因的水稻与野生型水稻对ABA激素胁迫敏感程度改变的方法，其步骤如下： 

（1）转基因株系与野生型的种子经消毒液处理，无菌水清洗，置于无菌操作台晾干后，将其转移至添加3μM ABA以及未添加ABA的MS培养基上，同时置于28oC培养箱培养；

（2）观察统计每天实验组与对照组的发芽率情况，并在第8天时，观察并测量转基因株系与野生型株系的株高，取株高相对值做比较；

本发明提供了一种检测转入外源OsMYB84基因的水稻与野生型水稻对盐胁迫的抗性改变的方法，其步骤如下：

（1）28oC培养两周大的转基因幼苗与野生型幼苗对照组分别放至正常培养液以及添加200mM NaCl的培养液中培养；

（2）15h后，观察处理组与对照组的表型差异，测量转基因幼苗与野生型幼苗在两种培养条件下的电导率（电导率仪：上海精科，雷磁DDS-307），并且将在NaCl溶液中培养的幼苗用正常培养液恢复培养；

（3）恢复培养5d后，观察处理组与对照组恢复后的表型差异，测量转基因株系和野生型株系的茎、根以及整株鲜重，并取相对值比较；

本发明中，可选用本领域已经知道的各种载体，如市售的载体以及质粒。

可见，本发明提供的水稻基因OsMYB84可用于植物品种改良，如用于改善水稻抗高盐、低温、干旱胁迫、激素胁迫的等性能，从而提高水稻产量。

附图说明

图1对OsMYB84推测编码氨基酸序列及其同源序列进行氨基酸序列相似性分析。

图2最小进化法对不同物种中MYB家族基因氨基酸序列的进化分析。

图3水稻OsMYB84的表达模式分析。其中，图3a为OsMYB84在水稻不同器官中的表达谱；图3b为不同激素处理后OsMYB84的表达谱；图3c为不同胁迫处理条件下OsMYB84的表达谱，其中ck为对照，PEG1d，4d为PEG处理后1天和4天；NaCl1d，4d为NaCl处理后1天和4天；4oC1d、JA1d 为4oC低温处理1天和JA处理1天。

图4 OsMYB84转基因水稻的分子鉴定。 其中，OX1-4为35S：OsMYB84过表达的四个株系。

图5转基因株系与野生型水稻的株高比较。OX1为两周大的转OsMYB84基因水稻株系；WT为野生型水稻幼苗。图5上为OX1与WT照相；图5下为OX1与WT的株高测量。

图6ABA处理后转OsMYB84基因水稻株系OX1与野生型水稻WT的种子萌发率。其中，图6a为OX1与WT萌发8天后的平皿照相；图6b为OX1与WT连续5天的萌发率；图6c为OX1与WT在萌发第8天后的相对株高。

图7转OsMYB84基因水稻株系OX1与野生型水稻WT幼苗的高盐抗性分析：为200mM NaCl处理前、处理15h、恢复2d后表型分析；

图8转OsMYB84基因水稻株系OX1与野生型水稻WT幼苗的高盐抗性分析：图8a为图7中15h后未处理及盐胁迫处理OX1与WT的相对电导率分析；图8b图7中恢复2d后OX1与WT的相对茎鲜重、相对根鲜重以及整株的相对鲜重的测量。

图7、图8中CK为对照组，未添加NaCl；Salt为实验组，添加200mM NaCl。

具体实施方式

下面结合具体实施实例进一步阐释本发明。应理解，这些实例仅以用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实例中未注明具体的实验方法，均可按照常规方法进行。如Sambrook等分子克隆：实验手册（New York: Cold Spring Harbor  Laboratory  Press, 1989）中所述条件，或按照制造生产厂商的使用说明。

实施例1水稻基因OsMYB84的克隆

1. 水稻品种Nipponbare（Oryza sativa Japonica）在培养箱(SPX-250-GB,Shanghai,China) 中培养：生长条件为光周期16h /8h (L/D)，28oC。

2 . RNA提取。取100毫克左右新鲜的水稻植物组织材料，液氮充分研磨。加1 ml Trizol试剂，涡旋15 s后室温放置5 min。加0.2 ml氯仿，去蛋白，12000rpm离心10min后上清转移至新的离心管，加等体积异丙醇，充分混匀，室温放置10 min，12k rpm离心10min，弃上清，用DEPC处理过的水配制的75%乙醇1 ml洗涤沉淀，重复一次。室温干燥5-10 min，溶于20 μl DEPC水中，测OD值，电泳检测。

3. 基因的克隆。通过对应的拟南芥的AtMYB84基因进行生信分析与基因文库中比对与搜索，目标基因与拟南芥的基因AtMYB84同源性为80%以上。以逆转录的水稻cDNA第一链为模板，利用正向引物和反向引物进行PCR，获得基因全长，具体序列信息参见SEQ ID NO.1。

实施例 2水稻基因OsMYB84的同源性以及进化树分析

利用Clustal.X程序对OsMYB84推测编码氨基酸序列及其同源序列进行氨基酸序列相似性分析；结果显示，在OsMYB84中明显的R2和R3保守的3个色氨酸区域（图1）。

利用Mega4软件，最小进化法进行MYB家族成员的系统进化分析（图2）；所挑选的序列均系根据已发表的成果或通过BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）在线搜索获得。结果显示，各物种中的MYB，双子叶植物、单子叶植物分别聚类在了一起。这说明OsMYB84基因既有MYB84基因在序列上的共同性，亦存在着进化亲缘关系上的独立性。

实施例3水稻OsMYB84基因器官表达模式分析

分别提取水稻花、茎、幼叶、老叶、根等中的总RNA，利用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA，利用引物SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8，进行实时荧光定量PCR检测（图3(a)）。结果显示，该基因为组成型表达，在茎中表达量最高，花中表达量最少，茎，幼叶，成熟叶，老叶中表达量没有明显差异，根中相比这些器官表达量相对较少。

实施例4水稻基因OsMYB84在低温、干旱、高盐胁迫以及植物激素处理下的表达模式分析

对两周大的水稻幼苗分别进行10μM KT、10μM 6-BA、10μM IAA、5μM GA、50μM ABA、10μM KT、100μM JA、4oC低温分别处理24h，10%PEG、200μM NaCl处理1d、4d，并同无处理的对照组一起，分别提取叶中的总RNA，利用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA，利用引物SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8，进行实时荧光定量PCR检测。结果显示，不同激素处理，目标基因OsMYB84 受ABA和6BA诱导，与IAA、KT和GA处理无关（图3(b)）。PEG处理1天后OsMYB84的表达量无明显变化，处理4天后被诱导，NaCl处理1天后即被诱导，4天后比处理1天表达量稍有提高，低温和JA处理1天后表达量有所下调（图3(c)）。

实施例5 OsMYB84转基因水稻的分子鉴定

分别提取35S：OsMYB84四个株系OX1、OX2、OX3、OX4以及野生型对照组中的总RNA，利用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA，利用引物SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8，进行实时荧光定量PCR检测（图4）。结果显示，OX1、OX3、OX4中OsMYB84基因表达量比野生型要高。之后实验选用OX1株系作为实验材料。

实施例6转入基因OsMYB84的水稻株高的改变

28oC培养两周大的35S：OsMYB84转基因株系OX1与野生型WT对照组进行株高测量（图5）。结果显示，转OsMYB84基因的水稻OX1与野生型WT相比，其株高表型要更矮。

实施例7 转入基因OsMYB84的水稻对ABA激素敏感程度的改变

1.  35S：OsMYB84转基因株系OX1与野生型WT的种子经消毒液处理，无菌水清洗，置于无菌操作台晾干后，将其转移至添加3μM ABA以及未添加ABA的MS培养基上（图6(a)），同时置于28oC培养箱培养；

2. 观察统计每天实验组与对照组的发芽率情况（图6(b)），并在第8天时，观察并测量转基因株系与野生型株系的株高，取株高相对值做比较（图6?）。

结果显示，在3μM ABA培养基上萌发的35S：OsMYB84转基因株系OX1的种子萌发率要明显低于3μM ABA和正常培养情况下WT种子的萌发率。同时，测量株高发现，3μM ABA下转基因株系OX1的株高与WT相比要明显受到抑制，说明OsMYB84基因对ABA敏感。

实施例8 转入基因OsMYB84的水稻对高盐抗性的改变

1．28oC培养两周大的35S：OsMYB84转基因株系OX1与野生型WT对照组分别放至正常培养液以及添加200mM NaCl的培养液中培养（图7）；

2．15h后测量转基因株系与野生型在两种培养条件下的电导率（图8(a)），并且将在NaCl溶液中培养的幼苗用正常培养液恢复培养；

3．恢复培养5d后，测量转基因株系和野生型株系的茎、根以及整株鲜重，并取相对值（图8 (b)）；

结果显示，35S：OsMYB84转基因株系OX1与野生型WT相比，电导率更小，植株茎的相对鲜重更大，说明转入外源OsMYB84基因植株在高盐胁迫下受到的损伤更小，其对高盐胁迫耐受性有提高。

参考文献

刘蕾，杜海，唐晓凤，吴燕民，黄玉碧，唐益雄（2008）.MYB转录因子在植物抗逆胁迫中的作用及其分子机理.遗传30: 1265―1271.

Zhong Rui-qin, Richardson E A, Ye Zheng-hua(2007). The MYB46 transcription factor is a direct target of SNDl and regulates secondary wall biosynthesis in Arabidopsis. P1ant Cell19: 2776-27921.

Frampton J, ed.( 2004). MYB transcription factors：their role in growth，differentiation and disease. Kluwer academic publishers Springer, PP:6—8.

Jin H, Martin C(1999). Multifunctionality and diversity within the plant MYB-gene family. Plant Mol Biol41: 577?585.

Stracke R, Werber M, Weisshaar B(2001). The R2R3-MYB gene family in Arabidopsis thaliana. Curr Opin Plant Biol4: 447?456.

Rabinowicz PD, Braun EL, Wolfe AD, Bowen B, Grotewold E(1999). Maize R2R3 MYB gene: sequence analysis reveals amplification in the higher plants. Genetics153: 427?444.

Cominelli E, Galbiati M, Vavasseur A, Conti L, Sala T, Vuylsteke M, Leonhardt N, Dellaporta SL, Tonelli C(2005). A guard-cell-specific MYB transcription factor regulates stomatal movements and plant drought tolerance. Curr Biol15: 1196?2000.

Vannini C, Locatelli F, Bracale M, Magnani E, Marsoni M, Osnato M, Mattana M, Baldoni E, Coraggio I(2004). Overexpression of the rice Osmyb4 gene increases chilling and freezing tolerance of Arabidopsis thaliana plants. Plant J37:115-127.

Dai X, Xu Y, Ma Q, Xu W, Wang T, Xue Y, Chong K(2007). Overexpression of an R1R2R3 MYB gene, OsMYB3R-2, increases tolerance to freezing, drought, and salt stress in transgenic Arabidopsis. Plant Physiol143:1739?1751.

Abe H, Urao T, Ito T, Seki M, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K(2003). Arabidopsis AtMYC2(bHLH) and AtMYB2(MYB) function as transcriptional activators in abscisic acid signaling. Plant Cell15:63?78.

Raffaele S, Rivas S, Roby D(2006). An essential role for salicylic acid in AtMYB30-mediated control of the hypersensitive cell death program in Arabidopsis. FEBS Lett580: 3498-3504.

Gong ZZ, Yamazaki M, Saito K(1999). A light-inducible Myb-like gene that is specifically expressed in red Perillafrutescens and presumably acts as a determining factor of the anthocyanin forma. Mol Gen Genet262: 65?72.

Vailleau F, Daniel X, Tronchet M, Montillet JL, Triantaphylidès C, Roby D(2002). A R2R3-MYB gene, AtMYB30, act as a positive regulator of the hypersensitive cell death program in plants in response to pathogen attack. PNAS99: 10179?10184.

Singh K, Foley RC, Onate-Sanchez L(2002). Transcription factors in plant defense and stress response. Curr Opin Plant Biol5: 430?436。

<110>  复旦大学

 <120>  水稻MYB家族转录因子OsMYB84基因编码序列及其应用

 <130>  001

<160>  8    

 <170>  PatentIn version 3.3

<210>  1

<211>  1209

<212>  DNA

<213>  

<400>  1

ggagatagag gataacccac acgccatggg gagagcgccg tgctgcgaca aggcgagcgt     60

gaagaagggg ccatggtcac cggaggagga cgcgaagctc aaatcctaca tcgagcagaa    120

cggcaccggc ggcaactgga tcgccctgcc ccagaagatc ggtttgaaaa ggtgcggcaa    180

gagctgccgc ctccggtggc tgaactacct ccggccgaac atcaagcacg gcgggttctc    240

ggaggaggaa gacaggatca tcctcagcct ctacatcagc ataggaagca ggtggtcgat    300

aatagcagcg cagctgccgg ggcggacgga caatgacatc aagaactatt ggaacacgag    360

gctcaagaag aagctctttg gcaagcagtc gcgcaaggat cagaggcagc agcagcacct    420

ggcgcgccag gcggcagcag ctgccagcga cttgcagatc aaacaagaag cgagcagggg    480

tgcaaacgaa gccgatggct tggctgccgg tgccaattac acttggcatc accaccacgc    540

catggccgtg cctgtgcacc cgatgtcggc accaatggtg gtggaaggag gccgtgtggg    600

agacgatgtc gatgagtcga tccggaagct tctgttcaag ctcggaggga acccattcgc    660

ggcctcgccg gcaccgccat gcatacctcc accaccaatg tacgaggaag ccccaagctt    720

cgtgccacca ttggcgcacg gcgtgccgct caacgaaggc ggcatgcagt gctccagcgt    780

gctgccggcg ctggagctgg acgagaactt ccacttcaac catgtcaagc tggacgggct    840

cgagtgcctc ttcgggatgg gagatcacca aaacatgaga tggaatgagg tgagcccgtt    900

ggtttgccct aataacgctg tggcgtccag ctcccaaggg atgcagcagt actgcctagt    960

tgaagaacca gctgacctcg ggatgcagta gcaatttggt tgtgtttccg tgtacatgca   1020

tgattgtgtg gtgtaaatct gtagcattca tggggaaatt aatggggaaa gatgagatca   1080

aacttctttg aactaagagc aataaggtcg agctctcacc actcctagat gagagatagg   1140

tgcatgcctg attttccagg tgtcttcatg tgagtctagt ctttaaatgg tattttcctc   1200

tactctctt                                                           1209

<210>  2

<211>  321

<212>  PRT

<213>  

<400>  2

Met Gly Arg Ala Pro Cys Cys Asp Lys Ala Ser Val Lys Lys Gly Pro

1               5                   10                  15     

Trp Ser Pro Glu Glu Asp Ala Lys Leu Lys Ser Tyr Ile Glu Gln Asn

            20                  25                  30         

Gly Thr Gly Gly Asn Trp Ile Ala Leu Pro Gln Lys Ile Gly Leu Lys

        35                  40                  45             

Arg Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Leu Asn Tyr Leu Arg Pro

    50                  55                  60                 

Asn Ile Lys His Gly Gly Phe Ser Glu Glu Glu Asp Arg Ile Ile Leu

65                  70                  75                  80 

Ser Leu Tyr Ile Ser Ile Gly Ser Arg Trp Ser Ile Ile Ala Ala Gln

                85                  90                  95     

Leu Pro Gly Arg Thr Asp Asn Asp Ile Lys Asn Tyr Trp Asn Thr Arg

            100                 105                 110        

Leu Lys Lys Lys Leu Phe Gly Lys Gln Ser Arg Lys Asp Gln Arg Gln

        115                 120                 125             

Gln Gln His Leu Ala Arg Gln Ala Ala Ala Ala Ala Ser Asp Leu Gln

    130                 135                 140                

Ile Lys Gln Glu Ala Ser Arg Gly Ala Asn Glu Ala Asp Gly Leu Ala

145                 150                 155                 160

Ala Gly Ala Asn Tyr Thr Trp His His His His Ala Met Ala Val Pro

                165                 170                 175    

Val His Pro Met Ser Ala Pro Met Val Val Glu Gly Gly Arg Val Gly

            180                 185                 190        

Asp Asp Val Asp Glu Ser Ile Arg Lys Leu Leu Phe Lys Leu Gly Gly

        195                 200                 205            

Asn Pro Phe Ala Ala Ser Pro Ala Pro Pro Cys Ile Pro Pro Pro Pro

    210                 215                 220                

Met Tyr Glu Glu Ala Pro Ser Phe Val Pro Pro Leu Ala His Gly Val

225                 230                 235                 240

Pro Leu Asn Glu Gly Gly Met Gln Cys Ser Ser Val Leu Pro Ala Leu

                245                 250                 255    

Glu Leu Asp Glu Asn Phe His Phe Asn His Val Lys Leu Asp Gly Leu

            260                 265                 270        

Glu Cys Leu Phe Gly Met Gly Asp His Gln Asn Met Arg Trp Asn Glu

        275                 280                 285            

Val Ser Pro Leu Val Cys Pro Asn Asn Ala Val Ala Ser Ser Ser Gln

    290                 295                 300                

Gly Met Gln Gln Tyr Cys Leu Val Glu Glu Pro Ala Asp Leu Gly Met

305                 310                 315                 320

Gln

<210>  3

<211>  19

<212>  DNA

<213>  

<400>  3

gagatagagg ataacccac                                                  19

<210>  4

<211>  19

<212>  DNA

<213>  

<400>  4

aagagagtag aggaaaata                                                  19

<210>  5

<211>  30

<212>  DNA

<213>  

<400>  5

cgcagatcta ggagatagag gataacccac                                      30

<210>  6

<211>  24

<212>  DNA

<213>  

<400>  6

cactagtctg catcccgagg tcag                                            24

<210>  7

<211>  27

<212>  DNA

<213>  

<400>  7

aggaattcgt ttgccctaat aacgctg                                         27

<210>  8

<211>  26

<212>  DNA

<213>  

<400>  8

cgtctagatg aagacacctg gaaaat                                          26