光子晶体全反射层制备方法及基于该全反射层的细菌总数快速检测仪

技术领域

本发明涉及细菌数量检测技术。

背景技术

现有的细菌快速度检测方法中，一种为ATP(三磷酸腺苷)生物发光法，该方法的主 要的缺点是不能区分微生物与非微生物ATP，不能特异性地区分微生物的种类，并且样品 本身和ATP提取剂等含有的某些离子会对ATP的测定造成干扰和抑制发光作用。同时，该 方法需要合适的ATP提取剂，需要专业人员的操作，并且受游离ATP和体细胞的影响较大， 酶促反应影响因素多，导致检测结果精度不够高，并且试剂昂贵，增加了检测成本。另一 种细菌快速度检测方法为，采用光栅得到波长为600nm的单色光，600nm单色光进入待测 样品，从待测样品出射后，利用光电探测器进行探测，对探测结果进行处理后得到待测样 品内的细菌总数。这种方法不需要化学试剂，不涉及酶促反应，因而测量的准确度较高， 整个装置的稳定性也较高，但光栅体积庞大，不方便携带，且光栅价格昂贵，增加了整个 检测仪器的成本。

发明内容

本发明的目的是为了解决常规的细菌快速度检测方法由于采用光栅来产生波长为 600nm的单色光，而光栅不仅体积庞大导致携带不方便，而且价格昂贵，增加了检测仪器 的成本的问题，提供一种光子晶体全反射层制备方法及基于该全反射层的细菌总数快速检 测仪。

本发明所述的光子晶体全反射层制备方法包括以下步骤：

步骤一、制备单分散性均一的光子晶体微球，所述光子晶体能够在600nm处产生光 子带隙；

步骤二、将所述光子晶体微球经过离心、洗涤和干燥后，配置成光子晶体微球浓度为 3％至6％的乙醇水悬浊液，该乙醇水悬浊液中，乙醇的体积所占的比例为15％至25％；

步骤三、在所述乙醇水悬浊液中加入葡萄糖，并搅拌均匀，加入的葡萄糖与乙醇水悬 浊液的质量比为0.5:100至2.5:100；

步骤四、将搅拌均匀后的乙醇水悬浊液于恒温65℃至75℃条件下培养于玻璃板上， 培养时间为3.5至4.25小时，培养结束后将玻璃板取出封装，得到光子晶体全反射层。

基于上述光子晶体全反射层的细菌总数快速检测仪，该细菌总数快速检测仪包括光 源、光子晶体全反射层、吸收池、光电倍增管和读数装置，光源发出的光照射在光子晶体 全反射层上，经光子晶体全反射层反射后进入吸收池，从吸收池出射的光照射在光电倍增 管的光敏面上，光电倍增管将光信号转换成电信号，并将该电信号发送至读数装置。

本发明所述的光子晶体全反射层对波长为600nm的光能够全反射，对600nm以外的 波长透射，可以用来产生600nm的单色光。基于该光子晶体全反射层的细菌总数快速检 测仪检测细菌总数时，光子晶体全反射层对光源发出的波长为600nm的光进行全反射，反 射后的光进入装有待测样品的吸收池，从吸收池出射的光能够反应出待测样品中细菌的数 量，因此利用光电倍增管将光信号转换成电信号后，通过读数装置可直接读取待测样品中 细菌的总数。检测原理与常规的ATP生物发光法不同，检测过程不涉及酶促反应，且检测 仪自身的稳定性好，检测过程中干扰因素少，检测精度高；不需要各种昂贵的化学试剂， 降低了成本；操作简单，检测时间短。与标准平板菌落法相关度达到0.9，(ATP发光法与 标准平板菌落法相关度为0.85)，总耗时不超过30min。与光栅相比，采用光子晶体全反 射层来得到600nm单色光，不仅结构小巧，携带方便，而且光子晶体全反射层制备方法 简单，降低了仪器成本。

附图说明

图1为本发明所述的基于光子晶体全反射层的细菌总数快速检测仪的原理示意图。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式所述的光子晶体全反射层制备方法包括以下步骤：

步骤一、制备单分散性均一的光子晶体微球，所述光子晶体能够在600nm处产生光 子带隙；

步骤二、将所述光子晶体微球经过离心、洗涤和干燥后，配置成光子晶体微球浓度为 3％至6％的乙醇水悬浊液，该乙醇水悬浊液中，乙醇的体积所占的比例为15％至25％；

步骤三、在所述乙醇水悬浊液中加入葡萄糖，并搅拌均匀，加入的葡萄糖与乙醇水悬 浊液的质量比为0.5:100至2.5:100；

步骤四、将搅拌均匀后的乙醇水悬浊液于恒温65℃至75℃条件下培养于玻璃板上， 培养时间为3.5至4.25小时，培养结束后将玻璃板取出封装，得到光子晶体全反射层。

所述封装是指在玻璃板的上表面覆盖一层薄膜，将玻璃板密封与外界隔绝，该薄膜对 600nm的光高透。

本实施方式采用能够在600nm处产生光子带隙的光子晶体制备光子晶体全反射层，该 全反射层对波长为600nm的光能够全反射，将这种光子晶体全反射层用于细菌总数检测， 不需要酶促反射，能够提高检测精度，而且与光栅相比，成本大大降低，这种光子晶体全 反射层非常适用于小型化低成本的细菌总数快速检测设备。

具体实施方式二：本实施方式是对实施方式一所述的光子晶体全反射层制备方法的进 一步限定，本实施方式中，步骤一所述的光子晶体为蛋白石结构或反蛋白石结构光子晶体。

以蛋白石结构的SiO₂光子晶体为例，微球直径为288nm。不同结构的光子晶体，其直 径与产生光子带隙的波长具有特定的关系，可通过工具书查找。

具体实施方式三：本实施方式是对实施方式一所述的光子晶体全反射层制备方法的进 一步限定，步骤二所述的乙醇水悬浊液中，光子晶体微球浓度为4％。

具体实施方式四：本实施方式是对实施方式一所述的光子晶体全反射层制备方法的进 一步限定，步骤二所述的乙醇水悬浊液中，乙醇的体积所占的比例为20％。

具体实施方式五：本实施方式是对实施方式一所述的光子晶体全反射层制备方法的进 一步限定，步骤三中，葡萄糖与乙醇水悬浊液的质量比为2:100。

具体实施方式六：本实施方式是对实施方式一所述的光子晶体全反射层制备方法的进 一步限定，步骤四中，恒温条件为70℃。

具体实施方式七：本实施方式是对实施方式六所述的光子晶体全反射层制备方法的进 一步限定，步骤四中，培养时间为4小时。

具体实施方式八：本实施方式是对实施方式一所述的光子晶体全反射层制备方法的进 一步限定，步骤一中，利用stober法制备单分散性均一的光子晶体微球。

具体实施方式九：结合图1说明本实施方式，本实施方式所述的基于光子晶体全反射 层的细菌总数快速检测仪，该检测仪包括光源1、光子晶体全反射层2、吸收池3、光电 倍增管4和读数装置5，光源1发出的光照射在光子晶体全反射层2上，经光子晶体全反 射层2反射后进入吸收池3，从吸收池3出射的光照射在光电倍增管4的光敏面上，光电 倍增管4将光信号转换成电信号，并将该电信号发送至读数装置5。

微生物在液体培养基中生长，由于原生质含量的增加，引起培养物浑浊度的增高，吸 光值与菌体密度在一定范围内成正相关，在600nm条件下可精确测定菌体数量。因此本实 施方式中，光源1发出的光的波长需涵盖600nm，采用钨灯即可。光子晶体全反射层2用 来对波长为600nm的光进行反射，吸收池3内放置待检测样品。光子晶体全反射层2反射 后的600nm的光经过吸收池3后，用光电倍增管4探测，探测信号发送至读数装置5，从 读数装置5上可直接读取吸收池3内细菌总数。检测前，需要对检测仪调零，调零方法与 上述检测过程相同，只是将吸收池3内的待检测样品替换为无菌样品，所述无菌样品为待 检测样品经过处理后将细菌去除，但其余成分保持不变。

采用本实施方式所述的细菌总数快速检测仪检测发酵液中细菌总数。开机后，钨灯光 源预热15min，使光源发射的光稳定，光子晶体全反射层2产生稳定的全反射单色光，以 未接菌的发酵液进行空白调零，在玻璃比色皿中加入3.5mL不同发酵时期的黄色短杆菌谷 氨酸发酵液，放入到吸收池3中，从读数装置中可直接得到该发酵液的细菌总数值。

采用上述细菌总数快速检测仪检测水体中的细菌总数。仪器开机，钨灯光源预热 15min，使光源发射的光稳定，光子晶体全反射层2产生稳定的全反射单色光，将待测水 样进行过滤、离心净化处理，得到澄清的水体溶液，以此进行空白调零，取另一份澄清的 水体溶液在37℃条件下培养20min，取3.5mL加入玻璃比色皿中进行检测，放入到吸收池 中，从读数装置中可直接得到水体细菌总数值。

采用上述细菌总数快速检测仪检测益生菌饮料中的细菌总数。仪器开机，钨灯光源预 热15min，使光源发射的光稳定，光子晶体全反射层2产生稳定的全反射单色光，将待测 的益生菌饮料行过滤、离心净化处理，得到澄清的溶液，再用生理盐水稀释1000倍，以 此进行空白调零，取另一份于37℃条件下培养20min，取3.5mL加入玻璃比色皿中进行检 测，放入到吸收池中，从读数装置中可直接得到益生菌饮料细菌总数值。

本实施方式所述的细菌总数快速检测仪采用光子晶体全反射层2替代光栅来获得 600nm单色光，不仅体积小巧，携带方便，而且成本也大大降低。进行细菌总数检测时， 不涉及酶促反应，且检测仪自身的稳定性好，检测过程中干扰因素少，检测精度高；不需 要各种昂贵的化学试剂，降低了成本；操作简单，检测时间短。与标准平板菌落法相关度 达到0.9，总耗时不超过30min。

对本实施方式所述的细菌总数快速检测仪的稳定性进行检测，取0.5％对苯乙烯磺酸 纳溶液3.5ml加入比色杯中，将比色杯放入检测仪的器吸收池3中，观察3h内样品吸光 值变化，结果表明180分钟内吸光值变化最大为0.02，仪器稳定性对检测结果的影响小于 1％。仪器稳定性好。

具体实施方式十：本实施方式是对实施方式九所述的基于光子晶体全反射层的细菌总 数快速检测仪的进一步限定，本实施方式中，所述的光子晶体全反射层2为蛋白石结构的 SiO₂光子晶体全反射层。

SiO₂光子晶体性能稳定，价格低，适用于制备光子晶体全反射层。