一种利用植物彗星实验评价多环芳烃基因毒性的方法

技术领域

本发明涉及污染物毒性评价技术领域，具体是一种利用植物彗星实验评价 PAHs基因毒性的方法。

背景技术

PAHs是有机物不完全燃烧或热解产生的具有致畸、致癌、致突变作用的一 类持久性有机污染物，也是环境中优先控制污染物，广泛存在于土壤、水、大气 中。PAHs具有较强的生理和遗传毒性，自然降解率低，一旦进入环境则对生态 系统和人群健康构成持久威胁。己证实PAHs对人类及各种生物体具有细胞毒性、 发育毒性和遗传毒性，单纯用PAHs的浓度很难准确地反映其实际毒性，亟待研 发环境中PAHs毒性的定量评价技术。针对PAHs具有的潜在或已被确认的“三 致”毒性效应，评价PAHs基因毒性显得极为重要。彗星实验(comet assay)又 叫单细胞凝胶电泳实验(single cell gel electrophoresis，SCGE)，是一种灵敏性高 的遗传毒性研究方法，已被用作检测诸如DNA单链和双链断裂、碱性位点、不 完全修复位点、DNA交联等多种类型的DNA损伤；但遗憾的是，国内外仍然缺 乏利用植物彗星实验来评价PAHs基因毒性的相关技术。

发明内容

本发明的目的是针对上述技术问题提供一种利用植物彗星实验评价PAHs基 因毒性的方法，该方法利用大白皮蚕豆(Vicia Faba)，取其根尖进行植物彗星实 验，用Komet Version 6.0软件分析彗星图像，以尾动量(TM)作为衡量PAHs 致DNA损伤的参数，TM值与PAHs污染浓度间有显著的剂量-效应关系，可直 接用于评价PAHs的基因毒性。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种利用植物彗星实验评价PAHs基因毒性的方法，其特征在于：该方法包 括以下步骤：

(1)选取洁净的过30目筛的石英砂，将浓度1mg/L的PAHs丙酮溶液加 入到石英砂中混匀，待丙酮挥发完全后，制得含一定浓度(丙酮挥发完全后剩余 多少浓度就是多少浓度)PAHs的石英砂。

(2)挑选大小一致、饱满无虫的植物种子，表面消毒后，用去离子水洗净 表面，室温下用去离子水浸泡种子24h(期间换水2～3次)，然后将种子种于PAHs 污染处理的石英砂中，20℃条件下培养4天(每天光照14h，光照强度4000Lx， 80％湿度)后，种子生根至一定长度。

(3)选取经培养后根长一致的蚕豆幼苗，种于盛有PAHs污染石英砂的玻 璃烧杯中，烧杯外壁用黑色塑料袋包裹后，置于人工气候箱中(20℃，80％湿度， 14h光照，光照强度4000Lx)染毒48h，染毒后取出蚕豆幼苗，用去离子水清 洗根部。

(4)取蚕豆幼苗根尖进行彗星实验，用软件分析彗星图像，用尾动量(TM) 作为评价DNA损伤的参数。

步骤(1)中所述的PAHs为萘、苊、苊烯、芴、菲、蒽、荧蒽、芘、苯并(a) 蒽、屈、苯并(b)荧蒽、苯并(k)荧蒽、苯并(a)芘、茚并(1,2,3-cd)芘、苯并(g,h,i) 苝或二苯并(a,h)蒽。

步骤(2)中的植物种子为大白皮蚕豆(Vicia Faba)，种子表面消毒是用5％ 的次氯酸钠浸泡10分钟。

步骤(4)中分析彗星图像的软件为Komet Version6.0软件(Andor Technology  Ltd)。

步骤(4)中彗星实验过程如下：用刀片切下1cm长的蚕豆根尖并用去离子 水清洗，将根尖放入在冰上预冷过的直径7cm的培养皿中，加入500μL冷PBS 缓冲液，使根尖伸展开，用新刀片将根尖切成薄片，培养皿在冰上保持倾斜，使 分离的细胞核进入缓冲液。彗星实验采用三层凝胶结构，三层凝胶制备好后，将 载玻片放置在4℃冰箱中(不少于5min)，移去盖玻片，将载玻片放在盛有新配 制的4℃的电泳缓冲液(1mmol/LNa₂EDTA和300mmol/LNaOH，pH>13)的水 平电泳槽中，细胞核先在缓冲液中裂解5min，使DNA解旋，之后在1V/cm、 300mA条件下电泳15min(溶液保持在4℃)，电泳结束后，载玻片用冷的400 mmol/L Tris(pH7.5)浸泡5min，用80μL(20μg/mL)溴化乙锭(EB)染色5 min，然后浸入冰水中，去除过量的EB，盖上盖玻片。染色后用荧光显微镜观察 彗星图像。对每个载玻片，在200倍荧光显微镜下随机选取50个清晰细胞核图 像进行观察并用CCD拍摄彗星图像，用Komet Version6.0软件分析图像，用尾 动量(TM)评价DNA损伤的程度。每个处理设3个平行，每个平行观察一个 载玻片，每个载玻片取50个细胞核数据的中位数作为其数值；对于每个处理， 取三个平行的平均数作为最终结果。

本发明的有益效果

采用本发明方法，利用染毒的大白皮蚕豆(Vicia Faba)的根尖进行植物彗 星实验，用Komet Version6.0软件分析彗星图像，因为彗星图像的尾动量(TM) 值与PAHs污染浓度间有显著的剂量-效应关系，所以可用TM值作为衡量PAHs 致DNA损伤的评价参数，并直接用于评价PAHs的基因毒性。本发明建立了利 用植物彗星实验来评价PAHs基因毒性的方法，该方法科学、高效、快速、准确， 适用于PAHs等有毒有机物基因毒性的定量评价。

附图说明

图1蚕豆根细胞DNA损伤的彗星图像图。

图2为菲对蚕豆DNA损伤的TM值与菲污染强度的关系图。

图3为芘对蚕豆DNA损伤的TM值与芘污染强度的关系图。

图1中，A:0mg/kg菲；B:5mg/kg菲；C:10mg/kg菲；D:20mg/kg菲；E:30 mg/kg菲；F:50mg/kg菲。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围不限于此：

实施例1

本实施例包括以下几个步骤：

1)污染石英砂制备：选取商品化的石英砂、过30目筛，石英砂清洗干净后 于105℃烘干。配置一定浓度的菲、芘的丙酮溶液，分别加入到石英砂中混匀， 然后将处理后的石英砂放入通风橱中，待丙酮挥发完全后，制得含0～50mg/kg 菲、芘的石英砂。

2)种子培养及染毒处理：挑选大小一致、饱满无虫的大白皮蚕豆(Vicia faba) 种子，用5％的次氯酸钠浸泡10min进行表面消毒，用去离子水冲洗干净。室温 下用去离子水浸泡24h使种子充分吸胀，期间换水2～3次。浸泡后将种子种于 无PAHs的石英砂中，20℃下培养4天(每天14h光照，光照强度4000Lx，80％ 湿度)，此时蚕豆幼苗根长约为3～5cm。选取经培养后根长一致的蚕豆幼苗，种 于盛有菲、芘污染石英砂的玻璃烧杯中，烧杯外壁用黑色塑料袋包裹后，置于人 工气候箱中(20℃，80％湿度，14h光照，光照强度4000Lx)染毒48h，染毒 后小心取出蚕豆幼苗，用去离子水清洗根部。

3)彗星实验：参照Gichner于2003年在《Mutation Research》杂志上发表 的文章《DNA damage induced by indirect and direct acting mutagens in  catalase-deficient transgenic tobacco cellular and acellular comet assay》 (535(2):187-193)中关于彗星实验的方法，具体实验步骤如下：用刀片切下1cm 长的经染毒处理的蚕豆根尖，用去离子水清洗，将根尖放入在冰上预冷过的直径 7cm的培养皿中，加入500μL冷PBS缓冲液，使根尖伸展开，用新刀片将根尖 切成薄片，培养皿在冰上保持倾斜，使分离的细胞核进入缓冲液。彗星实验采用 三层凝胶结构，三层凝胶制备好后，将载玻片放置在4℃冰箱中(不少于5min)， 移去盖玻片，将载玻片放在盛有新配制的4℃的电泳缓冲液(1mmol/LNa₂EDTA 和300mmol/LNaOH，pH>13)的水平电泳槽中，细胞核先在缓冲液中裂解5min， 使DNA解旋，之后在1V·cm^-1、300mA条件下电泳15min(溶液保持在4℃)， 电泳结束后，载玻片用冷的400mmol/L Tris(pH7.5)浸泡5min，用80μL(20 μg/mL)溴化乙锭(EB)染色5min，然后浸入冰水中，去除过量的EB，盖上盖 玻片。染色后用荧光显微镜(ZEISS Axion Imager A1)观察彗星图像。对每个载 玻片，在200倍荧光显微镜下随机选取50个清晰细胞核图像进行观察并用CCD (Charge-coupled Device)拍摄彗星图像，用Komet Version 6.0软件(Andor  Technology Ltd.)分析图像，用尾动量(TM)评价DNA损伤的程度。每个处理 设3个平行，每个平行观察一个载玻片，每个载玻片取50个细胞核数据的中位 数作为其数值；对于每个处理，取三个平行的平均数作为最终结果。彗星图像见 图1，测得的TM值见图2和图3。

由图1中可以看出，随着菲污染强度升高，彗星图像拖尾长度逐渐增长，表明 DNA损伤程度不断增大。从图2和图3可以看出，衡量蚕豆根尖细胞DNA损伤 程度的TM值随菲、芘污染强度的提高而增大，存在极显著的PAHs剂量—基因 毒性效应关系，因此可用尾动量(TM)作为衡量PAHs致DNA损伤的彗星图像 分析参数，并直接用于评价PAHs的基因毒性。