一种可降解有机磷农药的解淀粉芽孢杆菌及其在降解有机磷农药中的应用

技术领域

本发明涉及一种解淀粉芽孢杆菌及其在降解有机农药中的应用。

背景技术

有机磷农药是一类有机磷酯类化合物。1944年德国拜耳公司制造出世界上第一种有机 磷杀虫剂“1605对硫磷”，距今有机磷农药的生产和应用己有近70年的历史。20世纪60 年代以来，许多国家开始禁止或限制使用有机氯农药，使得有机磷农药逐步发展成为国内 外广泛生产和使用的农药产品，其产品已达百种以上。随着有机磷农药的大规模使用， 80％～90％的有机磷农药进入环境，它对土壤、水体、大气环境造成了严重污染，危害了 人类的生存安全。

目前，包括杀虫剂、除草剂、杀菌剂在内，世界上的有机磷农药已达150多种，中国 使用的有机磷农药有30余种。按照毒性大小常分为3大类：1.剧毒类，如甲拌磷、内吸磷、 对硫磷、保棉丰、氧化乐果等；2.高毒类，如甲基对硫磷、二甲硫吸磷、敌敌畏、亚胺磷 等；3.低毒类，如敌百虫、乐果、氯硫磷、乙基稻丰散等。一些有机磷杀虫剂如甲胺磷、 对硫磷、久效磷等剧毒杀虫剂在国际上已是禁用产品或限制的品种。

有机磷农药能够自然降解，但时间长，其残留就给人类带来了不可估量的危害，因此 研究人工降解方法迫在眉睫。目前，对有机磷农药进行人工降解的主要途径如下：(1)氧 化降解，如刘红玉等人用高铁酸钾对菠菜中3种有机磷农药残留降解的影响作了研究，结 果证明了菠菜生产中将高铁酸钾作为有机磷农药残留降解剂的可行性。(2)生物降解，研 究和应用较多的是微生物降解。(3)光催化降解，如陈宗保等人研究纳米氧化锌对3种有 机磷农药的降解情况，考察了催化剂及其用量、光照时间、pH值的影响，结果表明纳米 氧化锌能使有机磷农药发生降解。在以上3类降解方法中，微生物降解因为其能耗低，不 易造成二次污染而成为主要方向。

然而，现有的机磷农药降解菌对有机磷农药，如氧乐果的降解率仅为60％左右，不能 快速高效的降解有机磷。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有机磷农药残留与污染问题，提供一种可降解有机磷农药 的解淀粉芽孢杆菌及其在降解有机磷农药中的应用。

本发明可降解有机磷农药的解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus  amyloliquefaciens)Ba1501，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏 号为CGMCC No.10374。

本发明上述的可降解有机磷农药的解淀粉芽孢杆菌——解淀粉芽孢杆菌(Bacillus  amyloliquefaciens)Ba1501用于降解有机磷农药。

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Ba1501为好氧革兰氏阳性杆菌，长 2.5～3.0微米、宽0.7～0.9微米，无荚膜，有芽孢，如图1所示；在牛肉膏蛋白胨培养基上 粗糙，菌落乳白色，表面褶皱，无光泽，边缘波状，如图2所示。

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Ba1501接触酶实验为阳性，氧化酶实验 为阴性，V-P测定为阳性，吲哚试验为阴性，水解明胶实验为阳性，硝酸盐还原试验为阴 性，明胶液化试验为阴性；苯丙氨酸脱氨酶试验为阴性；D-葡萄糖为阳性、L-阿拉伯糖为 弱阳性、D-甘露醇为阳性、木糖为弱阳性；耐盐性和需盐性：2％氯化钠为阳性、5％氯化 钠为阳性、7％氯化钠为阳性、10％氯化钠为阴性；柠檬酸盐试验为阳性。

本发明解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Ba1501可利用葡萄糖、甘露醇、 麦芽糖等多种碳源生长，可利用蛋白胨、酵母粉、尿素等为氮源生长。

本发明解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Ba1501的最适生长温度为28℃， 最适合生长环境的pH值为6.5～7.5。

发明解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Ba1501能够快速、高效降解土壤中 的残留的有机磷农药，对有机磷农药辛硫磷、氧乐果和对硫磷的降解率达92.3％、90.7％和 98％。对有机磷农药具有降解速度快，降解效率高的优点。

将解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Ba1501发酵液直接碰洒到受有机磷农 药污染的土壤表面，或者稀释后喷洒到农作物叶面。

经实验检测，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Ba1501对环境无污染、对 人畜无毒无害，具有可靠的安全性。

可降解有机磷农药的解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) Ba1501，属于芽孢杆菌属(Bacillus)；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心(CGMCC)，地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保 藏日期为2015年1月20日，保藏号为CGMCC No.10374。

附图说明

图1是解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Ba1501的菌体形态观察图(1200 ×)。

图2是解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Ba1501的菌落观察图。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意 组合。

具体实施方式一：本实施方式可降解有机磷农药的解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌 (Bacillus amyloliquefaciens)Ba1501，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心，保藏号为CGMCC No.10374。

本实施方式解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Ba1501分离自哈尔滨玉泉镇 白酒发酵料中。

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Ba1501分离、筛选按以下步骤进行：

将白酒发酵料中的活化菌株斜面分别接种于含辛硫磷、氧乐果或对硫磷的选择培养基 中，选择培养基中有机磷农药以有机磷农药溶液的形式加入培养基，有机磷农药溶液中有 机磷农药含量为35％，选择培养基中有机磷农药溶液的添加量为2‰(质量比)；选择培养 基除有机磷农药溶液以外其他成分为0.1g NaCl、0.5g MgSO₄、0.3g K₂SO₄、0.1g CaCO₃、 0.001g FeSO₄、l000ml H₂O，pH值调至7.2，置于温度为30℃、转速为120r/min的环境中 振荡培养48h，然后再逐渐增大3种有机磷农药溶液的添加量，分别在添加量为4‰(质量 比)、6‰(质量比)、8‰(质量比)下观察各菌株的生长状况；选取生长速度最快、耐受 性最好的菌株，经鉴定为解淀粉芽孢杆菌，被命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Ba1501。

具体实施方式二：本实施方式解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Ba1501降 解有机磷农药实验。

牛肉膏蛋白胨培养基由3.0g牛肉膏、10.0g蛋白胨、5.0g NaCl和l000ml H₂O组成。

按2‰质量百分比向牛肉膏蛋白胨培养基中分别加入质量浓度为40％的辛硫磷水溶 液、氧乐果水溶液和对硫磷水溶液。然后，按1％的接种量接种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Ba1501培养基，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Ba1501 培养基中解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Ba1501的浓度为1×10⁸cfu/ml。之 后，置于温度为30℃、转速为120r/min的环境中振荡培养48h和72h；再取牛肉膏蛋白胨 培养基进行气相色谱测定三种有机磷农药的残留量。

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Ba1501培养基成分为：牛肉膏3g，蛋白 胨10g，Nacl 5g，水1000mL，PH7.4～7.6。

对照组：按2‰质量百分比向牛肉膏蛋白胨培养基中分别加入质量浓度为40％的辛硫 磷水溶液、氧乐果水溶液和对硫磷水溶液。然后，按1％的接种量接种枯草芽孢杆菌培养 基，枯草芽孢杆菌培养基中接种菌(枯草芽孢杆菌SbM-10)的浓度为1×10⁸cfu/ml，之后， 置于温度为30℃、转速为120r/min的环境中振荡培养48h和72h；再取牛肉膏蛋白胨培养 基进行气相色谱测定三种有机磷农药的残留量。

实验结果：

振荡培养48h，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Ba1501对有机磷农药辛 硫磷、氧乐果和对硫磷的降解率分别达到72.4％、71.6％和73.3％；而对照组枯草芽孢杆菌 对有机磷农药辛硫磷、氧乐果和对硫磷的降解率仅分别达到38.9％、40.4％和38.7％。

振荡培养72h，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Ba1501对有机磷农药辛 硫磷、氧乐果和对硫磷的降解率分别达到92.3％、90.7％和98％；而对照组枯草芽孢杆菌对 有机磷农药辛硫磷、氧乐果和对硫磷的降解率仅分别达到68.9％、70.4％和69.7％。

实验证明解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Ba1501对有机磷农药的降解速 度快，降解效率更高。

具体实施方式三：本实施方式制备解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Ba1501 发酵液：

发酵培养基成分为：蛋白胨1％、酵母浸粉1％、葡萄糖2％、NaCl 0.5％、MgSO₄0.1％， pH值为6.5。

接种量：2％。

发酵培养条件：温度为28℃，转速为120r/min，培养时间为72h。

发酵后储存条件：4℃，可存储时间为3个月。

大田实验在哈尔滨市动力区双榆树村进行，土壤为耕种灌淤土，种植小白菜，按菜农 种植习惯进行田间操作管理，将农药辛硫磷、氧乐果和对硫磷按1：1000稀释后分别喷施 小白菜及土壤。喷洒农药1d后喷洒解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Ba1501 发酵液，将本实施方式制备的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Ba1501发酵液 按1︰200的比例稀释，稀释后直接均匀喷洒于作物叶面的正反两面，稀释后的发酵液喷 洒量为40公斤/亩，对照组喷枯草芽孢杆菌SbM-10发酵稀释液(1︰200的比例稀释)。分 别于喷洒后1d、3d、5d检测农药降解率，结果如表1所示，解淀粉芽孢杆菌试验组对农药 的降解率显著高于对照组(P<0.05)。

表1