法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2017-06-16
授权
授权
2015-04-22
实质审查的生效 IPC(主分类):C12N3/00 申请日:20141114
实质审查的生效
2015-03-25
公开
公开
技术领域
本发明涉及胶冻样类芽胞杆菌原粉的制备方法，尤其是一种400-1000亿活 芽胞每克胶冻样类芽胞杆菌原粉的制备方法。
背景技术
目前，国内芽胞杆菌微生物肥料菌剂的生成工艺主要有两种，即固体发酵 法和液体深层发酵法。固体发酵法是把菌接种到固体培养基上进行发酵培养， 其优点是相对管理比较粗放，具有生产工艺简单，投资少的特点，但同时具易 受杂菌污染，菌体含量不易控制、产品质量不稳定的缺点。目前我国大多数芽 胞杆菌益生菌产品都是采用该生产方法。
目前国内采用的固体发酵方式生产的胶冻样类芽胞杆菌制剂一般不形成芽 胞或芽孢数相当低且不稳定。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种400-1000亿活芽胞每克胶冻样类芽胞杆菌 原粉的制备方法，由该方法生产的胶冻样类胞杆菌原粉中的活芽胞数达 400-1000亿每克，而且质量非常稳定。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施：
一种400-1000亿活芽胞每克胶冻样类芽胞杆菌原粉的制备方法，它包括以 下步骤：
1)将胶冻样类芽胞杆菌(Paenibacillus mucilaginosus)菌株置于以下培养基 中进行发酵培养：
大米粉18.92g/L，果糖20.86g/L，酵母粉23.45g/L，豆粕6.91g/L，花生粕 5.29g/L，玉米浆1.25g/L，磷酸二氢钾1g/L，氯化锰0.045g/L，硫酸镁0.07g/L， 氯化钙0.035g/L；
发酵过程中通过补加果糖，使发酵液中还原糖的质量浓度保持在0.5-1％， 并通过补加氨水，使发酵液的pH值保持在6.8-7.2；
得到胶冻样类芽胞杆菌活芽胞数达25亿/ml的发酵液；
2)芽胞提取与回收：先将发酵液用盐酸调pH3.5～4.0酸化，然后加入1-3 倍的80℃的热水，搅拌30分钟，离心去上清，得到菌浆，最后将菌浆进行喷雾 干燥，得到胶冻样类芽胞杆菌活芽胞数达400-1000亿/克的原粉，
所述胶冻样类芽胞杆菌菌株保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号 为CCTCC NO∶M2014321。
优选地，所述喷雾干燥的进风温度为200-205℃，出风温度为85-90℃。
优选地，所述发酵培养的条件是：温度31-33℃，培养时间3-5小时。
国内通常采用的固体发酵方式生产的胶冻样类芽胞杆菌制剂一般不形成芽 胞，而采用本发明，胶冻样类芽胞杆菌原粉中的活芽胞数可以达到400-1000亿/ 克，而且质量非常稳定。该方法还具有发酵周期短、生产成本低等特点。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的技术方案进行详细地说明。
实施例1胶冻样类芽胞杆菌高产菌株的获得
1.制备出发型菌株的菌体
以保藏在中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)的胶冻样类芽胞杆菌 (保藏号为ACCC01429)菌株作为出发型菌株，接入含有淀粉1％、酵母抽提 物0.5％，氯化钠0.5％，pH7.2-7.5的简单培养基中，在32℃与180rpm的恒温摇 床上培养16-24h，然后，取50ml发酵液离心收集菌体待用。
2.N离子束诱变及高产芽胞菌株的筛选
取步骤1制备的菌体用5ml无菌水溶解震荡均匀，取0.5ml涂于在无菌培养 皿并吹干，采用TITAN离子束注入机对菌体进行N离子束注入，能量为30keV， 注入剂量为1×1016ion/cm2，注入后再用5ml无菌水清洗培养皿上的菌体，稀释 103倍后取50μl涂布固体含硅培养基平板，在温度28℃恒温培养箱中避光培养 5-7d。
所述的固体含硅培养基的组成是：蔗糖5-10％、酵母抽提物0.1-0.5％、二氧 化硅0.2-1％、氯化钠0.02-0.05％、硫酸镁0.02-0.05％、碳酸钙0.05-0.2％、琼脂 粉2％，pH7.2-7.5组成。
经过5-7d的培养后，平板上出现明显的环状解硅圈透明带，根据N离子束 诱变效果差异，解硅圈透明带宽度1-6mm，经过三十多次反复实验，终于发现 一株透明带宽约12mm、芽胞形成率高的菌株KN-18，于2014年7月4日在位 于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏 编号为CCTCC NO:M2014321。
3.摇瓶芽孢形成能力的验证
取保藏好的菌种，解冻后接入种子培养基中，同时取原始菌株和其它透明 带较窄的菌株(3株)做对照试验，使用恒温摇床在温度32℃与180rpm的条件 下培养16-24h，然后取种子液转接到发酵摇瓶，在恒温摇床，32℃，180rpm的 条件下培养40-48h。然后取发酵液10ml，稀释2倍，在12000-18000rpm的条件 下离心5min，去除菌体。取摇瓶发酵液，常规涂片，用碱性石炭酸复红染色， 用奥林巴斯显微镜油镜(16×100倍)观察发酵芽胞形成率，采用本技术领域技 术人员熟知的饲料中细菌总数的测定方法(参见GB/T13093-2006)，测定该发酵 液中芽胞的含量，从而判断这些菌的芽胞形成率高低。
经过芽胞计数测定，本发明的胶冻样类芽胞杆菌菌株在摇瓶中的芽胞数达 到20亿/ml，比所述的出发菌株提高了167％，比其它三株对照菌株分别提高了 74％、81％和88％。
实施例2发酵培养基的筛选
采用Box-Behken设计的响应面实验，以芽胞数(cfu)为筛选指标，利用单 因子实验首先从10个碳源(玉米淀粉、葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇、 大米粉、土豆淀粉、糊精、玉米粉)；13个氮源(水解植物复合氨基酸、棉籽粉、 豆粕、花生粕、蛋白胨、酵母粉、玉米浆粉、玉米浆、鱼粉、大豆蛋白粉、谷 氨酸钠、天门冬氨酸、硫酸铵)；9个微量元素：氯化钴(CoCl2)、氯化钙(CaCl2)、 硫酸镁(MgSO4)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、氯化钠(NaCl)、硫酸亚铁(FeSO4)、 氯化锰(MnCl2)、硫酸铜(CuSO4)、硫酸锌(ZnSO4)因子中选择重要的部分 因子筛选设计，利用合理的试验设计，考虑重要碳源(大米粉和果糖)、氮源(酵 母粉、豆粕和花生粕)及无机离子(磷酸二氢钾(KH2PO4)、氯化锰(MnCl2) 和硫酸镁(MgSO4))等多个因素之间的协同作用，用于寻找临近最大值的优化 区域的最陡坡试验(Path of Steepest ascent)和用于优化响应面最大值的中心组 合设计(Central Composite Design)来拟合因素与响应值之间的函数关系得到回 归方程，通过对回归方程的分析来设计优化培养基。
(1)碳源因子：通过单因子实验，从玉米淀粉、葡萄糖、果糖、蔗糖、麦 芽糖、甘露醇、大米粉、土豆淀粉、糊精、玉米粉中筛选出大米粉和果糖为 CCTCCM 2014321菌株的最佳碳源需求因子。
(2)氮源因子：通过单因子实验，从水解植物复合氨基酸、棉籽粉、豆粕、 花生粕、蛋白胨、酵母粉、玉米浆粉、玉米浆、鱼粉、大豆蛋白、谷氨酸钠、 天门冬氨酸、硫酸铵中筛选出酵母粉、豆粕和花生粕为CCTCCM 2014321菌株 的最佳氮源需求因子。
(3)微量元素因子：通过单因子实验，从氯化钴(CoCl2)、碳酸钙(CaCO3)、 硫酸镁(MgSO4)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、氯化钠(NaCl)、硫酸亚铁(FeSO4)、 氯化锰(MnCl2)、硫酸铜(CuSO4)、硫酸锌(ZnSO4)中筛选出磷酸二氢钾 (KH2PO4)、氯化锰(MnCl2)和硫酸镁(MgSO4)为CCTCCM 2014321菌株 的最佳微量元素需求因子。
(4)利用PB实验设计(Plackett-Burman Design)筛选影响CCTCCM 2014321 芽胞形成的重要因子，试验表明大米粉、果糖和酵母粉对CCTCCM 2014321芽 胞形成有极显著的影响，因此增加它们的用量对促进CCTCCM 2014321芽胞形 成具有积极的意义。通过最陡坡试验(Path of Steepest ascent)最终确定大米粉 用量为18.92g/L，果糖用量为20.86g/L，酵母粉用量为23.45g/L时CCTCCM 2014321芽胞数达到17亿。利用本公司从SAS公司购买的SAS统计软件设计 中心组合实验(Central Composite Design)，最终得到CCTCCM 2014321发酵最 佳配方为：大米粉18.92g/L，果糖20.86g/L，酵母粉23.45g/L，豆粕6.91g/L， 花生粕5.29g/L，玉米浆1.25g/L，磷酸二氢钾1.00g/L，氯化锰0.045g/L，硫 酸镁0.07g/L，氯化钙0.035g/L，采用该配方，发酵液活芽胞数可达20亿/ml。
实施例3高密度液体补料发酵技术提高发酵生物量
以响应面法优化的培养基配方进行分批发酵动力学研究，以发酵前期，对 数期，稳定期OD、溶氧、pH、芽胞数为指标，确定各时期最佳营养平衡(以 C/N表示)，及与芽胞数关系。在分批发酵配方上进行碳源和氮源浓度加倍，分 析出现反馈抑制因素及浓度，进行分批补料发酵动力学研究，确定补料工艺为： 采用初始糖浓度10g/mL,通过补加果糖，使发酵过程还原糖浓度保持0.5-1％(质 量比)水平，发酵工程共用果糖5％(质量比)；发酵过程补加氨水，使pH控制 在6.8-7.2范围；发酵过程通过调节转速控制溶氧水平不低于临界氧(3ppm)。较 分批发酵相比，虽然菌数和总耗量明显增加，但采用补料工艺，不仅没有出现 底物反馈抑制，也没有因对数期溶解氧不能维持在临界氧之上而影响芽胞的形 成。采用此工艺，发酵液活芽胞数达25亿/ml。
实施例4高效的芽胞提取与回收工艺
发酵液酸化，用盐酸调pH3.5～4，加入1-3倍的80℃的热水，搅拌30分钟， 离心去上清，得到菌浆进行喷雾干燥，喷雾干燥进风温度控制在200-205℃，出 风温度控制在85-90℃，得到的胶冻样类芽胞杆菌原药活芽胞数达400-1000亿/ 克。
机译： 用于在动物（包括人类）中体内对淀粉样蛋白进行负调节的方法，以及用于治疗和/或预防和/或改善阿尔茨海默氏病或其他特征在于淀粉样蛋白沉积物，淀粉样蛋白生成多肽类似物，免疫原性的疾病和病症的方法组成，核酸片段，载体，转化细胞，诱导产生抗淀粉样多肽的抗体的组成，稳定的细胞系，细胞的制备方法，鉴定修饰的淀粉样多肽的方法以及免疫原的制备组合物，淀粉样蛋白生成多肽或其子序列的用途以及淀粉样蛋白生成多肽的类似物的用途
机译： 顺式异构体化合物用于治疗不稳定和可变稳定型心绞痛的方法肺动脉高压慢性阻塞性肺疾病充血性心力衰竭肾衰竭动脉粥样硬化血管清除率降低的病态周围血管疾病血管疾病炎症性疾病心脏病发作支气管炎慢性哮喘哮喘过敏人类或非人类动物体内的变应性鼻炎性青光眼或肠道活动障碍疾病药物组合物的制备方法，药物组合物的制备方法以及化合物的制备方法
机译： 一种高浓度具有组织纤溶酶原激活剂（T-PA）活性的蛋白质的制备方法，一种具有T-PA活性的蛋白质的解决方案以及在人类和兽医学中使用该溶液的方法
