一种猪单侧输尿管梗阻再通模型的建立方法

技术领域

本发明属于一种动物模型的建立方法,尤其是指一种猪单侧输尿管梗阻再通模型的建立方法。

背景技术

肾间质纤维化是所有肾脏病发展至至终末期的最后共同通路。肾间质纤维化的发生机制是一个复杂的病理生理过程，很多细胞介质和生长因子都参与了这一过程，但目前对其发生机制尚缺乏全面的认识,由此所致的终末期肾病需要血液透析治疗，对患者、家庭及社会均是沉重负担。因此阐明肾间质纤维化发病机制，寻找其干预靶点具有重大意义。

目前关于肾间质纤维化的模型研究很多，包括六分之五肾切除模型、马兜铃酸模型、硝酸双氧铀模型及腺嘌呤模型、环孢素A模型、阿霉素模型及单侧输尿管梗阻模型(unilateral ureteral obstruction，UUO)等。相对于其它肾间质纤维化模型，UUO模型为简便、易行的有效模型。它有效模拟了临床梗阻性肾病时的肾损伤，引起肾脏血流动力学及代谢的改变，伴有肾小管损伤及细胞死亡、间质炎症细胞浸润等。大量研究表明，在啮齿类动物中，UUO模型引起进展性的肾间质纤维化。UUO模型操作简便易行，并可根据时间、损伤程度模拟不同的肾伤，科研工作中被广泛应用。当梗阻性肾病的梗阻因素解除后，肾脏在形态和功能上将出现不同程度的恢复，但目前关于UUO梗阻解除即再通后的肾脏会有怎样的病变或修复过程鲜有研究。梗阻性肾病可导致肾脏间质纤维化，我们假设，在梗阻解除即输尿管再通后肾间质纤维化是否可以逆转以及逆转的时间点，单侧输尿管梗阻再通模型是否能作为更有效可行的工具来研究肾间质纤维化的发病机制，预防及干预肾脏间质纤维化？目前，关于肾间质纤维化的动物模型大多局限在啮齿类动物上，为了突破啮齿类动物在此研究方面的局限性，同时更大程度的模拟人的生理结构及病理改变，需立与人类内环境的相关程度高的动物模型。

发明内容

本发明提供一种猪单侧输尿管梗阻再通模型的建立方法，目的是为研究肾间质纤维化提供很好的实验平台。

动物模型在研究人类疾病中发挥着重要作用。选择动物模型最重要的准则即动物模型与。与其他动物相比，猪在形态、体积、生理结构和功能上与人类有极大的相似性，因此猪被用于包括心血管、呼吸系统及泌尿系等许多方面的研究。另外，猪在染色体结构和序列上与人类存在很大程度的同源性，我们构建了大动物猪的单侧输尿管梗阻再通模型。

本发明采取的技术方案是：包括下列步骤：

(一)选择实验动物，所选实验猪为广西巴马香猪，月龄3个月，体重8-10公斤，饲养符合标准动物饲养条件，18-25℃，12小时光/暗周期，每只猪每天喂养猪饲料2次，每次250g；

(二)造模手术，实验动物术前禁食水12小时，用地西泮、氯胺酮和速眠新II联合麻醉法，麻醉具体操作过程：先给予氯胺酮20mg/kg肌肉注射，50～70秒后动物摇晃倒地，肌肉松弛，再给予地西泮1mg/kg肌肉注射，速眠新0.15ml/kg肌肉注射，110～130秒麻醉生效，将猪置于37℃恒温手术台，所有手术步骤遵循无菌操作，常规备皮、铺无菌洞巾，戴无菌帽子、口罩及手套，皮肤消毒后取腹部正中切口，9～11cm，逐层分离皮肤直达脏层腹膜，打开腹腔，翻开肠攀，将肠攀用37℃生理盐水浸湿的纱布包绕，暴露右侧输尿管，在距离右肾下级15cm处，用长2cm，宽1cm的聚乙烯片包绕，并在聚乙烯片上沿两端用10号手术线结扎，使右侧输尿管完全梗阻，还纳肠攀，37℃，0.9％生理盐水反复冲洗肠攀并用吸引器吸出盐水，腹腔注入青霉素16万单位/kg，逐层缝合关闭腹腔；

(三)再通手术：5天后按照上述操作步骤进行麻醉，待麻醉生效后将猪至于恒温37℃手术台上，所有步骤遵循无菌操作，常规备皮、铺无菌洞巾，将原切口打开，逐层分离皮肤直达脏层腹膜，打开腹腔，翻开肠攀，将肠攀用37℃生理盐水浸湿的纱布包绕，找到右侧输尿管，充分暴露结扎处输尿管，此时可见结扎处输尿管较正常狭窄，将结扎输尿管的手术线及聚乙烯管一并去除，用手轻轻按摩结扎处输尿管，可见狭窄、迂曲、发白的输尿管逐渐恢复正常粗细，且血运丰富，梗阻的输尿管完全再通，留取双侧肾活检组织约200毫克，并留取双侧分肾静脉血清标本，还纳肠攀，37℃，0.9％生理盐水反复冲洗肠攀并用吸引器吸出盐水，腹腔注入青霉素16万单位/kg，逐层缝合关闭腹腔；

(四)继续将梗阻再通后的实验猪于动物室内行标准观察、饲养，再通7天、14天及21天时分别再次行手术，打开腹腔留取肾组织及血清标本，动态观察肾脏功能及组织病理学改变。

本发明的有益效果是：

1、近年来大量研究结果表明，小型猪和人同源关系较近，在解剖学、生理学、生物化学和疾病发生机理等方面极其相似。在心血管系统、消化系统、生殖系统、内分泌系统等领域的研究中常被用作为实验动物。然而，小型猪应用于医学动物模型需要进行外科手术，没有良好的麻醉，动物耐受不住手术强烈的疼痛刺激，这对完成手术过程和研究过程造成了障碍。以往资料表明，大多数实验猪的麻醉，在单独应用一种麻醉药物的情况下麻醉效果均欠佳，且实验术中需要应用气管插管保持呼吸道通通畅，这使猪的模型复杂化且增加了实验难度。针对小型猪的单侧输尿管梗阻再通模型，每次手术造模从开始到完成的时间约为2个小时左右，手术时间较长，因此麻醉效果好是造模顺利实施的前提保障。我们采用地西泮、氯胺酮及速眠新II联合麻醉法对实验猪进行术前麻醉，麻醉起效快，麻醉效果好，且维持时间长，便于手术实施，且安全性高，无需术中气管插管及呼吸机辅助呼吸，且术后动物促醒快，无不良反应。为手术顺利进行提供了保障，使大动物实验简便易行。另外，麻醉后动物也较易苏醒，与两种药物麻醉苏醒时间并无显著差异。

2、以往的单侧输尿管再通模型曾有学者用弹性塑胶管等植入输尿管内造成输尿管梗阻模型，但此模型为将异物植入输尿管，须手法轻柔，即便操作者技术娴熟亦难免形成手术粘连，导致操作处损伤、感染。其他如血管夹法亦容易对输尿管造成牵拉损伤。此操作过程中我们选用了聚乙烯片包绕法并用手术线在其上结扎，聚乙烯片价格低，容易获得，同时此方法避免了对输尿管的反复牵拉及血管夹对输尿管的损伤，二次手术再通时操作简便且保证了再通效果。

3、反复进行手术操作难免引起炎症、肠道粘连等并发症，我们在操作过程中用37℃，0.9％生理盐水反复冲洗肠攀，并于手术结束时用青霉素注入腹腔，有效的避免了炎症、肠道粘连的并发症，保证不同时间点的反复手术操作顺利进行。

4、在同一只模型猪上进行输尿管梗阻再通操作，在梗阻以及再通的不同时间点都可以留取血样及肾组织，也就是说，每只模型猪可以经历4-5次手术，动态观察了梗阻再通不同时间点的肾脏病理及生理变化，这在其它模型上尚未得以实施。通过对猪的单侧输尿管梗阻再通不同时间点的观察，我们发现随着梗阻时间延长，病变侧肾脏出现了不同程度的肾小管上皮细胞扁平、刷状缘脱落，管腔扩大，随着梗阻时间的延长甚至出现了肾间质水肿、间质纤维化的改变以及肾小球的病变。再通时，不同的时间点，病变侧及对侧肾脏的组织结构和生理功能呈现了不同程度的恢复。这为我们研究肾脏纤维化的发病机制及肾脏病纤维化的逆转时机及治疗提供了良好的工具和实验平台。

5、本模型在对梗阻再通侧进行研究的同时，还可针对对侧肾脏进行研究，在不同时间点留取双侧肾活检组织标本及双侧分肾静脉血清标本，在很大程度上模拟了人的病变过程，在体内实验研究中更有实用价值。因此，我们的造模过程为动态过程，可观察不同时间点的肾脏病变，且此动态变化可以在一只模型上观察得到，更大程度的模拟了人的病变。为研究肾间质纤维化提供了很好的实验平台，同时此模型也为药物实验提供了很好的工具。

附图说明

图1是肾脏及输尿管示意图；

图2是聚乙烯片卷曲成为聚乙烯管，包绕在肾输尿管上的示意图；

图3梗阻再通前后肾脏及输尿管的大体图片，图中A:正常肾脏；B:梗阻肾脏；C：正常肾脏剖面图；D：梗阻肾脏剖面图；E：梗阻输尿管；F：再通后输尿管；

图4是梗阻2周及3周的病变侧肾脏组织的PAS及Masson染色图；可以看到梗阻2周及3周时肾脏病变明显，甚至出现纤维化改变，说明梗阻模型成功；

图5是梗阻5天及再通7天、14天、21天猪的前腔静脉血清肌酐改变图；CON:正常静脉血肌酐水平；U5:梗阻5天；R7-R21：再通7天、14天及21天；

图6是梗阻5天再通7天、14天、21天的肾脏病理染色图；图中A、E、I为梗阻5天肾脏的PAS及MASSON染色图；B、F、J为梗阻5天、再通7天后的PAS及MASSON染色图；C、G、K为再通14天的PAS及MASSON染色；D、H、L为再通21天的PAS及MASSON染色图。

具体实施方式

速眠新II，由解放军军需研究所研制研发，吉林省华牧动物保健品有限公司生产；

地西泮，上海旭东海普药业有限公司生产；

氯胺酮，福建古田药业有限公司生产。

实验动物在吉林大学动物实验中心饲养。

实施例1

包括下列步骤：

(一)选择实验动物，所选实验猪为广西巴马香猪，月龄3个月，体重8-10公斤，饲养符合标准动物饲养条件，18-25℃，12小时光/暗周期，每只猪每天喂养猪饲料2次，每次250g；

(二)造模手术，实验动物术前禁食水12小时，用地西泮、氯胺酮和速眠新II联合麻醉法，麻醉具体操作过程：先给予氯胺酮20mg/kg肌肉注射，50秒后动物摇晃倒地，肌肉松弛，再给予地西泮1mg/kg肌肉注射，速眠新0.15ml/kg肌肉注射，110秒麻醉生效，将猪置于37℃恒温手术台，所有手术步骤遵循无菌操作，常规备皮、铺无菌洞巾，戴无菌帽子、口罩及手套，皮肤消毒后取腹部正中切口，9cm，逐层分离皮肤直达脏层腹膜，打开腹腔，翻开肠攀，将肠攀用37℃生理盐水浸湿的纱布包绕，暴露右侧输尿管，在距离右肾下级15cm处，用长2cm，宽1cm的聚乙烯片包绕，并在聚乙烯片上沿两端用10号手术线结扎，使右侧输尿管完全梗阻，还纳肠攀，37℃，0.9％生理盐水反复冲洗肠攀并用吸引器吸出盐水，腹腔注入青霉素16万单位/kg，逐层缝合关闭腹腔；

(三)再通手术：5天后按照上述操作步骤进行麻醉，待麻醉生效后将猪至于恒温37℃手术台上，所有步骤遵循无菌操作，常规备皮、铺无菌洞巾，将原切口打开，逐层分离皮肤直达脏层腹膜，打开腹腔，翻开肠攀，将肠攀用37℃生理盐水浸湿的纱布包绕，找到右侧输尿管，充分暴露结扎处输尿管，此时可见结扎处输尿管较正常狭窄，将结扎输尿管的手术线及聚乙烯管一并去除，用手轻轻按摩结扎处输尿管，可见狭窄、迂曲、发白的输尿管逐渐恢复正常粗细，且血运丰富，梗阻的输尿管完全再通，留取双侧肾活检组织约200毫克，并留取双侧分肾静脉血清标本，还纳肠攀，37℃，0.9％生理盐水反复冲洗肠攀并用吸引器吸出盐水，腹腔注入青霉素16万单位/kg，逐层缝合关闭腹腔；

(四)继续将梗阻再通后的实验猪于动物室内行标准观察、饲养，再通7天、14天及21天时分别再次行手术，打开腹腔留取肾组织及血清标本，动态观察肾脏功能及组织病理学改变。

实施例2

包括下列步骤：

(一)选择实验动物，所选实验猪为广西巴马香猪，月龄3个月，体重8-10公斤，饲养符合标准动物饲养条件，18-25℃，12小时光/暗周期，每只猪每天喂养猪饲料2次，每次250g；

(二)造模手术，实验动物术前禁食水12小时，用地西泮、氯胺酮和速眠新II联合麻醉法，麻醉具体操作过程：先给予氯胺酮20mg/kg肌肉注射，60秒后动物摇晃倒地，肌肉松弛，再给予地西泮1mg/kg肌肉注射，速眠新0.15ml/kg肌肉注射，120秒麻醉生效，将猪置于37℃恒温手术台，所有手术步骤遵循无菌操作，常规备皮、铺无菌洞巾，戴无菌帽子、口罩及手套，皮肤消毒后取腹部正中切口，10cm，逐层分离皮肤直达脏层腹膜，打开腹腔，翻开肠攀，将肠攀用37℃生理盐水浸湿的纱布包绕，暴露右侧输尿管，在距离右肾下级15cm处，用长2cm，宽1cm的聚乙烯片包绕，并在聚乙烯片上沿两端用10号手术线结扎，使右侧输尿管完全梗阻，还纳肠攀，37℃，0.9％生理盐水反复冲洗肠攀并用吸引器吸出盐水，腹腔注入青霉素16万单位/kg，逐层缝合关闭腹腔；

(三)再通手术：5天后按照上述操作步骤进行麻醉，待麻醉生效后将猪至于恒温37℃手术台上，所有步骤遵循无菌操作，常规备皮、铺无菌洞巾，将原切口打开，逐层分离皮肤直达脏层腹膜，打开腹腔，翻开肠攀，将肠攀用37℃生理盐水浸湿的纱布包绕，找到右侧输尿管，充分暴露结扎处输尿管，此时可见结扎处输尿管较正常狭窄，将结扎输尿管的手术线及聚乙烯管一并去除，用手轻轻按摩结扎处输尿管，可见狭窄、迂曲、发白的输尿管逐渐恢复正常粗细，且血运丰富，梗阻的输尿管完全再通，留取双侧肾活检组织约200毫克，并留取双侧分肾静脉血清标本，还纳肠攀，37℃，0.9％生理盐水反复冲洗肠攀并用吸引器吸出盐水，腹腔注入青霉素16万单位/kg，逐层缝合关闭腹腔；

(四)继续将梗阻再通后的实验猪于动物室内行标准观察、饲养，再通7天、14天及21天时分别再次行手术，打开腹腔留取肾组织及血清标本，动态观察肾脏功能及组织病理学改变。

实施例3

包括下列步骤：

(一)选择实验动物，所选实验猪为广西巴马香猪，月龄3个月，体重8-10公斤，饲养符合标准动物饲养条件，18-25℃，12小时光/暗周期，每只猪每天喂养猪饲料2次，每次250g；

(二)造模手术，实验动物术前禁食水12小时，用地西泮、氯胺酮和速眠新II联合麻醉法，麻醉具体操作过程：先给予氯胺酮20mg/kg肌肉注射，70秒后动物摇晃倒地，肌肉松弛，再给予地西泮1mg/kg肌肉注射，速眠新0.15ml/kg肌肉注射，130秒麻醉生效，将猪置于37℃恒温手术台，所有手术步骤遵循无菌操作，常规备皮、铺无菌洞巾，戴无菌帽子、口罩及手套，皮肤消毒后取腹部正中切口，11cm，逐层分离皮肤直达脏层腹膜，打开腹腔，翻开肠攀，将肠攀用37℃生理盐水浸湿的纱布包绕，暴露右侧输尿管，在距离右肾下级15cm处，用长2cm，宽1cm的聚乙烯片包绕，并在聚乙烯片上沿两端用10号手术线结扎，使右侧输尿管完全梗阻，还纳肠攀，37℃，0.9％生理盐水反复冲洗肠攀并用吸引器吸出盐水，腹腔注入青霉素16万单位/kg，逐层缝合关闭腹腔；

(三)再通手术：5天后按照上述操作步骤进行麻醉，待麻醉生效后将猪至于恒温37℃手术台上，所有步骤遵循无菌操作，常规备皮、铺无菌洞巾，将原切口打开，逐层分离皮肤直达脏层腹膜，打开腹腔，翻开肠攀，将肠攀用37℃生理盐水浸湿的纱布包绕，找到右侧输尿管，充分暴露结扎处输尿管，此时可见结扎处输尿管较正常狭窄，将结扎输尿管的手术线及聚乙烯管一并去除，用手轻轻按摩结扎处输尿管，可见狭窄、迂曲、发白的输尿管逐渐恢复正常粗细，且血运丰富，梗阻的输尿管完全再通，留取双侧肾活检组织约200毫克，并留取双侧分肾静脉血清标本，还纳肠攀，37℃，0.9％生理盐水反复冲洗肠攀并用吸引器吸出盐水，腹腔注入青霉素16万单位/kg，逐层缝合关闭腹腔；

(四)继续将梗阻再通后的实验猪于动物室内行标准观察、饲养，再通7天、14天及21天时分别再次行手术，打开腹腔留取肾组织及血清标本，动态观察肾脏功能及组织病理学改变。

参见图4，可以看到梗阻2周及3周时肾脏病变明显，甚至出现纤维化改变，说明梗阻模型成功。

参见图5，梗阻时血肌酐显著增高，再通后肌酐明显下降，模型成功。

参见图6，梗阻时肾间质出现明显病变，再通至21天时肾脏病理基本恢复至正常，此动态变化均在同一只模型猪上观察到。

下面通过实验例进一步说明本发明的效果。

实验例1动物麻醉比较

以往资料显示波器，大多数实验猪的麻醉，在单独应用一种麻醉药物的情况下麻醉效果均欠佳，而本发明联合麻醉能达到较好的麻醉效果，本发明采用的麻醉药物为速眠新II，0.15ml/kg肌肉注射、地西泮1mg/kg肌肉注射，及氯胺酮20mg/kg肌肉注射，为了观察不同麻醉药物的麻醉效果，进行了如下实验：将实验小型猪随机分为A、B、C三组，每组6头猪，麻醉药物剂量及麻醉方法同上。A组为速眠新II联合地西泮复合麻醉，B组为氯胺酮联合速眠新II复合麻醉，C组为氯胺酮、速眠新II、地西泮三种药物不同复合麻醉，观察诱导期、维持期和苏醒期时间，监测动物体温、呼吸频率和心率。结果表明，氯胺酮、速眠新II及地西泮三种药物联合麻醉的效果明显优于两种药物联合应用，如表1所示。

表1各组麻醉各个时期监测结果(min)

如表1所示，A组为速眠新II+地西泮，B组为氯胺酮+速眠新II，C组为氯胺酮+速眠新II+地西泮，*代表与A组或B组比较，P〈0.01，差异显著；#代表与A组或B组比较，P〈0.05，差异显著；△代表与A组或B组比较，P〉0.05，无统计学差异。故C组诱导期及麻醉其效果优于A组及B组，且苏醒其三组间差别不大。

实验例2造模过程比较

为了验证哪种模型更理想，我们进行了如下实验：将小型猪随机分为A、B两组，每组3只猪。A组：打开腹腔，将右侧输尿管两端用10号手术线结扎，沿中间剪开，在靠近肾脏端用单J管沿输尿管插入肾盂，将单J管固定并结扎，造成梗阻模型，正常关闭腹腔。B组：打开腹腔暴露右侧输尿管，用聚乙烯片在距离肾脏下级15cm处包绕右侧输尿管，在聚乙烯管两端用10号手术线结扎，使右侧输尿管完全梗阻。再通时一并去除聚乙烯片及结扎线。实验结果：A组：因单J管为异物，输尿管及肾盂多处粘连，1只猪单J管堵塞，其他2只见脓液从单J管流出，实验动物出现了严重感染而导致再通失败。B组：再通后输尿管无粘连，输尿管由梗阻迂曲变为正常粗细，腹腔无感染，再通效果好。经过反复论证，我们采用了聚乙烯片包绕法。

实验例3通过对梗阻及再通各个时间点血清标志物及病理的分析，本发明在梗阻不同时间点再通后肾脏在大体、病理及生理功能上发生的不同程度的变化。

通过图3梗阻-再通前后肾脏及输尿管的大体图片，可见与正常肾脏(图中A和C)相比，梗阻肾脏(图中B和D)体积增大，颜色变灰白，无光泽，表面不光滑,颗粒感明显,可见肾积水，肾实质变薄,肾盂扩张,肾盏乳头受压,弯隆部乳头变平钝，部分成凹型。梗阻时(图中E)输尿管迂曲、增粗，呈缺血样改变；再通(图中F)后输尿管变直、变细，血运丰富。

如图6所示，梗阻时肾间质出现明显病变，再通至21天时肾脏病理基本恢复至正常，此动态变化均在同一只模型猪上观察到。