一株分离自豆豉中产蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌菌株

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，特别是涉及一种从传统豆豉中分离纯化的解淀粉芽孢杆菌菌株，该菌株对于本传统豆豉工业实现科学化和的纯种培养有着重要的意义。

背景技术

豆豉距今已有两千多年历史，具有很高营养价值和驱寒健食等功效。过去西方学者认为，枯草杆菌是一种危害甚大的腐败菌。我国先民却能化腐朽为神奇，最先用于食品酿造，由于细菌豆豉大都由家庭制作食用，古代文献少有记载，近代学者也少有涉猎，反而国外研究较多。据近代研究枯草杆菌能形成大量淀粉酶和蛋白酶，已在工业生产上广泛应用。然而，在我国由于细菌型豆豉的工业发酵沿用传统自然发酵方法，一直没有实现纯种发酵，传统自然发酵过程中的微生物主要来自于空气中和器具上的微生物，导致水豆豉产品的质量不稳定，产品的运输和保藏也受到限制很难实现大规模生产通常情况下，自然环境中存在的野生菌株发酵能力参差不齐、安全性较低；虽然在发酵过程主要产生有益菌，但在开放的不可控的发酵体系中很可能存在一些有害菌，如何避免有害菌污染是一个至关重要的公共卫生课题。为实现传统豆豉的工业化生产，必须用纯种发酵代替自然发酵。

基于以上原因，对自然发酵豆豉中有益微生物进行分离和鉴定，组合对豆豉品质起到至关重要的有益微生物，为豆豉工业化、可控化和标准化生产打下坚实基础。

发明内容

本发明的目的是提供一株从传统豆豉中分离纯化产蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌菌株，可通过液态发酵生产蛋白酶。

本发明的从传统豆豉中分离纯化产蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌菌株，其分类命名为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），从传统豆豉中分离纯化技术分离获得，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2014年12月10日，保藏号为：CCTCC M 2014639，保藏地址是中国武汉大学。

本发明所述的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）固体培养特征为：

固体培养为肉汤培养基，37±1℃培养24h，菌落直径8～12mm。呈白色不透明菌落，表面粗糙，菌落边缘不规则，在多种培养基上均不产色素。

本发明所述的解淀粉芽孢杆菌的显微形态特征为：

菌体呈短杆状，染色均匀，具运动性，兼性厌氧，可形成内生芽孢，芽孢囊膨大，呈椭圆形，游离芽孢表面着色弱，革兰氏染色阳性。

本发明所述的解淀粉芽孢杆菌的液体培养条件为：

 培养基为酪素发酵培养基，摇瓶培养3天，培养温度37±1℃，摇床转速为170r/min。

 发酵培养特征：培养第1天，发酵液变浑浊，培养第3天，发酵液颜色变深，数量变多，直径变大。

解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）液体发酵3天后，对发酵液进行化学提取、分离可得到中性蛋白酶。

本发明所述的解淀粉芽孢杆菌菌株的基因登录号为KP419723，16S rDNA碱基序列为：

GGCAATGGCGGGCGTTCTATAATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGAACAGATTG。

本发明所述的解淀粉芽孢杆菌菌株，经发酵可得中性蛋白酶，其工艺包括菌种活化、发酵培养、发酵产物的相对分子质量的测定这三个步骤。

其中，菌种活化采用平板培养，培养基为肉汤培养基，培养原料为：牛肉膏0.3%，1%蛋白胨，0.5%NaCl，pH为7.0～7.2；培养时间：1天；培养温度：37±1℃。

发酵培养：发酵培养基为酪素发酵培养基；发酵原料为0.5%干酪素，0.1%葡萄糖，0.1%酵母浸粉，0.4%K₂HPO₄，0.05%KH₂PO4，0.01%MgSO₄；培养时间：2天；培养温度：37±1℃。

发酵产物的相对分子质量的测定：发酵完毕，转速10000r/min下离心5min，获得粗酶提取液，再进行硫酸铵盐析、脱盐、真空冷冻干燥后将所得的蛋白酶进行SDS-PAGE电泳用以测定该蛋白酶的相对分子质量。

本发明从传统豆豉中获得一株生长快、产蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。本发明所述的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），通过菌体液体发酵能够产生蛋白酶，该菌株容易培养，生产安全性高，筛选所得菌株液体发酵培养酶活达到148～2231U/mL，遗传稳定性好，其代谢产物蛋白酶容易分离纯化，且其代谢产物蛋白酶的酶活性较高。为传统豆豉工业实现科学化和的纯种培养奠定了基础。

附图说明：

图1为本发明所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）的菌落形态；

图2为本发明所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）用番红和孔雀绿染色后在100倍显微镜下观察到的芽孢形态；

图3为本发明所述的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）革兰氏染色后再400倍显微镜下观察到的菌体形态；

图4是本发明所述的菌株Jxnuwy-1依据16S rDNA序列建立的遗传进化树示意图；

图5为本发明所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）产生的蛋白酶的SDS-PAGE电泳图。

具体实施方式：

以下结合实施例对本发明进行细说明。

实施例1：本发明解淀粉芽孢杆菌株的制备或筛选

步骤一、样品采集：在豆豉制作工厂内采集制曲过程中的豆豉，然后用样品袋封装，低温保藏。

步骤二、富集培养：取样品1g放入装有10mL试管中，用漩涡振荡器振荡5min，吸取1mL菌液置于装有50mL肉汤培养基的250mL三角瓶中，再放置在37±0.1℃，170r/min的摇床中72h。

步骤三、菌株初筛：采用平板稀释法，取富集培养出来的菌液200μL涂布在酪素筛选培养基上，在37±0.1℃培养48h，挑出能后产生透明圈的菌株，其中，产蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌的酪素筛选培养基为：干酪素1%，牛肉浸粉0.3%，磷酸氢二钾0.2%，溴百里香酚兰0.005%，琼脂粉2%，pH为7.4±0.1左右。

步骤四、菌株复筛：将初筛平板上有产生透明圈的单菌落用接种针点到酪素培养基中，选择透明圈直径与菌落直径比值（HC值）较大的菌落。

步骤四，菌株分离纯化：将复筛出来的菌株，接种于酪素培养基上平板上划线，在置于37℃的恒温培养箱中培养24h，重复划线三次以上，连续多次在显微镜下观察到形态单一的菌体说明菌株已经分离纯化。

实施例2：本发明解淀粉芽孢杆菌株的显微形态和分子生物学鉴定

取所得透明圈最高的菌株进行显微形态和分子生物学方法鉴定，具体过程如下：

(1) 采用固体平板培养法：固体培养为肉汤培养基，37±1℃培养24h，菌落直径8～12mm。呈白色不透明菌落，表面粗糙，菌落边缘不规则，在多种培养基上均不产色素。

解淀粉芽孢杆菌的显微形态特征为：菌体呈短杆状，染色均匀，具运动性，兼性厌氧，可形成内生芽孢，芽孢囊膨大，呈椭圆形，游离芽孢表面着色弱，革兰氏染色阳性。解淀粉芽孢杆菌菌落形态见附图1，用番红和孔雀绿染色后在100倍显微镜下观察到的芽孢形态和革兰氏染色后再400倍显微镜下观察到的菌体形态的显微图片见说明书附图2和附图3。

(2) 分子生物学采用16S rDNA鉴定，取培养1天的发酵液，离心收集菌体，把所得的菌体用试剂盒提取总DNA，利用细菌16S rDNA 通用引物通过扩增保守序列，将所得的序列胶回收、纯化、克隆，再送到上海生工测序，所得16S rDNA 碱基序列如下：

GGCAATGGCGGGCGTTCTATAATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGAACAGATTG

实施例3：本发明所述的用于产蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌菌株16S rDNA序列分析实施过程如下：

依据细菌16S rDNA中最保守的序列设计引物，其中正向引物为F：5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，反向引物为R：5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA- 3’。PCR反应体系20μL。热循环参数94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火40s，72℃延伸1.5min，循环35次，72℃延伸7min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，扩增产物是一条大小约1.4kb的特异性条带。扩增获得的序列经测序，菌株Jxnuwy-1的16S rDNA核苷酸序列大小为1457bp，将序列同GenBank数据库中的10个菌株的16S rDNA核苷酸序列进行比较，采用MEGA6软件对菌株的测序结果进行了系统发育分析，采用Nerghbour-joining方法构建系统发育树，并进行Bootstrap分析，重复次数为1000次。构建的系统发育树如图3。结果显示菌株Jxnuwy-1的16S rDNA核苷酸序列与Bacillus amyloliquefaciens（登记号为KP419723）的16S rDNA核苷酸序列同源性最高，最大相似性（max ident）达到98%。综合Jxnuwy-1菌株的形态学特征、生理生化特征及同源性和系统发育分析，将菌株Jxnuwy-1鉴定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。解淀粉芽孢杆菌依据16S rDNA序列建立的遗传进化树示意图见附图4。

将分离纯化的菌株保藏在中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市，洪山区八一路，武汉大学 中国典型培养物保藏中心，保藏日期:2014年12月10日，保藏号为：CCTCC M 2014639。

实施例4：本发明所述的用于产蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌菌株的蛋白酶酶活性检测的实施过程如下：

将发酵液在10000r/min离心10min，保留上清液。酶活性用福林酚法测得：取1mL发酵液与1mL浓度为10g/mL的酪素溶液在40±0.1℃的水浴锅内反应10min，用三氯乙酸溶液终止反应，对照组则是发酵液先和三氯乙酸反应，再加酪素溶液。反应产生的沉淀用10000r/min离心，保留上清液，取上清液1mL，并加入5mL0.4mol/L的碳酸钠溶液、1mL福林酚试剂，对照组也是一样。在40℃的水浴锅内显色20min，然后用分光光度计在680nm条件下测其光度值。在此条件下，酶活单位定义为：1g（或者1mL液体酶）在一定温度和pH值得条件下，1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活单位，以μ/g(μ/mL)表示。通过该方法测得酶活为148～2231U/mL。

实施例5：本发明解淀粉芽孢杆菌株发酵所得的蛋白酶进行相对分子质量的测定

(1) 取本发明的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），在无菌条件下，用接种环挑取少量菌落，接入已灭菌的肉汤培养基平板，于37±1℃活化培养24小时；

(2) 取活化培养后的菌种，无菌条件下，转接入已灭菌的种子培养基-肉汤培养基中，37±1℃下170r/min摇床培养24h；

(3)将种子培养基中的菌液按2%的接种量接种到发酵培养基中，37±1℃下170r/min摇床培养48h。

(4)发酵完毕，转速10000r/min下离心5min，获得粗酶提取液，再进行硫酸铵盐析、脱盐、真空冷冻干燥后将所得的蛋白酶进行SDS-PAGE电泳用以测定该蛋白酶的相对分子质量。解淀粉芽孢杆菌产生的蛋白酶的SDS-PAGE电泳图见附图5。