一株牛支原体NADH氧化酶的单克隆抗体

技术领域

本发明属于动物传染病防治技术领域，具体涉及一株牛支原体NADH氧化酶的单克隆抗体及应用。该单克隆抗体是由交瘤细胞株8B7分泌的，所述的NADH氧化酶是一种牛支原体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶(NADH oxidase,简称NOX)。

背景技术

牛支原体(Mycoplasma bovis,简称M.bovis)是肉牛和奶牛的重要病原微生物，是导致我国牛呼吸综合征的主要病原体，主要临床症状为肺炎，还可导致乳腺炎、关节炎、生殖道炎症、结膜炎、中耳炎等多种症状。剖检病理变化主要集中在胸腔与肺部，表现为肺和胸膜发生不同程度的粘连并有少量积液。牛支原体于1961年首次在美国从患乳房炎奶牛的牛奶中分离得到，1976年证实其是导致肺炎的重要病原体。此后，牛支原体肺炎和乳腺炎已给欧、美各国造成了巨大的经济损失(Caswell等，2010；White等，2010)。据估计，欧洲每年约有25％～33％的犊牛肺炎是由牛支原体引起的，相当于每年损失1.44～1.92亿欧元,其中英国每年就有190万头牛患牛支原体肺炎，死亡达15.7万头。美国每年由于牛支原体导致的牛呼吸系统疾病和乳腺疾病所造成损失达1.40亿美元,牛场感染率可达70％。

随着我国养牛业向规模化和集约化发展，牛养殖量大大增加，专门化程度大幅度提高，肉牛“异地育肥”已成为重要的肉牛养殖模式。长距离运输是“异地运输”的重要环节，运输应激可诱发多种重要疫病，牛支原体肺炎就是其中一种。2008年，湖北省从外地引进肉牛中流行呼吸道疾病，牛群引进后2周左右发病，表现为发热，咳嗽，流鼻涕，犊牛和体质弱的牛发病严重。发病率为50％～100％。临床治疗周期长，效果差，病死率平均10％，可高达60％，给我国养牛业带来了巨大损失。本实验室于2008年率先确定该病为“传染性牛支原体肺炎”(石磊等，2008)。随后，不同研究群体均证实该病在全国广泛流行(胡长敏等，2009；辛九庆等，2008)。此外，近年来奶牛乳腺炎致新生犊牛爆发牛支原体肺炎的事件也频繁发生。在病原学和流行病学研究基础上，本室完成了牛支原体HB0801的基因组序列解析(GenBank登录号：CP002058)(Qi等,2012)。

牛支原体无细胞壁，对常用β内酰胺类抗生素不敏感，对其它药物如四环素、大环内脂类和氟喹酪酮类等敏感药物的耐药性也在迅速增加(Mustafa等,2013)。迄今为止，尚无有效疫苗预防该病。因此，早期诊断和治疗是控制该病的唯一方法。

目前该病的诊断方法主要有病原体分离鉴定、血清抗体检测和核酸诊断三类。牛支原体的分离和鉴定， 至少需要3天时间，分离需特殊营养，菌落观察需在低倍显微镜下，支原体种的鉴定还需辅助PCR和/或测序方法；血清抗体检测只能说明牛体感染过牛支原体，在流行病学调查中有意义，但不能作为牛支原病的诊断依据。针对牛支原体的PCR和等温环介导方法灵敏度高，但前者需要特殊仪器设备和较高的实验操作技能，且都容易因污染核酸而出现假阳性。因此，临床上急需一种能检测牛支原体抗原的检测方法，获得特异性高亲合力的单克隆抗体是建立牛支原体抗原检测方法的前提和基础。当然，单克隆抗体还可在致病机理研究、治疗药物开发等方面具有广泛的用途。

虽然国外和国内先前都有报道研制成功牛支原体单克隆抗体，但单克隆抗体针对的抗原均为未知，限制了这些单克隆抗体的应用(Rasberry等，1992)。本申请人所在的农业微生物学国家重点实验室的课题组对牛支原体HB0801株进行了基因组测序分析(GenBank登录号：CP002058)，结果表明，牛支原体是一种变异性极高的原核生物，针对牛支原体本地流行株表面相对保守、且免疫原性良好的蛋白抗原制备的单克隆抗体，将具有更为广阔的应用前景。本发明从该指导思想出发，克隆表达了牛支原体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶(NADH oxidase,简称NOX)；以重组rNOX免疫小鼠，获得杂交瘤细胞，筛选获得一株高亲合力的单克隆抗体，经过免疫印迹和免疫荧光实验验证该抗体特异性良好，灵敏度高，并具有牛支原体检测能力。

发明内容

本发明的目的在于提供一种牛支原体表面保守蛋白rNOX的新型单克隆抗体，该单克隆抗体是一种牛支原体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶(NADH oxidase,NOX)，由杂交瘤细胞株8B7分泌，该单克隆抗体可以特异、灵敏和稳定地识别牛支原体。

本发明的另一个目的在于提供一种在体外条件下对牛支原体NOX单克隆抗体的抗原检测方法，用于牛支原体的标记和临床检测。

本发明的技术方案如下所述：

申请人的前期工作是2008年6月从湖北省应城市某养牛场发病的黄牛的肺组织中分离得到一株牛支原体本地分离株HB0801，申请人将其命名牛支原体HB0801，Mycoplasma bovis HB0801,于2010年2月1日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO：M2010040。

本发明根据大肠杆菌的密码子偏爱性，将申请人的前期分离得到一株牛支原体本地分离株即牛支原体HB0801的NOX基因进行克隆、修饰，进而在大肠杆菌中表达。提取纯化重组(或简写为rNOX)蛋白；用重组NOX蛋白免疫小鼠，抗体上升后，用获得的免疫鼠脾淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，获得一株杂交瘤细胞；进一步用NOX筛选，获得能稳定分泌高亲合力的牛支原体单克隆抗体的杂交瘤细胞。申请人将该细胞株命名为杂交瘤细胞株8B7，于2014年12月16日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保 藏中心保藏，其保藏号为CCTCC NO：C2014221。该杂交瘤细胞株8B7可以在含有15％胎牛血清的RPMI-1640培养基中以半贴壁方式生长，生长环境为37℃，5％CO₂的培养箱。该杂交瘤细胞株为浑圆透亮，成簇生长，并能稳定的分泌抗牛支原体的单克隆抗体。

本发明的应用是将杂交瘤细胞8B7在小鼠腹腔接种，制备小鼠腹水，从腹水中提纯单克隆抗体；进一步建立检测牛支原体抗原的免疫荧光检测法等生物学功能验证。

本发明制备的杂交瘤细胞株8B7和单克隆抗体8b7可以作为制备检测牛支原体的抗原制剂或试剂盒中的应用。

一种牛支原体单克隆抗体在检测牛支原体感染细胞中的应用，其应用过程如下：

将牛支气管上皮细胞(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所赠送)于6孔板中培养12小时，每孔细胞量为10⁶个。无菌磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤三次后，实验组每孔加入1mL MEM液体培养基和10⁹CFU牛支原体，对照组加入1mL MEM液体培养基。37℃感染2小时后，大量PBS洗去未结合的牛支原体。用4％的多聚甲醛室温固定10分钟，然后使用0.5％的TritonX-100通透5分钟，PBS洗涤3次后，用含5％(m/v)牛血清白蛋白(BSA，购自Sigma公司)的PBS溶液37℃封闭1小时。PBS洗涤三次后加入1mL含5％(m/v)BSA(购自Sigma公司)的PBS溶液和1μL 8b7单克隆抗体37℃孵育1小时。用PBS洗涤三次，加入3000倍稀释的FITC标记的羊抗鼠的二抗，37℃孵育1小时后，PBS洗涤三次，用100nM的罗丹明室温染色30分钟。PBS洗涤三次，使用DAPI对细胞核染色，室温染色5min。PBS洗涤三次后，使用抗荧光猝灭剂封片。在激光共聚焦显微镜下观察实验结果(图4)。

与现有技术相比本发明具有以下优点：

本发明是针对牛支原体表面特定且保守的膜蛋白NOX，该蛋白具有免疫原性，制备了针对重组NOX单克隆抗体；利用Western blot检测证实，本发明制备的单抗能特异性地识牛支原体和与其近缘的无乳支原体，但不识别其他支原体。利用本发明制备的单抗可应用在一种免疫荧光法上，该方法可检测感染细胞中的牛支原体。

更详细的发明方案见“具体实施方式”所述。

附图说明

序列表SEQ ID NO:1是修饰后的牛支原体NOX基因的核苷酸序列(原基因来源：Mycoplasma bovis HB0801菌株，原基因的登录号GenBank Accession:CP002058)；NOX基因在基因组中的位置：350685……349321(reverse)。该修饰后的牛支原体NOX基因的核苷酸序列如1-1365位碱基所示，该基因结尾的终止密码子为TAA，该终止密码子不包括在制作本序列中)。

序列表SEQ ID NO:2是牛支原体重组的NOX基因编码的蛋白质序列，共编码454个氨基酸序列。

图1：重组rNOX蛋白酶活性检测。附图标记说明：图中rNOX为实验组；无NADH为对照组；无rNOX为空白组。

图2：本发明制备的单克隆抗体8b7纯化后的SDS-PAGE照片。附图标记说明：

泳道：M：参考蛋白；1：纯化前的腹水；2纯化后的单克隆抗体8b7。

图3：利用Western blot方法鉴定单克隆抗体8b7的抗原表位和特异性结果。附图标记说明：

泳道：M.参考蛋白；1：纯化后的rNOX；2：牛支原体HB0801株F1代全菌蛋白；3：无乳支原体标准株PG2全菌蛋白；4：丝状支原体山羊亚种标准株PG3全菌蛋白；5：牛支原体标准株PG45全菌蛋白；6：精氨酸支原体全菌蛋白；7：绵羊肺炎支原体标准株Y98全菌蛋白。

图4：为牛支原体感染牛支气管上皮细胞免疫荧光染色结果图。附图标记说明：

图4中的A图：是空白对照组；图4中的B图：是牛支原体感染上皮细胞组(图中白色的区域为FITC标记的牛支原体)

图5：是pET-30a质粒图谱。

图6：是本发明构建的pNOX重组质粒图谱。附图标记说明：pNOX重组质粒是由pET-30a质粒和突变后的NOX基因经过限制性内切酶消化后连接重组而成。

具体实施方式

实施例1：牛支原体rNOX单克隆抗体的制备

1.1牛支原体NOX基因克隆表达 

由于大肠杆菌对密码子的偏爱性，牛支原体中编码色氨酸的密码子UGA在大肠杆菌被用作终止子，因此，用大肠杆菌表达牛支原体基因时，需要对支原体基因进行突变使密码子UGA突变为能在大肠杆菌中表达色氨酸的密码子UGG。本实施例利用PCR引物对相应基因进行突变，以牛支原体HB0801株基因组(GenBank登录号：CP002058)中NOX基因为模板，利用五对引物(Pnox 1/Pnox 2，Pnox 3/Pnox 4，Pnox 5/Pnox 6，Pnox 7/Pnox 8，Pnox 9/Pnox 10)分别扩增出突变后的NOX基因5个片段，然后，以突变后的5个片段为模板，使用Pnox1/Pnox10扩增出突变后的NOX全基因序列。

所述的具体引物序列如下：

Pnox 1/Pnox 2

上游引物(或称正向引物，下同)：Pnox 1：CCGGAATTCATGAAGATTATTTTAGTGGGAGCAAA(在基因组中的位置为350685-350660。下划线部分为EcoR I酶切位点，波浪线部分为保护性碱基)

下游引物(或称反向引物，下同)：Pnox 2：ATTCACCACCTACCCAAACTGC(在基因组中的位置为350553-350532。下划线部分为突变位点，即由T突变为C)

Pnox 3/Pnox 4

上游引物(或称正向引物，下同)：Pnox 3：AGCAGTTTGGGTAGGTGGTGAAT(在基因组中的位置为350554-350532。下划线部分为突变位点，即由A突变为G)

下游引物(或称反向引物，下同)：Pnox 4：GTTCGATTGGCCATGTACCGC(在基因组中的位置为350351-350331。下划线部分为突变位点，即由T突变为C)

Pnox 5/Pnox 6

上游引物(或称正向引物，下同)：Pnox 5：GGCGGTACATGGCCAATCGAA(在基因组中的位置为350352-350332。下划线部分为突变位点，即由A突变为G)

下游引物(或称反向引物，下同)：Pnox 6：TTTTACCTTTTTGCCAGAATGCTTCAG(在基因组中的位置为350189-350163。下划线部分为突变位点，即由T突变为C)

Pnox 7/Pnox 8

上游引物(或称正向引物，下同)：Pnox 7：CTGAAGCATTCTGGCAAAAAGGTAAAA(在基因组中的位置为350189-350163。下划线部分为突变位点，即由A突变为G)

下游引物(或称反向引物，下同)：Pnox 8：GCGTTTCCCCATGAACCAAT(在基因组中的位置为349506-349487。下划线部分为突变位点，即由T突变为C)

Pnox 9/Pnox 10

上游引物(或称正向引物，下同)：Pnox 9：ATTGGTTCATGGGGAAACGCTATTCA(在基因组中的位置为349506-349481。下划线部分为突变位点，即由A突变为G)

下游引物(或称反向引物，下同)：Pnox 10：GACAAGCTTTTAATATTTGTAGTCAATTCCTAATGCC(在基因组中的位置为349348-349321。下划线部分为Hind III酶切位点，波浪线部分为保护性碱基)

扩增以上五个片段的PCR反应体系为：模板DNA 2μL，pfu酶(Thermo)1μL，pfu buffer with MgSO₄(Thermo)5μL，10倍dNTP mix(Thermo)1μL，引物各1μL，超纯水39μL。

回收以上五个片段的PCR扩增产物，以此为模板，使用引物Pnox1/Pnox10扩增突变后的NOX全基因，其PCR反应体系如下：每个片段2μL，pfu酶(Thermo)1μL，pfu buffer with MgSO₄(Thermo)5μL，10倍dNTP mix(Thermo)1μL，引物各1μL，超纯水31μL。所述引物由上海生工生物技术有限公司合成。

回收NOX全基因扩增产物，用EcoR I和Hind III酶切，同时，将pET-30a质粒(默克雪兰诺有限公司。即Merck)也用EcoR I和Hind III双酶切。将酶切NOX全基因和pET-30a质粒用DNA连接酶(T4DNA ligase)连接，得到重组质粒(pNOX)。用重组质粒转化DH 5α大肠杆菌后，放于37℃摇床(180r/min)培养12小时，提取质粒经过T7鉴定和测序正确后转化BL21大肠杆菌，将该大肠杆菌在LB液体培养基中培养到OD＝_0.6时取1mL菌液作为诱导前对照，同时加入IPTG至终浓度为0.8mM，37℃摇床诱导表达3 小时。取1mL菌液进行处理。样品处理方法为12000r/min离心1min后弃掉上清加入1mL磷酸盐缓冲液(PBS，配方：KCl 0.2g，NaCl 8g，Na₂HPO₄1.44g，KH₂PO₄0.24g，1000mL蒸馏水，pH＝7.6)溶液重悬后再以12000r/min离心1min弃掉上清，然后加入30μL的PBS和30μL上样缓冲液(1M Tris-HCl(pH＝6.8)1mL，200mM DDT 0.31g，4％SDS 0.4g，0.2％溴酚蓝0.02g，20％甘油2mL，7mL超纯水)重悬。100℃沸水中煮沸10min。用SDS-PAGE凝胶电泳鉴定是否表达。

1.2牛支原体rNOX蛋白的纯化 

将重组的BL21大肠杆菌按上述方法诱导表达后，取菌液8000r/min离心10min后弃掉上清，用500mL PBS洗一次后在8000r/min离心10min，再重复用500mL PBS洗一次。弃掉上清后加入30mL的PBS重悬，使用液压破碎仪破碎。破碎后12000r/min离30min，取30μL上清加入30μL上样缓冲液，在沸水中煮沸10min作为上清组。取一点沉淀加入30μL的PBS和30μL上样缓冲液煮沸10min作沉淀组。经过SDS-PAGE凝胶电泳后，确定rNOX大部分表达于上清中。

具体地，纯化步骤如下

(1)向亲和层析柱中加入4mL Ni-NTA金属螯合His蛋白纯化介质填料；

(2)向亲和层析柱中加入12mLddH₂O洗涤；

(3)加入12mL的banding buffer(20mM Na₃PO₄，0.5M NaCl，20mM咪唑，pH＝7.4)平衡柱子；

(4)加入经过0.45μm孔径滤器过滤的蛋白表达上清，收集前几滴滤出的液体，编号为1；

(5)加入50mL banding buffer平衡柱子，收集前几滴液体，编号2；

(6)加入50mL washing buffer(20mM Na₃PO₄，0.5M NaCl，60mM咪唑，pH＝7.4)洗去杂蛋白，收集前几滴，编号3；

(7)加入12mL elute buffer(20mM Na₃PO₄，0.5M NaCl,1M咪唑，pH＝7.4)洗脱目的蛋白，收集前几滴，编号4；

(8)将编号为1到4的管中各加入50μL上样缓冲液(SDS)煮沸10min；

(9)配置SDS-PAGE聚丙酰胺凝胶，将处理好的样品加入孔中20μL/每孔，电泳(浓缩胶直流电压为80伏特，分离胶直流电压为120伏特)，电泳完成后，取下凝胶用考马斯亮蓝染色过夜。然后脱色，确定得到纯化的目的蛋白。

1.3重组NOX蛋白的酶活性检测

首先配置20mM的磷酸钾缓冲液(含1mM的DTT，具体配方为：15.4mg DTT溶于100mL磷酸钾缓冲液)。取1mL磷酸钾缓冲液，实验组(即rNOX组)加入rNOX蛋白至浓度为5μg/mL，然后加入黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)辅基至浓度为10μM在室温作用5分钟后加入底物牛支原体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 氧化酶(即NADH，5mM)反应，每隔5分钟在OD＝_340nm处读数。对照组不加NADH、空白组不加rNOX，其他反应条件相同。

1.4单克隆抗体制备

1.4.1免疫小鼠

利用上述制备的牛支原体rNOX抗原免疫BALB/C小鼠，免疫程序如下：

(1)初次免疫,牛支原体rNOX抗原100μg/只鼠,加弗氏完全佐剂颈背部皮下多点注射，0.2mL/只鼠。

(2)二周后，第二次免疫,牛支原体rNOX抗原剂量100μg/只鼠，加弗氏不完全佐剂颈背部皮下多点注射。

(3)四周后，第三次免疫,牛支原体rNOX抗原剂量100μg/只鼠，加弗氏不完全佐剂颈背部皮下多点注射。

(4)7天后，剪尾尖采血，分离血清，用间接法ELISA测其效价，即用牛支原体rNOX抗原包板，加入小鼠血清稀释品于37℃孵育，洗板后加入HRP标记的羊抗鼠二抗(购自Southern Biotech公司)于37℃孵育，洗板后加入TMB底物显色，取效价高者做融合用。

1.4.2制备杂交瘤细胞：采用PEG介导融合方法 

SP2/0瘤细胞的准备：

(1)将冻存的SP2/0瘤细胞于200g离心去除冻存液后用RPMI-1640完全培养基(含15％胎牛血清，1％双抗贮存液，终浓度：链霉素100μg/mL，青霉素100U/mL)的RPMI-1640基础培养基(Heyclon))复苏，加入24孔细胞培养板中，于5％CO₂、饱和湿度的37℃条件下进行培养。

(2)用8-氮鸟嘌呤培养基(2mL 8-氮杂鸟嘌呤(50×)(购自Sigma公司)入到99mL RPMI-1640完全培养基(含15％胎牛血清，1％双抗贮存液，终浓度：链霉素100μg/mL，青霉素100U/mL)的RPMI-1640基础培养基)中筛选培养SP2/0瘤细胞7d，调整细胞浓度至106个/mL，取0.5mL于Balb/C小鼠背部皮下注射，可以注射多点。

(3)一般在10d后小鼠背部即会形成实体瘤，摘除眼球放血后处死小鼠，放于75％的酒精溶液中浸泡5min。

(4)用眼科剪和眼科镊剪开小鼠背部皮肤，剪下合适大小的肿瘤块置于匀浆器中，用眼科剪剪成小块，加入5mL RPMI-1640基础培养基(Heyclon)轻柔的研磨，加入7mL RPMI-1640基础培养基(Heyclon)，静置3-4min后吸取上层的细胞液7mL，加于50mL尖底离心管中，再向匀浆器中加入7mL RPMI-1640基础培养基(Heyclon)静置，重复上述步骤两次。

(5)将上步所得的培养基在1200r/min(离心力140g)水平离心10min，弃上清，用15-20mL RPMI-1640 基础培养基(Heyclon)重悬细胞。

(6)向50mL尖底离心管中加入淋巴细胞分离液(购自Sigma公司)15–20mL，将瘤细胞悬液缓慢加入，保持瘤细胞悬液位于淋巴细胞分离液上层，1800r/min(离心力310g)水平离心20min，在界面处可见白色细胞层，将白色瘤细胞层用吸管小心吸出(勿吸取下层淋巴细胞分离液)，用RPMI-1640基础培养基(Heyclon)洗两次后备用。

饲养细胞的制备

(1)取一只6-8周龄的未免疫Balb/c小鼠，摘除眼球放血后处死小鼠，75％的酒精溶液浸泡5min，收集的血清即为阴性血清。

(2)固定小鼠四肢，用眼科剪和眼科镊剪开皮肤；换一套眼科剪和眼科镊将腹膜剪开一个小口，加入3mL基础培养基吹打几下，吸出放入一灭菌的50mL尖底离心管中，即为腹腔巨噬细胞。

(3)将小鼠四肢固定，用眼科剪和眼科镊剪开腹膜，取出脾脏，去除结缔组织，将脾脏剪开，放入无菌的匀浆器中。

(4)加3mL RPMI-1640基础培养基(Heyclon)于匀浆器中对脾脏轻柔的研磨，加入7mL的RPMI-1640基础培养基(Heyclon)，静置3-4min，吸取上层细胞液7mL于一无菌的50mL尖底离心管中，加入7mL RPMI-1640基础培养基(Heyclon)于匀浆器中，同上重复3次。

(5)用1200r/min(离心力140g)水平离心10min，去上清，用HAT培养基(2mL HAT盐(50×)加入到98mL RPMI-1640完全培养基中)重悬细胞沉淀，将重悬的细胞加入96孔细胞培养板中，每孔100μl，置于37℃恒温培养箱培养。

免疫小鼠脾细胞的制备：

取加强免疫的小鼠，断颈处死，取脾脏，制备脾细胞，操作同饲养细胞中脾细胞的制备。最后用RPMI-1640基础培养基(Heyclon)重悬备用。

细胞融合

(1)将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0以5：1-10:1比例(一般每只免疫小鼠能得到1-2×10⁸个脾细胞，因此可以不必计算脾细胞的数量，取1-2×107个骨髓瘤细胞SP2/0与所有脾细胞进行融合)加于50mL尖底离心管中，1500r/min(离心力210g)水平离心10min。

(2)弃去上清液，用无菌滤纸吸去残余基础培养基，轻磕离心管管底，使细胞沉淀松动。

(3)将离心管放于37℃水浴中，在1min内慢慢加入0.8mL的50％聚乙二醇4000(PEG4000)(提前预热至37℃)，边加边轻轻的搅拌，加完后继续轻轻搅拌30s，静置1min，。

(4)缓慢加入10mL 37℃预热的RPMI-1640基础培养基(Heyclon)。具体操作如下：第1min逐滴滴入 lmL。第2min加l mL，第3-4min加3mL，第5min加入剩余5mL，每次加时都需要不断地轻轻搅拌。最后缓慢加入30mL的RPMI-1640基础培养基(Heyclon)。

(5)在1000r/min(离心力100g)水平离心5min，去上清，37℃放置5-8min。

(6)用HAT培养基重悬细胞沉淀，向含有饲养细胞的96孔板中每孔加入100μL细胞悬液。置于5％CO₂，37℃培养箱中培养。

(7)第2天观察是否污染，第4天补加1滴HAT培养基，第8-10天每孔吸去100μL培养基更换为100μL的HT培养基(2mL HT盐(50×)加入到98mL RPMI-1640完全培养基中)。待细胞集落长至视野1/4-1/2时，可进行抗体检测。

1.4.3杂交瘤细胞的筛选

采用间接ELISA方法进行抗体检测。包被重组蛋白rNOX，每孔100ng 4℃孵育过夜，第二天取出后使用PBST(含0.5％吐温-20的磷酸盐缓冲液即PBS)洗涤3次，拍干后使用5％脱脂乳37℃温箱封闭1h，取出后PBST洗涤3次。加入杂交瘤细胞上清50μL，同时设一空白对照，于37℃孵育45min，PBST洗涤3次，加入1：5000倍稀释的羊抗鼠IgG-HRP，37℃孵育30min，PBST洗涤5次，加入TMB底物A(武汉科前动物生物制品有限责任公司)和TMB底物B(武汉科前动物生物制品有限责任公司)各50μl，避光显色10min，每孔加50μL终止液(武汉科前动物生物制品有限责任公司)终止反应，用酶标仪在630nm波长下测定OD值。

杂交瘤细胞的克隆

(1)制备小鼠的饲养细胞，并铺到96孔板中。

(2)将要克隆的杂交瘤细胞用200μL枪头轻轻吹下后计数。

(3)将细胞用RPMI-1640完全培养基(含15％胎牛血清，1％双抗贮存液，终浓度：链霉素100μg/mL，青霉素100U/mL)的RPMI-1640基础培养基)稀释至3个浓度，即每毫升培养基含50个、10个和5个细胞，将这三个浓度的细胞悬液按照100μl/孔分别加入96孔细胞培养板中，使每孔分别含5、1、0.5个细胞。

(4)第4天更换细胞悬液一次，观察并记录各孔的细胞生长情况。

(5)第7-10天，当细胞长到视野1/5-1/3时，检测杂交瘤细胞的抗体效价，选择抗体效价高、集落形态好、呈单集落生长的孔，继续单克隆。单克隆的使用的为HT培养基，至少克隆三次。

(6)三次克隆之后将阳性的杂交瘤细胞移至24孔细胞培养板中培养，原孔加HT培养基。待24孔板中细胞生长良好时，冻存杂交瘤细胞。

杂交瘤细胞的冻存与复苏

(1)杂交瘤细胞的冻存

及时冻存原始孔的杂交瘤细胞和每次克隆化得到的亚克隆细胞十分重要。杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法一样，原则上每支安瓿的细胞量应在1×10⁶个以上，但原始孔的杂交瘤细胞可以因培养环境不同而数量不同。细胞冻存液配方(体积比)：90％小牛血清，10％DMSO(二甲基亚砜)。冻存液最好预冷，操作时务必动作轻柔、迅速。冻存时从室温可立即降至0℃后放入-70℃超低温冰箱，次日转入液氮中。也可用细胞冻存装置进行冻存。冻存细胞要定期复苏，检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性，在液氮中细胞可保存数年或更长时间。

(2)细胞复苏方法 

将玻璃安瓿自液氮中小心取出，放37℃水浴中，在1min内使冻存的细胞解冻，将细胞用RPMI-1640完全培养基(含15％胎牛血清，1％双抗贮存液，终浓度：链霉素100μg/mL，青霉素100U/mL)的RPMI-1640基础培养基)洗涤两次，然后移入前一天已制备好的饲养层细胞的培养瓶内，置37℃、5％(v/v)CO₂孵箱中培养。当细胞形成集落时，检测抗体活性。

单克隆抗体的扩大制备

制备腹水：先腹腔注射0.5mL弗氏不完全佐剂于BALB/C鼠，7d后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细胞10d后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多、而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获5～10mL腹水。也可用注射器抽提腹水，可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达到5～10mg/mL，这是目前最常用的方法，还可将腹水中细胞冻存起来，复苏后转种小鼠腹腔则产生腹水快、且量多。

1.5单克隆抗体的纯化和鉴定

1.5.1单克隆抗体(简称单抗)纯化

(1取500μL腹水与1mL的banding buffer(20mM Na₃PO₄，pH＝7.4)混合，过0.22μm滤膜。

(2)使用10mL的binding buffer预平衡protein G柱子。

(3)混合过滤膜后的腹水加入柱子，收集穿流液重新上柱。

(4)使用10mL的binding buffer洗杂蛋白。 

(5)使用5mL的Elution buffer洗脱单抗。 

(6)向洗脱的单抗中加入1M Tris-HCl(pH＝9)至pH为7.0。

(7)纯化后的单抗使用BCA蛋白测试试剂盒(购自Sigma公司)测浓度，经过SDS-PAGE鉴定单抗的纯度。

1.5.2单克隆抗体的抗原表位和特异性鉴定

在PPLO培养基(PPLO 10.5g，酵母粉2.5g，丙酮酸钠0.5g，超纯水定容至440mL，121℃灭菌20min后， 加入马血清50mL，灭菌10×MEM 5mL,无菌8万单位/mL青霉素溶液5mL，无菌1％酚红溶液500μL)中分别培养下列用于检测的单克隆抗体的抗原表位和特异性鉴定的菌株(这些菌株属于检测菌株即媒介菌株，并不是属于遗传资源的菌株，本实施例的实施例并不限制如下述菌株)例如：牛支原体HB0801株(华中农业大学农业微生物学国家重点实验室动物病毒学分室2008年6月从湖北省应城市某养牛场患病的黄牛的肺组织病料中分离得到一株牛支原体本地分离株HB0801，申请人将其命名牛支原体HB0801，Mycoplasma bovis HB0801,于2010年2月1日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO：M2010040)、无乳支原体标准株PG2(购自美国典型培养物保藏中心，编号ATCC no:35890)、丝状支原体山羊亚种标准株PG3(购自中国兽医药品监察所兽用典型培养保藏中心，编号CVCC368)、牛支原体标准株PG45(购自美国典型培养物保藏中心，编号ATCC no:25523)、精氨酸支原体(购自中国兽医药品监察所兽用典型培养保藏中心，编号CVCC 346)、绵羊肺炎支原体标准株Y98(购自美国典型培养物保藏中心，编号ATCC no:29419)，通过超声破碎的方法提取各自的全菌蛋白。将纯化的rNOX蛋白、牛支原体HB0801代全菌蛋白、无乳支原体标准株PG2全菌蛋白、丝状支原体山羊亚种标准株PG3全菌蛋白、牛支原体标准株PG45全菌蛋白、精氨酸支原体全菌蛋白、绵羊肺炎支原体标准株Y98全菌蛋白进行SDS-PAGE电泳，经过半干转印到硝酸纤维素膜上(25V，40min)，5％脱脂奶在4℃封闭过夜，TBST洗膜三次，用纯化的单抗8b7(体积比1：1000稀释)做为一抗在室温下作用1小时，用TBST洗膜三次，与1：10000倍稀释的HRP-羊抗鼠IgG孵育1小时，用TBST洗膜三次，再用TBS洗膜三次，用Super Signal West Pico Trial Kit(购自Thermo scientific)显色。结果显示8b7单抗可以识别纯化的rNOX(54kD)和牛支原体F1代菌株中49kD大小的蛋白。该单抗可以识别牛支原体临床分离株HB0801株、牛支原体标准株PG45和无乳支原体。不与精氨酸支原体、绵羊肺炎支原体标准株Y98以及丝状支原体山羊亚种标准株PG3反应。

实施例2：利用免疫荧光法鉴定牛支原体感染细胞

将牛支气管上皮细胞于6孔板中培养12小时，每孔细胞量为10⁶个。无菌PBS洗涤三次后，实验组每孔加入1mL MEM液体培养基和10⁹CFU牛支原体，对照组加入1mL MEM液体培养基(Heyclon)。37℃感染2小时后，用大量的PBS洗去未结合的牛支原体。用4％的多聚甲醛室温固定10分钟，然后使用0.5％的TritonX-100通透5分钟，PBS洗涤3次后，用含5％(m/v)牛血清白蛋白(即BSA，购自Sigma公司)的PBS溶液37℃封闭1小时。然后PBS洗涤三次后加入1mL含5％(m/v)BSA的PBS溶液和1μL 8b7单克隆抗体37℃孵育1小时。PBS洗涤三次，加入3000倍稀释的FITC标记的羊抗鼠的二抗，37℃孵育1小时后，PBS洗涤三次，用100nM的罗丹明室温染色30分钟。PBS洗涤三次，使用DAPI对细胞核染色，室温染色5min。PBS洗涤三次后，使用抗荧光猝灭剂封片。在激光共聚焦显微镜下观察实验结 果。

牛支原体肺炎的发生与牛运输应激紧密相关。随着养牛业的发展，牛的运输将越来越常态化，因此，牛支原体的检测对牛支原体肺炎的诊断将变得越来越重要。虽然牛支原体表面抗原结构多变，但NOX蛋白是牛支原体一种保守的表面蛋白，且免疫原性强，非常适合于用作牛支原体检测的靶标分子。因此，以rNOX蛋白为抗原制备的特异性单克隆抗体8b7对制备牛支原体检测试剂盒具有重要意义。

附录说明：

1、本发明的杂交瘤细胞株以杂交瘤细胞株8B7命名；单克隆抗体以单克隆抗体8b7命名。

2、rNOX蛋白前的“r”表示“重组”的含义，rNOX蛋白与重组NOX蛋白同义。