一种与柑橘果实贮藏寿命相关的分子标记引物及应用

技术领域

本发明涉及柑橘贮藏及分子生物学领域，具体涉及一种与柑橘果实贮藏寿命相关的分子 标记引物及应用。

背景技术

柑橘在世界范围内广泛栽培，已经成为全球第一大水果。柑橘产量高并且成熟期相对集 中，为保证市场供应的平衡，柑橘果实采后贮藏就显得十分重要。然而，柑橘贮藏期间因环 境和病害的影响导致大量果实在出售前就已经失去商品价值，导致大量经济损失。若能够开 发表征柑橘贮藏寿命的生物标记，就能够对果实在贮藏期间的生理状态进行监测，让果实在 其风味最佳时期上市，不仅可以减少经济损失，又可以使消费者尝到鲜美的果实。

生物标记指一个可以预测一些生物状态或是生物条件的特定指标，如血液中的小分子。 目前，关于生物标记的研究在医学、细胞生物学、地质和天体生物学中广泛应用，特别是在 医学研究中的癌症诊断和治疗方面。例如，在临床医学中，生物标记被细分为筛选标记、诊 断标记、预诊标记、预测标记和监控标记，他们分别用于分析癌症的不同阶段(Fan Zhang  and Jake Y.Chen，2013,Data Mining Methods in Omics-Based Biomarker Discovery)。 在植物的研究中，生物标记更多的是应用于植物采前发育阶段的研究(Juanjuan Zhang 201 0,Agudelo-Romero,Erban et al.2013)或是比较生物逆境和非生物逆境对生物造成的不 同影响(Ramakrishna 2014)。目前还没有在植物果实采后贮藏阶段运用生物标记对果实的 生理状态进行预测和鉴定的研究。

柑橘果实采收以后脱离了树体，形成了相对独立的代谢个体。由于能量库源关系的改变， 会发生一系列的生理生化变化，特别是对果实采后品质和风味影响较大的糖酸、酚类、萜类 物质。但果实在逐渐衰老的过程中，对果实的风味起主要作用的柠檬酸和葡萄糖等物质的变 化呈现出一种波动趋势(Xiaohua Sun 2013)，因此这些物质并不能明显区分柑橘果实在采 后贮藏过程中的生理状态，也无法用主要有机酸和糖类作为预测柑橘果实贮藏寿命的生物标 记。然而，运用传统的基因表达分析手段，无法快速的大规模的检测其他微量物质的变化。

随着基因芯片技术和二代测序技术的发展，柑橘基因组草图已经完成(Xu,Chen et al. 2013)，使得在全基因组水平上检测柑橘在采收贮藏过程中的基因的表达趋势变化成为可能。 本发明运用时间序列的芯片数据经过分类处理可以在全基因组水平将柑橘采后贮藏过程分 为三个生理阶段，并筛选出能够表征这三个不同生理阶段的一个生物标记。

发明内容

本发明是通过对温州蜜柑采后贮藏0-50d过程中基因中芯片数据的分析，筛选出能够预 测柑橘果实贮藏寿命的生物标记谷胱甘肽S-转移酶(Cit.15371.1.S1_at)，在此基因序列 的基础上提供了一种基于谷胱甘肽S-转移酶基因序列的qRT-PCR的引物：CGGGATGGATGCC AACAA；GCCTGGCCTTTTCCCATAAT。

本发明的另一个目的在于提供了基于谷胱甘肽S-转移酶基因序列的qRT-PCR的引物 在预测柑橘贮藏寿命中的应用，特别适用于预测温州蜜柑贮藏寿命。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

本发明运用R软件mixOmics包对温州蜜柑采后贮藏0-50d的基因芯片数据进行主成分 分析(PCA)和最小二乘法判别分析(PLS-DA)，获得了谷胱甘肽S-转移酶基因与柑橘的贮 藏寿命相关。

因此根据谷胱甘肽S-转移酶基因设计相关的qRT-PCR引物，可根据谷胱甘肽S-转移酶 基因的表达量判断某一批柑橘果实的贮藏寿命。

具体的，本发明涉及的引物及判定方式如下：

基于谷胱甘肽S-转移酶基因设计qRT-PCR的引物：CGGGATGGATGCCAACAA；GCCTGGCCTTT TCCCATAAT；进行qRT-PCR反应，可判断柑橘的贮藏寿命。

本发明特别对温州蜜柑进行了检测，结果显示：

在采后贮藏初期谷胱甘肽S-转移酶基因表达量范围在0.8-1.0,风味最佳期谷胱甘肽S- 转移酶基因表达量范围在0.7-0.8，采后贮藏末期表达量低于0.7。

本发明中果实采后贮藏从温州蜜柑果实套袋当天计算，柑橘果实采后贮藏阶段实际上是 一个果实成熟衰老的复杂过程,在果实采后贮藏阶段品质和风味会发生一系列复杂变化，如 主要糖类的波动性升高，有机酸的波动性降低。在贮藏过程中温州蜜柑的糖酸比将直接影响 果实的风味，本发明将温州蜜柑贮藏过程中糖酸比处于适宜水平的阶段定义为风味最佳期， 温州蜜柑套袋后适应贮藏环境的时期称为采后贮藏初期，温州蜜柑果实逐渐衰老失水阶段称 为采后贮藏末期。

本领域技术人员，可利用本发明提供的分子标记引物，根据不同柑橘品种中谷胱甘肽S -转移酶基因表达的变化情况，来预测柑橘的贮藏寿命。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1)明确标记基因：现有关于柑橘采后衰老的研究，很大程度上只是做出相关性结论，并没 有指出具体基因能够用来表征温州蜜柑采后贮藏的生理阶段，本发明明确指出标记基因谷胱 甘肽S-转移酶(Cit.15371.1.S1_at)。

2)应用前景广：对温州蜜柑采后贮藏阶段贮藏寿命的预测，能够推动温州蜜柑在风味最佳 时期销售，不仅为果实的最佳销售时期提供了很好的理论依据，而且能为贮藏量达千吨级的 企业作好风险预测。

附图说明

图1为PCA分析将温州蜜柑采后贮藏时期划分为3个不同阶段(生理状态)示意图。

图2为PLS-DA分析将温州蜜柑采后贮藏时期划分为3个不同阶段(生理状态)示意图。

图3为实施例1中qRT-PCR验证候选生物标记的表达趋势示意图。

图4为实施例2中qRT-PCR验证谷胱甘肽S-转移酶(Cit.15371.1.S1_at)的表达趋势示意图。

具体实施方式

实施例1：

与柑橘果实贮藏寿命相关的分子标记引物的获得：

①对0-50d柑橘基因芯片数据运用R中bioconductor软件包预处理后，进行biweight归一 化，以0.5为阈值筛选出5232个差异基因；

②对差异基因进行无监督的主成分分析(PCA)，可以将柑橘采后贮藏的生理状态初步划分为 三个(图1)。

③根据上述初步分类再运用有监督的机器学习方法最小二乘法(PLS-DA)对温州蜜柑果实采 后生理状态进行细分(图2)。

④依据PLS-DA模型中变量重要性(VIP>1.5)可筛选出外层包膜蛋白(Cit.19708.1.S1_s_ at，VIP＝1.505351997)、葡萄糖磷酸变位酶(Cit.11441.1.S1_at，VIP＝1.502331574)、谷 胱甘肽S-转移酶(Cit.15371.1.S1_at，VIP＝1.500944055)3个基因在温州蜜柑整个贮藏过程 中具有明显表达趋势的基因。

⑤供试用的柑橘果实为温州蜜柑，采摘后去除病虫果及烂果，放于自然条件下发汗2天后， 套袋贮藏于002实验室。每隔2至5天进行果肉取样，，直到果实90％失去商品价值。取样 时间如图3，共取样8次。提取样品RNA，用液氮对进行速冻并置于-80℃冰箱中保存，备 用。根据上述分析设计筛选出的外层包膜蛋白(Cit.19708.1.S1_s_at，VIP＝1.505351997)、 葡萄糖磷酸变位酶(Cit.11441.1.S1_at，VIP＝1.502331574)、谷胱甘肽S-转移酶(Cit.153 71.1.S1_at，VIP＝1.500944055，SEQ ID NO.1所示)3个基因的引物(表1)，进行qRT-PCR 定量验证。

表1

实时荧光定量PCR检测是利用ABI 7500 Real Time System(PE Applied Biosystems， Foster City，CA，USA)完成的。试验中采用SYBER GREEN PCR Master Mix(PE Applied B iosystems)定量基因的表达量，10μL体系按照以下程序进行：

1)50℃2min；

2)95℃1min；

3)95℃15s，40个循环；

4)60℃1min，40个循环。

基因表达水平的数据由软件Sequence Detector version 1.3.1software(PE Applied Bi osystems)自动生成。

图3结果显示，从温州蜜柑采后贮藏开始到果实失去商品价值的整个过程中，外层包 膜蛋白(Cit.19708.1.S1_s_at)、葡萄糖磷酸变位酶(Cit.11441.1.S1_at)、谷胱甘肽S- 转移酶(Cit.15371.1.S1_at)3个关键基因都呈现出下降趋势，但只有谷胱甘肽S-转移酶(C it.15371.1.S1_at)瞬时表达趋势与芯片数据中基因表达趋势最为接近。在贮藏初期，柑橘 果实生命力仍然旺盛，抗逆境的能力较强，这和谷胱甘肽S-转移酶表达量在开始时处于一 个波动的高位相关，随着贮藏时间的增长，柑橘果实自身能量的消耗，谷胱甘肽S-转移酶 表达量有一定的下降，这也导致果实抗逆境的能力逐渐下降，到温州蜜柑果实逐渐失去商品 价值时，谷胱甘肽S-转移酶将持续波动下降到一个更低的状态。因此，在温州蜜柑采后贮 藏阶段，谷胱甘肽S-转移酶基因的表达量可以作为生物标记很好的表征柑橘在采后贮藏的 生理状态和贮藏寿命。它可以催化还原性谷胱甘肽与外来有害物质结合，在果实处于生物逆 境时，发挥脱毒和抗氧化的作用。因此，利用谷胱甘肽S-转移酶基因的引物：CGGGATGGATG CCAACAA；GCCTGGCCTTTTCCCATAAT；进行qRT-PCR反映，可判断柑橘的贮藏寿命，其中在 采后贮藏初期Cit.15371.1.S1_at表达量范围在0.8-1.0,风味最佳期Cit.15371.1.S1_at 表达量范围在0.7-0.8，采后贮藏末期表达量低于0.7。

实施例2：

基于谷胱甘肽S-转移酶基因序列的qRT-PCR的引物在预测柑橘贮藏寿命中的应用：

1)温州蜜柑于2014年8月采摘于云南，经发汗处理后贮藏于华中农业大学通风库中(温度 16-20℃，相对湿度85％-90％)，自发汗处理后，温州蜜柑的平均贮藏时间为30-60d，这主 要由贮藏的温度及周围环境决定。

2)每隔几天(具体的参数如表2所示)随机取8-10个果实，对果肉进行取样，均匀混合得 到混样，直到果实90％以上失去商品价值(失去商品价值指得是果皮出现严重失水及腐烂, 消费者无购买欲望)。样品用液氮对进行速冻并置于-80℃冰箱中保存，备用。

3)提取样品RNA,用qRT-PCR进行定量验证试验，测定谷胱甘肽S-转移酶(Cit.15371.1.S1 _at)的相对含量，结果如图4，表2。

表2

从图4及表2中可以看出，预测Cit.15371.1.S1_at含量在0.7-0.8时为风味最佳期， 采后贮藏末期为0.7以下，0.8-1.0为采后贮藏初期。

将处于风味最佳期的蜜柑测定其糖酸比，其糖酸比范围在12.43～14.15之间，这正好处 于具有良好风味柑橘果实的糖酸比6.56～20.11的范围内(曾祥国，2005，不同种类和产区 柑橘糖酸含量及组成研究)，与本发明的预测相符。

                         SEQUENCE LISTING

<110>  华中农业大学

<120>  一种与柑橘果实贮藏寿命相关的分子标记引物及应用

<130>  一种与柑橘果实贮藏寿命相关的分子标记引物及应用

<160>  3    

<170>  PatentIn version 3.1

<210>  1

<211>  718

<212>  DNA

<213>  柑橘

<400>  1

tgcatattca gtacagttat gaaaatttca ttgcaggttc cctttcatga ttgacccaaa     60

tactggtgtt tcaatgtatg agagtggtga tattgtcaac tacctatttc agcagtatgg    120

taaaggaaga agcccttcga cagggctgtt ggaaagcaca ttgattacgg gatggatgcc    180

aacaattttt cgagcaggta gaggaatgac attatgggaa aaggccaggc cagacccccc    240

ttccaaaaag ttggaacttt tctcatatga gaacaatcca tatgcacgaa ttgtgcgtga    300

ggcactatgt gaattggagc ttccttacat ccttcagaat gtgggagacg ggtcttcccg    360

aacaaagttg cttgtcgata taactggatc caaagaggtg ccctatctaa ttgatccaaa    420

caccagtact caaatcggtg actacaaaaa gatcttatct tatttgttcc agtcatattc    480

agcttcccct tcccctgtgt agtttactcc gtaatattct ctactcaatg taagctaatt    540

ttacacctat ctacttcatg tcttaaaaca aagttttctg gtgttaacat atatctatat    600

gtatataatg agccctgtag gttgtgtttg ccgatggctc tgggttgtgc ttttcaagca    660

taattatctc tatttgctga gtaatagtta atcattattc taaaaaaaaa aaaaaaaa      718

<210>  2

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  2

cgggatggat gccaacaa                                                   18

<210>  3

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  3

gcctggcctt ttcccataat                                                 20