分别可生产丁酸和正丁醇的菌株、及生成正丁醇的方法

技术领域

本发明关于一种利用代谢工程构建的菌株，且特别关于一种利用此技术构建而成 并可生产丁酸的菌株、与生产正丁醇的菌株。

背景技术

丁酸为一种短链脂肪酸并可用于多种不同用途。举例而言，丁酸的衍生物丁酸酯 (butyrate ester)可为饮料、食品或化妆品的调味剂(参阅Armstronga and Yamazakib 1986、Dwidar et al.2012)。另举例而言，丁酸与纤维素组成的聚合物可用来制造塑料 或纺织纤维(参阅Cao et al.2011、El-Shafee et al.2001)。更举例而言，丁酸具备抗癌 疗效(参阅Rephaeli et al.2000)。此外，由于丁酸为正丁醇等生物燃料的前驱物，故 其商业价值相当可观。已有文献提出触媒转化丁酸成正丁醇的方法，如微生物的生物 转化、或化学催化剂涉及的氢化反应(参阅Dwidar et al.2012、Kim et al.2011)。

丁酸目前在商业上的制造为采用原油为原料的化学合成(参阅Cascone2008)。然 而，由于对全球暖化的关切与自然产物的需求已迫使产业重视丁酸的发酵制造。梭菌 属(Clostridium)为一种格兰氏阳性并产孢子的绝对厌氧菌。由于梭菌属具高丁酸产 率与产效，长久以来一直研究此菌的丁酸生成(参阅Zhang et al.2009)。不过，梭菌 属的发酵相当繁琐，故须相当注意影响丁酸生成的原因(参阅Dwidar et al.2012)。梭 菌属的典型发酵按顺序有产酸(acidogenesis)阶段与产溶剂(solventogenesis)阶段。 在第一阶段，丁酸、乙酸及氢为主要产物。接着，所产生的酸在第二阶段中的再吸收 将生成丙酮、正丁醇与乙醇，这即为所谓的“ABE发酵(ABE fermentation)”(参阅 Jones and Woods1986)。另外，梭菌属的基因工具的缺乏与对其生理信息的了解的不 足也妨碍利用此菌生产丁酸的发展。

近年来，正丁醇已逐渐受到国内、外大厂的重视，此主要原因在于正丁醇具有高 能源密度与接近汽油的性质，且正丁醇还可产生较乙醇多的能量并具有低腐蚀性。于 是，无须更换现有的汽油输送管线及储存设备，便能将汽油替换为正丁醇，且正丁醇 的运送亦无安全疑虑。另外，正丁醇本身即可作为液态燃料。举例而言，85％正丁醇 与汽油的混合物可直接用于现有的汽油引擎，且燃烧后，仅排放二氧化碳，不会产生 SO_X、NO_X与一氧化碳等有毒气体。倘若正丁醇的来源为生物质，则其燃烧便可完成 自然界的二氧化碳循环，因此正丁醇亦可视为环境友好的绿色能源(参阅Duerre 2007)。正丁醇的传统制造为微生物的发酵。在公元1916年，人类便知道利用丙酮丁 醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)生产丙酮、正丁醇及乙醇，此为ABE发酵(参 阅Lee et al.2008)。在发酵过程中，先生产丁酸、丙酸、乙酸与乳酸，当发酵液的pH 值下降时，则会转入所谓蝴蝶(butterfly)代谢途径，以产生丙酮、正丁醇及乙醇(参 阅Jones and Woods1986)。由此可知，各界均重视如何从生物质来制得正丁醇。可想 而知的是：生物质的利用将能大幅降低石化燃料造成的温室效应。

大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)易培养，且易进行基因操作，因而已广泛用 作生物材料。另一个方面，大肠杆菌的生理信息与发酵技术均已详载于许多工具书。 许多研究也已提出利用大肠杆菌制造生物质燃料与高价值的化学物质(参阅Clomburg  and Gonzalez2010、Yu et al.2011)。为达成有效生产丁酸与正丁醇的目标，大肠杆菌 的代谢工程显然为一个可行的策略。

迄今仅有少数的利用大肠杆菌制造丁酸的研究。一个研究使用菌株脂肪酸逆向β 氧化反应(reverse β-oxidation)，此未涉及任何外源基因，且于48小时发酵后，菌株 可将30g/L葡萄糖反应成1.3g/L丁酸(参阅Seregina et al.2010)。另一个研究通过梭 菌属途径来导入丁酸合成途径至大肠杆菌内，从而还原乙酰乙酰辅酶A (acetoacetyl-CoA)成丁酰辅酶A(butyryl-CoA)，并导入内源tesB基因，从而转化丁 酰辅酶A成丁酸(参阅Lim et al.2013)，此研究结果显示丁酸/乙酸重量比值(B/A比 值)为41。为改进Lim等人提出的丁酸制备，近期的研究采取合成支架的方法，以结 合途径中的hbd基因、crt基因与ter基因等外源基因，而其菌株于葡萄糖馈料批式供 应48小时下，可将19g/L葡萄糖转化为7.2g/L丁酸(参阅Back et al.2013)。尽管Back 等人的技术可达到高丁酸产量，但同时伴随生产4g/L乙酸(亦即，B/A比值约为1.8)。 一般而言，B/A比值(或称“丁酸选择率(butyrate selectivity)”)越低，后续须耗费更 多金钱、时间或人力等成本来纯化丁酸，故B/A比值为一个衡量梭菌属发酵表现的指 标(参阅Zhang et al.2009)。即使不活化乙酸合成途径，酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum) 依然具有为介于5～7的B/A比值(参阅Liu et al.2006)。最新的研究指出，重新构建 困难梭菌(C.difficile)的丁酸合成途径于大肠杆菌内，所构建的菌株的丁酸产率为 0.27g/L，且同时仅会产生相当微量的乙酸(参阅Aboulnaga et al.2013)。

发明内容

本发明的第一方案提出一种可生产丁酸的菌株，其为大肠杆菌，且包含λ噬菌体 P_L启动子、齿垢密螺旋体(Treponema denticola)的ter基因、丙酮丁醇梭菌的crt基 因、钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)的phaA基因、及丙酮丁醇梭菌的hbd基因。λ 噬菌体P_L启动子镶嵌于菌株的染色体，以调控染色体上atoDA基因操纵子的表达，而 ter基因、crt基因、phaA基因、及hbd基因镶嵌于菌株的染色体，且菌株缺少adhE 基因、frdA基因、及ldhA基因。

在本方案的实施方式中，λ噬菌体P_L启动子为镶嵌于染色体上atoDA基因操纵子 的上游区域，而较佳地为取代染色体上atoDA基因操纵子的启动子。

在本方案的实施方式中，ter基因、crt基因、phaA基因、及hbd基因的表达受另 一个λ噬菌体P_L启动子调控。

在本方案的实施方式中，菌株为大肠杆菌BL21的衍生品系，而较佳地为BL-A1。

本发明的第二方案提出一种可生产丁酸的菌株，其为大肠杆菌并培养于外加乙酸 的培养液中，以利用乙酸来生成丁酸，且包含λ噬菌体P_L启动子、齿垢密螺旋体的ter 基因、丙酮丁醇梭菌的crt基因、钩虫贪铜菌的phaA基因、及丙酮丁醇梭菌的hbd基 因。λ噬菌体P_L启动子镶嵌于菌株的染色体，以调控染色体上atoDA基因操纵子的表 达，而ter基因、crt基因、phaA基因、及hbd基因为镶嵌于菌株的染色体，且菌株缺 少adhE基因、frdA基因、ldhA基因、及pta基因。

在本方案的实施方式中，λ噬菌体P_L启动子镶嵌于染色体上atoDA基因操纵子的 上游区域，而较佳地为取代染色体上atoDA基因操纵子的启动子。

在本方案的实施方式中，ter基因、crt基因、phaA基因、及hbd基因的表达为受 另一个λ噬菌体P_L启动子调控。

在本方案的实施方式中，菌株为大肠杆菌BL21的衍生品系，而较佳地为BL-A1。

本发明的第三方案提出一种可生产正丁醇的菌株，其为大肠杆菌，且包含λ噬菌 体P_L启动子、及丙酮丁醇梭菌的adhE2基因。λ噬菌体P_L启动子镶嵌于菌株的染色 体，以调控染色体上atoDA基因操纵子的表现，而adhE2基因镶嵌于菌株的染色体， 且菌株缺少adhE基因、frdA基因、ldhA基因、及pta基因。

在本方案的实施方式中，λ噬菌体P_L启动子镶嵌于染色体上atoDA基因操纵子的 上游区域，而较佳地为取代染色体上atoDA基因操纵子的启动子。

在本方案的实施方式中，adhE2基因的表达受另一个λ噬菌体P_L启动子调控。

在本方案的实施方式中，菌株为大肠杆菌BL21的衍生品系，而较佳地为BL-A1。

本发明的第四方案提出一种由丁酸生成正丁醇的方法，此方法包含以下步骤：共 同培养如第二方案的菌株与如第三方案的菌株于含乙酸及葡萄糖的培养液中，由此前 者的菌株利用葡萄糖及乙酸来生成丁酸，而后者的菌株再利用丁酸及葡萄糖来生成正 丁醇及乙酸。

在本方案的实施方式中，培养液中的乙酸浓度为2g/L。

在本方案的实施方式中，后者的菌株相对于前者的菌株的起始细胞浓度比为1∶3 至2∶1，而较佳地为1∶2。

附图说明

图1为菌株BuT-8LA的丁酸合成途径。

图2为菌株BuT-8L-ato的丁酸合成途径。

图3说明了菌株BuT-8L、BuT-8LA、及BuT-8L-ato于含葡萄糖的培养液中发酵 24小时后产生的丁酸量及葡萄糖的剩余量。

图4说明了菌株BuT-8L-ato于含不同浓度乙酸钠的培养液中发酵24小时后产生 的丁酸量及葡萄糖的剩余量。

图5说明了菌株BuT-8L-ato先培养于含12g/L葡萄糖与8g/L乙酸钠的培养液中 24小时，再添加6g/L葡萄糖到培养液中持续培养后产生的丁酸量及葡萄糖的剩余量。

图6说明了菌株BuT-8L-ato先培养于含12g/L葡萄糖与8g/L乙酸钠的培养液中 24小时，再添加8g/L葡萄糖到培养液中持续培养后产生的丁酸量及葡萄糖的剩余量。

图7说明了菌株BuT-8L-ato先培养于含12g/L葡萄糖与8g/L乙酸钠的培养液中 24小时，再添加10g/L葡萄糖到培养液中持续培养后产生的丁酸量及葡萄糖的剩余量。

图8为菌株BuT-3BE的正丁醇合成途径。

图9说明了菌株BuT-3BE培养于外加5g/L酵母萃取物、20g/L葡萄糖及不同浓度 丁酸的M9矿物培养液中24小时后产生的正丁醇量与乙酸量。

图10为于共同培养菌株BuT-8L-ato与菌株BuT-3BE下的正丁醇合成途径。

图11说明了以不同菌株BuT-8L-ato与菌株BuT-3BE的起始细胞浓度比共同培养 此二种菌株于外加2g/L乙酸的培养液中24小时后产生的正丁醇量与丁酸量。

图12说明了先以菌株BuT-8L-ato与菌株BuT-3BE的起始细胞浓度比为1∶3 共同培养此二种菌株于外加2g/L乙酸的培养液中16小时，再另加入含菌株 BuT-3BE的菌液至培养液中使培养液总体OD₅₅₀值为2.0并培养8小时后产生的正 丁醇量与乙酸量。

具体实施方式

首先，介绍本发明提到的基因的全名，如下：adhE，乙醛辅酶A/乙醇脱氢酶 (acetaldehyde-CoA/alcohol dehydrogenase)；adhE2，丁醛/丁酸脱氢酶 (butyraldehyde/butanol dehydrogenase)；atoDA，乙酰乙酰辅酶A转移酶 (acetoacetyl-CoA transferase)；crt，巴豆酸酶(crotonase)；frdA，富马酸还原 酶(fumarate reductase)；hbd，3-羟基丁基辅酶A脱氢酶(3-hydroxybutyryl-CoA  dehydorgenase)；ldhA，乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase)；phaA，β-酮硫解酶 (β-ketothiolase)；pta，磷酸乙酰转移酶(phosphate acetyltransferase)；ter，反 烯酰基辅酶A还原酶(trans-enoyl-coA reductase)。

其次，为让本发明上述及/或其他目的、功效及特征能更明显易懂，下文特举 具体实施例做详细说明：

以下实施例使用的实验方法与材料，在此如下所述：

I、基因的剔除与插入

使用的菌株、载体与引物列示于表1。DNA操作为通过大肠杆菌DH5α(pir) 作为中介菌株来完成，发酵则为利用大肠杆菌BL21的衍生品系BL-A1来进行。

表1、实施例使用的菌株、载体与引物

表中缩写的全名为：ParaBAD，araBAD启动子；ori，复制起始点；PλP_RP_L，λ噬 菌体P_RP_L启动子；PλP_L，λ噬菌体P_L启动子；bla，抗氨苄青霉素(ampicillin)基因； cat，抗氯霉素(chloramphenicol)基因；kan，抗卡那霉素(kanamycin)基因；gen， 抗庆大霉素(gentamicin)基因。

大肠杆菌的frdA基因的剔除为参考Chiang et al.2008、Chiang et al.2011、Chiang et  al.2013等文献提出的方法来操作。详言之，先利用FrdA1引物(SEQ ID NO.：1)与 FrdA2引物(SEQ ID NO.：2)对大肠杆菌CGSC10964的染色体进行扩增，以得到含 插入到FRT-kan-FRT盒(cassette)的frdA基因的DNA片段。接着，电穿孔转化此片 段到含有载体pKD46的菌株内(参阅Datsenko and Wanner2000)。经菌株染色体与此 片段进行同源重组后，筛选出染色体带有此片段的菌株。最后，参考Datsenko and  Wanner2000以协助载体pCP20移除此片段的标记基因。同理，利用LdhA1引物(SEQ  ID NO.：3)与LdhA2引物(SEQ ID NO.：4)扩增大肠杆菌CGSC9216的染色体，以 得到含有插入到FRT-kan-FRT盒的ldhA基因的DNA片段，再利用此片段完成大肠杆 菌的ldhA基因的剔除；利用Pta1引物(SEQ ID NO.：5)与Pta2引物(SEQ ID NO.：6) 对载体pMC-ptaKm进行扩增，以得到含插入到FRT-kan-FRT盒的pta基因的DNA片 段，而利用此片段完成大肠杆菌的pta基因的剔除。

外源基因插入至大肠杆菌染色体的操作是参考Chiang et al.2012报导的方法来完 成的。详言之，先提供含有可表达整合酶(integrase)的载体pAH123的大肠 杆菌。接着，转化含有齿垢密螺旋体DSM14222的ter基因的载体pPhi-Ter至菌株内 (参阅Haldimann and Wanner2001)。在菌株染色体与此片段进行同源重组后，筛选出 染色体基因带有ter基因的片段在染色体的位的菌株。最后，参考Chiang et al. 2012以协助载体pTH19-CreCs移除此片段的标记基因。同样地，插入丙酮丁醇梭菌 DSM792的crt基因于菌株的染色体的λattB位也可实现。详言之，先提供含有可表达 λ整合酶的载体pINT-ts的大肠杆菌；后转化含有crt基因的载体pLam-Crt到菌株内(参 阅Haldimann and Wanner2001)。此外，得到的菌株的染色体还有额外的位位 于菌株染色体的adhE基因。详细地说，先对含有夹于-LE*-gen-RE*盒的二个 adhE基因衍生区域的DNA片段扩增，这些衍生区域为利用AdE1引物(SEQ ID NO.： 7)与AdE2引物(SEQ ID NO.：8)、及AdE3引物(SEQ ID NO.：9)与AdE4引物(SEQ  ID NO.：10)对载体pBlue-P80Gn进行重叠PCR(overlapping PCR)取得的(参阅Chiang  et al.2013)。在扩增的DNA片段电穿孔送进含有载体pKD46的菌株后，筛选出染色 体的位有adhE基因的菌株。接着，利用载体pPhi-PhaAHbd来将钩虫贪铜菌 的phaA基因与丙酮丁醇梭菌DSM792的hbd基因插入至菌株染色体的位，并 剔除其adhE基因。最后，以载体pLam-AdhE插入丙酮丁醇梭菌DSM792的adhE2基 因于菌株染色体的λattB位。

II、内源基因表达的增强

使用载体pPL-Gn将λ噬菌体P_L启动子嵌入到载体pBlue-LamGn。详言之，先以 LPL1引物(SEQ ID NO.：11)与LPL2引物(SEQ ID NO.：12)对载体pBlue-LamGn 扩增，后以LPL1引物与LPL3引物(SEQ ID NO.：13)对得到的产物扩增。第二次扩 增的产物与载体pPL-Gn经限制酶EcoR I剪切后，连接剪切产物使载体pPL-Gn具有 融合LE*-gen-RE*盒的λ噬菌体P_L启动子。另外，以RC13034引物(SEQ ID NO.：14) 与RC13035引物(SEQ ID NO.：15)扩增大肠杆菌BL21的染色体以得到含atoD基因 上游区域及其5’端区域的DNA片段。在DNA片段与载体pBluescript经限制酶EcoR V 与Sac I剪切后，连接剪切产物以获得载体pBlue-atoD。利用RC13036引物(SEQ ID NO.： 16)与RC13037引物(SEQ ID NO.：17)在载体pBlue-atoD上构建限制酶Nde I与BamH  I识别的酶切位点。此外，由载体pPL-Gn以限制酶Nde I与BamH I剪切来获得具有 融合LE*-gen-RE*盒的λ噬菌体P_L启动子的片段，并将此片段连接到载体pBlue-atoD， 以获得载体pSPL-atoD，其中载体pSPL-atoD有按顺序为atoD基因上游区域、 LE*-gen-RE*盒、λ噬菌体P_L启动子与atoD基因5’端区域的DNA片段。最后，在 RC13034引物与RC13035引物扩增DNA片段后，将扩增片段电穿孔转化到含载体 pKD46的菌株，让λ噬菌体P_L启动子嵌入到菌株的染色体，以调控染色体上的atoDA 基因操纵子。

III、菌株的培养

将大肠杆菌置于在37℃的LB培养液内隔夜培养，菌体浓度则是根据菌液的OD₅₅₀值确定。为产生丁酸，将隔夜培养过的菌株接种在容积125mL的锥形瓶内，瓶内有 50mL修饰TB培养液(含12g/L胰蛋白(tryptone)、24g/L酵母萃取物(yeast extract)、 2.13g/L磷酸二氢钾(KH₂PO₄)、12.54g/L磷酸氢二钾(K₂HPO₄))外加12g/L葡萄糖， 且菌液的起始OD₅₅₀值为0.1。为制备正丁醇，菌株是生长于M9矿物培养液(参阅 Miller1972)加上20g/L葡萄糖及5g/L酵母萃取物，且菌液的起始OD₅₅₀值为0.2。

IV、成分或酶活性的测定

葡萄糖、有机酸(如丁酸)及正丁醇的浓度主要是采用高效液相层析 (high-performance liquid chromatography，HPLC)与气相层析(gas chromatography， GC)来测定的(参阅Chiang et al.2012)。为测量酶AtoDA的活性，菌株在培养24小 时后，离心收集于67mM Tris-HCl(pH8.0)中。接着，超音波震荡以破碎菌株后，将 震荡后的溶液离心并取出离心得到的上清液(亦称作“无细胞萃取液(cell-free extract， CFX)”)。混合10μL CFX与90μL反应液(含20mM丁酰辅酶A、0.4mM乙酸钠(sodium  acetate)、67mM Tris-HCl(pH8.0))后，进行酶反应。反应约进行20分钟，并加热混 合液至100℃，持温10分钟来终止反应。利用HPLC定量混合液中的丁酸浓度，而酶 活性(U/mg)表示为单位重量的CFX在每分钟内所产生的丁酸摩尔数。

实施例1：菌株的丁酸合成途径的构建

丁酸合成途径是构建于大肠杆菌BL-A1中。根据文献Chiang et al.2013报导，此 菌株缺少poxB基因且其原先的转运葡萄糖系统已置换为运动发酵单胞菌(Zymomonas  mobilis)的glf基因。首先，剔除菌株的adhE基因、ldhA基因、frdA基因，以减少 NADH的消耗并减少副产物的生成。接着，受λ噬菌体P_L启动子调控的外源phaA基 因、hbd基因、crt基因与ter基因插入到菌株的染色体，此时的菌株称作“BuT-8L”。 据前文所述的“实验方法与材料”得知，在插入phaA基因及hbd基因的同时，亦剔 除菌株的adhE基因。如此一来，丁酸合成途径中的碳通量自乙酰辅酶A(acetyl-CoA) 转移到丁酰辅酶A。最后，通过融合λ噬菌体P_L启动子到菌株BuT-8L染色体的 atoDAEB基因操纵子来增强内源atoDA基因操纵子的表达，此融合菌株特别命名为 “BuT-8LA”(见图1)。依照前文“酶AtoDA的活性测试”，菌株BuT-8LA具有较菌 株BuT-8L大于8倍的酶活性(菌株BuT-8LA：0.56U/mg，菌株BuT-8L：0.07U/mg)。

实施例2：菌株的丁酸生成

为制造丁酸，将菌株BuT-8LA与BuT-8L各自分别振荡培养于含葡萄糖的培养液 的锥形瓶中。在发酵24小时后，菌株BuT-8LA可产生3.4g/L丁酸；反之，菌株BuT-8L 仅可产生1.0g/L丁酸(见图3)。由此可证实，菌株BuT-8LA具有较高的酶AtoDA的 活性，因此其能促进催化乙酸与丁酰辅酶A成丁酸及乙酰辅酶A。在菌株BuT-8LA中， 乙酸转化成丁酸以及丁酰辅酶A转化成乙酰辅酶A等这二个反应均以乙酰辅酶A为 反应前驱物。显然地，这二个转化反应的反应速率为不相等的，因而限制了丁酸的生 成。此现象从外加乙酸至菌株BuT-8LA可提高丁酸生成来获得证实(见图3)。不过， 菌株BuT-8LA构建的合成途径仍可增进丁酸的制造。

酶AtoAD催化丁酰辅酶A成丁酸的反应需要乙酸。这代表着可进一步了解乙酸 在菌株BuT-8LA中对丁酸生成的影响。首先，在外加2g/L乙酸到培养液中，菌株 BuT-8LA的丁酸产量可提高至4.1g/L(见图3)。须注意的是，pta基因与ackA基因均 涉及菌株BuT-8LA的乙酸生成。于是，将菌株BuT-8LA的pta基因剔除，以获得菌株 BuT-8L-ato(见图2)，菌株BuT-8L-ato仅可生产2.5g/L丁酸。综上，证实了乙酸为影 响构建的丁酸合成途径中的关键。

实施例3：乙酸对丁酸生成的影响

如图1，酶Pta、AckA与酶AtoDA的协同可在胞内循环制造乙酸。然而，乙酸的 胞内循环制造对于菌株BuT-8LA的丁酸制造并无显著的效果(亦即，较宜地外加乙酸 至菌株)。这意谓着乙酸的获得可限制丁酸的生成。因此，通过外加乙酸至菌株的方式 可提高丁酸的生成。为此，使用缺乏pta基因的菌株BuT-8L-ato来验证上述推论。如 图4所示，菌株BuT-8L-ato在发酵24小时后，可完全消耗掉葡萄糖，且菌株可根据 外加的乙酸钠含量的增加而提高丁酸产量。在外加乙酸钠含量为8g/L的状态下，菌株 BuT-8L-ato的丁酸产量可达到6.8g/L。此外，此菌株也可提高葡萄糖的消耗。由于葡 萄糖能提供菌株的丁酸生成所需的乙酰辅酶A，故丁酰辅酶A与乙酸的反应将驱使葡 萄糖的消耗。综上，可推论出乙酸对于丁酸生成途径具有积极的贡献。

实施例4：葡萄糖供料对丁酸生成的影响

可发现菌株BuT-8L-ato在发酵结束后，仍有一半的外加乙酸未反应掉。因此，推 测可通过外加葡萄糖的方式来消耗掉剩余的乙酸。首先，将菌株BuT-8L-ato培养于含 12g/L葡萄糖与8g/L乙酸钠的培养液中。在培养24小时后，添加不同量的葡萄糖至培 养液中并持续培养菌株。如图5至图7所示，随着培养时间愈久，菌株的丁酸产量愈 多。而且，如图6、7所示，在外加葡萄糖的浓度为8g/L及10g/L的条件下，菌株在 发酵48小时后，可产生超过10g/L丁酸。然而，此菌株的培养液仅剩余相当微量的乙 酸(小于0.07g/L)。

综合本实施例，菌株BuT-8L-ato培养在终浓度为20g/L葡萄糖与8g/L乙酸的条件 下，可在48小时内产生至少10g/L丁酸以及相当微量的乙酸。经计算得到：菌株的 B/A比值约为143，丁酸产率约为0.22g/L/h。如此，证明了本发明提出的可生产丁酸 的菌株具备高丁酸产量与产率、以及极高的B/A比值，这意谓着后续仅须耗费少数的 金钱、时间或人力等成本来纯化丁酸。

实施例5：从丁酸的正丁醇生成

如图8所示，正丁醇生成菌株的构建包含以下步骤。首先，剔除菌株的adhE基 因、ldhA基因、frdA基因、及pta基因，以减少NADH的耗费并减少副产物的生成。 接着，菌株染色体的内源atoDA基因操纵子的表达通过融合λ噬菌体P_L启动子到 atoDAEB基因操纵子来提高。最后，受λ噬菌体P_L启动子调控的外源adhE2基因插入 到菌株染色体内，此构建的菌株特别命名为“BuT-3BE”。

将菌株BuT-3BE培养于外加酵母萃取物(5g/L)、葡萄糖(20g/L)及丁酸(不同 浓度)的M9矿物培养液中。在24小时发酵后，菌株可产生正丁醇，且正丁醇的产 量随着外加的丁酸浓度增加而提高。请参照图9，在外加6g/L丁酸下，菌株的正丁醇 的最大产量为4.3g/L，乙酸的产量为3.6g/L，且正丁醇相对于丁酸的最大摩尔转化率 约为85％。然而，在外加7g/L丁酸下，菌株的正丁醇的产量则有减少的趋势，此现 象可能为过高浓度的丁酸对菌株造成细胞毒性所致。总括上述，本实施例说明了本发 明的可生产正丁醇的菌株可转化丁酸成正丁醇。

实施例6：采用二种不同大肠杆菌的共培养来生成正丁醇

由实施例4确知，菌株BuT-8L-ato需要乙酸来制造丁酸。另由实施例5确知，菌 株BuT-3BE利用丁酸来产生正丁醇，并伴随产生乙酸。因此，通过组合这二种菌株由 葡萄糖直接制造正丁醇应为可行的(见图10)。

本实施例是采用共同培养菌株BuT-8L-ato及菌株BuT-3BE来达到上述构思。二种 菌株是培养于M9矿物培养液中。培养液除了外加5g/L酵母萃取物与20g/L葡萄萄外， 还外加有2g/L乙酸来启动丁酸的制造。如图11所示，当菌株BuT-3BE及菌株 BuT-8L-ato的起始细胞浓度比为1∶2时，在培养24小时后，可得到约4.1g/L正丁醇。 且经估算后，正丁醇的产生速率约为0.171g/L/h。

另外，当菌株BuT-3BE及菌株BuT-8L-ato的起始细胞浓度比为1∶3时，在培养 16小时后，另加入含菌株BuT-3BE的菌液至培养液中使得培养液的整体OD₅₅₀值为 2.0，接着再另培养8小时。在总共发酵24小时后，可得到约5.5g/L正丁酸。且经估 算后，正丁醇的产生速率约为0.23g/L/h。

依据本实施例，证实了本发明提出的由丁酸生成正丁醇的方法为有效且为有潜力 的。

应理解上所述仅为本发明的优选实施例，但不能以此限定本发明实施的范围；因 此，凡根据本发明申请专利范围及发明说明书内容所作的简单的等效改变与修饰，都 仍属本发明专利涵盖的范围内。