通过单链扩增和测序对单个细胞进行精确基因组测序

关于联邦资助的研发的申明

本发明是在政府支持下获得美国国立卫生研究院的GM097253和HG00550资助而完成的。政府对本发明拥有一定的权利。

相关申请的交叉引用

本申请要求2012年9月12日递交的美国临时申请第61/700,276号的权益，其全部内容通过引用并入本文。

发明领域

本文的实施方案总体涉及用于对基因组核酸进行测序(包括对单个细胞的基因组核酸进行测序)的方法和装置。

发明背景

由Luria和Delbruck在他们的经典波动测试(Fluctuation Test)中开创了突变率的间接测量(Luria and Delbruck 1943)。通过量化显示表型改变的细胞数量来测量体细胞突变的概念被延伸至人类细胞，采用诸如HLA、HPRT或TK的基因。Albertini et al.1990，其全部公开内容通过引用并入本文。针对可以制备其转基因后代的模式生物如小鼠或苍蝇开发了lacZ报告子测定法(Garcia et al.2007，其全部公开内容通过引用并入本文)。这样的间接测定法通常假定突变的外显率为恒定水平，这可能是有问题的。此外，基于在整个基因组中具有恒定突变率的过于简单的假设，在千碱基大小的基因座中突变率的间接测量被外推到整个基因组。这些局限呼唤在人类细胞中全基因组范围内直接测量突变。最近在人类中直接测量生殖细胞系(germline)突变率(Roach et al.2010，其全部公开内容通过引用并入本文)，然而在Luria-Delbruck实验之后近80年内全基因组范围内体细胞突变率的直接测量仍然有待证实。

在DNA测序技术中的迅速发展已经使得能够对许多生物进行常规从头(de novo)测序以及对人类个体或人类癌症进行再测序(re-sequencing)。单个细胞测序实验已经被描述于Marcy et al.2007和Fan et al.Nature Biotechnology,2011,29:51–57中，其全部公开内容通过引用并入本文。

发明概述

本发明的一些方面提供了包括用于对单个细胞的基因组核酸进行测序的方法。所述方法包括：分离单个细胞的多个双链核酸，其中所述多个中每个双链核酸包含核酸第一链和核酸第二链，并且其中所述核酸第一链和核酸第二链彼此互补；将所述多个双链核酸中每个双链核酸的所述核酸第二链与所述核酸第一链分离；将所述多个双链核酸的所述第一链和第二链置于多个溶液中，其中所述多个溶液中每一个与每个其它溶液分开，并且其中在每个溶液中的链数量基本上类似；以及对每条链进行测序。在一些实施方案中，所述双链核酸包含染色体的部分。在一些实施方案中，所述双链核酸包含染色体片段的部分。在一些实施方案中，所述多个溶液中每一个具有大约10nl或更少的体积。在一些实施方案中，所述多个溶液中每一个具有大约4nl或更少的体积。在一些实施方案中，所述多个溶液中每一个具有大约2nl或更少的体积。在一些实施方案中，所述多个溶液中每一个具有大约1nl或更少的体积。在一些实施方案中，所述多个溶液中每一个具有大约0.4nl或更少的体积。在这些实施方案的一些方面，测序包含小于大约10¹²个中1个的错误率。在这些实施方案的一些方面，测序包含小于大约10¹⁰个中1个的错误率。在一些实施方案中，所述方法包括扩增每条链。在一些实施方案中，在测序之前将每条链在所述多个溶液之一中进行扩增。在一些实施方案中，扩增每条链包括多重置换扩增。在一些实施方案中，每条链被扩增至不超过大约10,000倍的幅度。在一些实施方案中，每条链被扩增至不超过大约1000倍的幅度。在一些实施方案中，每条链扩增不超过大约24小时。在一些实施方案中，每条链扩增不超过大约10小时。在一些实施方案中，每条链扩增不超过大约5小时。在一些实施方案中，所述多个溶液包含至少大约48个溶液。在一些实施方案中，所述多个溶液包含至少大约24个溶液。在一些实施方案中，所述多个溶液被放置于微流控装置中。在一些实施方案中，所述微流控装置如本文所述。在一些实施方案中，双链核酸的第一链和第二链在分开的溶液环境中的可能性至少大约95％。在一些实施方案中，所述可能性是至少大约98％。在一些实施方案中，所述核酸包含DNA。在一些实施方案中，所述单个细胞包含神经元。

本发明的一些方面包括用于对核酸进行测序的微流控装置，所述装置包括：用于对核酸进行测序的微流控装置，所述装置包括：单个细胞捕获模块；被配置用于细胞裂解和核酸链分隔(partitioning)的构件(member)；以及多个室(chamber)。所述单个细胞捕获模块可与所述构件流体连通，并且其中所述构件与所述多个反应室流体连通。所述装置被配置为在所述多个室中基本上平均分配(distribute)多个被分隔的单链核酸。在一些实施方案中，所述构件包含旋转构件。在一些实施方案中，所述构件包含被动扩散膜。在一些实施方案中，所述双链核酸包含染色体的部分。在一些实施方案中，所述双链核酸包含染色体片段的部分。在一些实施方案中，所述多个室中每一个具有大约10nl或更少的体积。在一些实施方案中，所述多个室中每一个具有大约4nl或更少的体积。在一些实施方案中，所述多个室中每一个具有大约2nl或更少的体积。在一些实施方案中，所述多个室中每一个具有大约1nl或更少的体积。在一些实施方案中，所述多个室中每一个具有大约0.4nl或更少的体积。在一些实施方案中，所述装置的内表面涂有非粘性聚合物。在一些实施方案中，所述非粘性聚合物包含PEG。在一些实施方案中，所述多个室包含至少大约24个室。在一些实施方案中，所述多个室包含至少大约48个室。在一些实施方案中，所述多个室中每一个被配置用于多重置换扩增。在一些实施方案中，所述微流控装置被配置为自动捕获单个细胞、裂解所述细胞并将所述细胞的单链核酸基本上平均分配至所述多个室。在一些实施方案中，所述多个室中每一个被配置为将一定量的流体转移至用于测序文库制备的反应容器。

附图简述

图1A是根据本文一些实施方案的微流控芯片的示意图。

图1B是根据本文一些实施方案的用于单个细胞捕获、分隔和扩增的三个模块示意图。

图1C是表示用图1A中所示装置处理的单个小鼠胚胎成纤维细胞的读取深度值分布的一系列图。

图1D是表示对应于图1A示意图的装置的照片。

图2A是表示根据本文一些实施方案的微孔阵列设计的一系列照片。每个所示的孔直径100μm。

图2B是表示根据本文一些实施方案的通过显微操作进行单个大肠杆菌细胞的扩增子提取的一系列照片。

图2C是表示根据本文一些实施方案所获得的单个大肠杆菌测序文库的读取深度值分布的对数的图。所限制的扩增和本文所示的新文库制备方法的组合显著改善了均一性。

图2D是表示根据本文一些实施方案所获得的单个大肠杆菌测序文库的读取深度值分布的图。所限制的扩增和本文所示的新文库制备方法的组合显著改善了均一性。

图3是表示根据本文一些实施方案的智人染色体19的代表性单个2.5Mb片段测序的图。完整的智人染色体被根据本文一些实施方案的方法进行分离、均一扩增和测序。值得注意的是，图3包括两张图，图3¹，代表图的左侧以及图3²代表右侧。

图4是表示根据本文一些实施方案对单个细胞的双链核酸进行测序的方法的流程图。

发明详述

一些实施方案包括被本文称为SISSOR(SIngle-StrandedSequencing using micrOfluidic Reactors，采用微流控反应器的单链测序)的用于单个哺乳动物细胞进行精确基因组测序的技术。单个细胞中双链核酸分子的两条互补链可以被分离以用于独立的扩增和测序，并且来自该沃森和克里克链的冗余测序数据可以被用于从测序错误中区分每个基因组几十个真正的突变，其有可能成为数以千计至数以万计的数字。在一些实施方案中，SISSOR的精确率比现有方法高10,000多倍。一些实施方案包括通过微流控装置实现SISSOR以实现三个主要功能：(1)单个细胞捕获，(2)裂解和单链DNA分隔，以及(3)单个分子全基因组扩增。

以足以检测稀有体细胞点突变的精确度在单个细胞中对哺乳动物大小的基因组进行测序可能是主要的挑战。这样的测序之前极其困难是因为：(i)哺乳动物基因组大(～10⁹bps)而体细胞突变率非常低(每次细胞分裂～10^-9bp)，需要具有极其低的假阳性率(～10^-10)的方法；(ii)来自单个细胞的DNA的体外扩增具有10^-6或比突变率高1,000倍的错误率，这是单个细胞测序的致命弱点：仅由聚合酶错误所产生的假阳性率就大大超过真正的突变了。

最近报道了许多对癌症单个细胞测序的研究，这在社会上产生了极大的兴奋。然而，这些现有方法只能检测大染色体区域的获得或丢失(Navin et al.2011)，或者错误率为10^-5的单个核苷酸变化(Hou etal.2012；Xu et al.2012)。癌症基因组还由于较高的突变率以及因此对测序错误的更低要求而代表了更加容易获得的成果。对于有限数量的体细胞类型，人们可以从稀释的单个细胞衍生出用于常规测序的克隆群体。但是，如在最近的研究中观察到的，体外克隆扩增可能引入另外的突变，并导致过高估计的突变率(Gore et al.2011)。在一个细胞分裂之后，大部分人类细胞类型中体细胞突变率的直接测量会涉及相对于这些现有技术改善～100,000倍的精确度。

用于精确测序的分离单个细胞的两条互补链的想法不容易实现。细胞中每个单个DNA分子会以所有的方式进入测序仪并产生可用的数据进行纠错。就申请人所能知道的，所有之前的全基因组扩增方法具有高扩增偏差，使得即使两条DNA链被分开了，这些之前的方法不能从两条链获得测序数据用于错误识别。尽管在过去十年中就改善全基因组扩增方法付出许多努力，直到本公开内容之前，扩增偏差已经成为单个细胞全基因组扩增中的主要问题。除了偏差的扩增之外，DNA片段还能够非特异性结合各种表面(移液器枪头、PCR管等)而丢失。当只有一个模板分子用于开始的时候，核酸分子的丢失代表了另一个挑战。

在最近的关于人诱导胚胎干细胞中体细胞突变的研究中，发现至少一半的突变以各种频率水平预先存在于该体细胞的前体细胞中，一些频率低至10,000个细胞中有五个(Gore et al.(2011)Nature 471:63-67)。一个接下来的假设是体细胞群中每个单个细胞携带大量的专有突变，并且这些突变在重新编程和克隆扩增之后变成固定的(有或没有选择)。为了检验该假设，我们可以直接对单个的前体细胞进行测序并且鉴定以10^-8或更低的频率发生的体细胞突变，这被认为用任何现有的技术是不可能。

另一个观察是对于神经元的核基因组来说，哺乳动物脑是镶嵌的，这是由于至少三种机制方面：非整倍体、LINE-1反转录转座子和其它DNA含量的变化。另外，TSRI的Jerold Chun的组发现的证据是，在特定皮层区域中神经元的体细胞基因组变化与许多脑疾病有关，包括阿尔茨海默氏症和自闭症谱系障碍。尽管所有这些观察结果所产生的兴奋，充分表征单个神经元中基因组多样性的程度之前被认为是不可能的，这源于与对单个细胞进行测序相同的技术局限。

在一些实施方案中，提供的方法和微流控装置提供高精确度(错误率～10^-10)、单个核苷酸的分辨率、远程(long-range)单倍型信息、不需要稀释的单个细胞克隆扩增、均一无偏差的DNA扩增和自动化选项。

根据本文一些实施方案的方法和微流控装置可以被用于各种应用，包括但不限于：癌症中稀有突变的早期检测、单个体细胞中稀有基因组突变的直接检测、产前基因诊断、其它涉及有限的DNA投入(input)和高精确率的遗传诊断。

根据本文一些实施方案的测序，可以允许与之前的方法相比精确度>10,000倍高的单个细胞基因组测序。一些实施方案利用在单个双链核酸的沃森和克里克链中(例如在染色体中)编码的冗余遗传信息来克服体外扩增错误的问题。链及其互补链能够各自进行测序，并且两条链的序列能够进行比较。如果在两条链的确定序列之间存在差异，这种差异是更可能代表体外测序错误而不是真正的突变。在一些实施方案中，所述链的序列与参考序列进行比较。如果两条序列链彼此一致，但与参考序列不同，所述链最可能含有相对于参考序列的突变或变异。示例性的突变或变异包括但不限于：单个核苷酸多态性(SNPs)、缺失、插入、重复和倒位。在一些实施方案中，所述参考序列是来自相同生物的不同细胞。在一些实施方案中，所述参考序列是来自不同的、相关生物的细胞(例如，相同物种的生物或系统发育相关的物种的生物)。

在一些实施方案中，提供了允许单个哺乳动物细胞的基因组测序的～10^-10的共有(consensus)错误率以对单个人类细胞直接测量体细胞突变的技术。

为此，在一些实施方案中提供了SISSOR(SIngle-StrandedSequencing using micrOfluidic Reactors，采用微流控反应器的单链测序)。SISSOR利用在单个细胞的沃森和克里克链中编码的冗余遗传信息来克服体外扩增错误的问题。SISSOR可以包括分开单个细胞中的双链核酸分子的两条互补链用于独立扩增和测序，和采用来自沃森和克里克链的冗余测序数据从数以千计至数以万计的测序错误中区分每个基因组几十个真正的突变。理论上，在根据本文的一些实施方案的SISSOR中，当DNA的两条互补链以10^-6的错误率在体外分别进行扩增时，人们能够实现10^-12的错误率，并且仅当来自两条链的测序数据一致时所述突变被识别。基于另外的错误源，包括嵌合序列、测序仪器的硬件噪音和计算作图错误，根据本文的一些实施方案，10^-10的错误率是可以实现的。从DNA分子的两条沃森和克里克链获得序列信息的概念常常被用于细菌克隆的Sanger测序中，如在人类基因组计划中人类参考基因组的产生。最近，相关概念被应用与第二代测序技术的精确度的改进(Schmitt et al.2012)。但是，就申请人所知道的，本文的实施方案代表了基于创新的微流控平台在单个细胞上第一次实现单链测序。

测序方法

根据一些实施方案，提供了对来自单个细胞的双链核酸进行测序的方法。所述方法可以包括从所述细胞分离多个双链核酸、分开双链核酸的链。所述方法可以包括将所述链置于多个溶液中，其中所述多个溶液中每一个与每个其它溶液分开，其中所述多个溶液中每一个具有大约4nl或更少的体积，并且其中在每个溶液中链的数量基本上类似。所述方法可以包括对所述链进行测序。

各种双链核酸可以被用于根据本文的实施方案，例如DNA、RNA或DNA-RNA杂交体。可被用于根据本文的实施方案的示例性的双链核酸包括染色体、小型染色体(minisome)、游离体(episome)、质粒或任何所列项的片段。虽然在本文的几个示例性的实施方案中讨论了染色体，本领域技术人员可以很容易地认识到其它双链多核苷酸可以被用于根据本文所公开的方法和组合物。在一些实施方案中，所述片段具有至少大约100kb的长度，例如大约100kb、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、20,000、30,000或40,000kb。

各种类型的单个细胞可以被用于根据本文的实施方案，例如，神经元、神经胶质细胞、生殖细胞、配子、胚胎干细胞、多能(pluripotent)干细胞(包括诱导的多能干细胞)、成人干细胞、造血谱系的细胞、多细胞生物的分化的体细胞、微生物细胞、癌细胞(包括例如癌症干细胞)、疾病的细胞等。

图4是表示根据本文的一些实施方案的对单个细胞的双链核酸进行测序的方法的流程图。所述方法可以包括分离单个细胞的多个双链核酸，其中所述多个中每一个双链核酸可以包含核酸第一链和核酸第二链，并且所述核酸第一链和核酸第二链彼此互补400。所述方法可以包括将所述多个双链核酸中每个双链核酸的所述核酸第二链与所述核酸第一链分离410。所述方法可以包括将所述多个染色体的所述第一链和第二链置于多个溶液中，其中所述多个溶液中每一个与每个其它溶液分开，并且其中所述多个溶液中每一个具有大约4nl或更少的体积，并且其中在每个溶液中的链的数量基本上类似420。所述方法可以包括扩增每条链430。在一些实施方案中，每条链被扩增不超过大约10,000倍，例如不超过大约1,000倍。所述方法可以包括对每条链进行测序440。在一些实施方案中，所述方法包括互相比较两条互补链的序列450。在一些实施方案中，所述方法包括将所述互补链的序列与参考序列进行比较460。在一些实施方案中，在单个微流控装置中进行整个方法。在一些实施方案中，在单个微流控装置中贯穿整个扩增实施所述方法430，在该点核酸的链被从微流控装置中取出，并用于构建测序文库。本领域技术人员应当理解的是，对于本文所公开的该过程和方法与其它过程和方法，在所述过程和方法中进行的功能可用不同顺序进行。另外，所概述步骤和操作仅作为例子提供，而一些步骤和操作可以是可选的，被组合成更少的步骤和操作、或被扩展成另外的步骤和操作而不脱离所公开的实施方案的本质。

本领域技术人员将会认识到，根据本文的实施方案，各种技术可以被用于从所述细胞分离核酸。在一些实施方案中，所述细胞被裂解，例如通过冻融循环(例如，在液氮中)、将所述细胞与碱性溶液(例如，氢氧化钾、氢氧化钠或另一种合适的强碱性溶液)接触、或将细胞与盐溶液(如N-月桂酰肌氨酸盐)接触。

在一些实施方案中，将所述多个双链核酸(例如，染色体)的所述第一链置于多个溶液，包括分开所述链并将所述链在多个溶液中进行分配。所述链可以被通过各种方法分配，例如，机械旋转或被动扩散。各种方法可以被用于将所述链分开，例如，碱变性或热变性。因此，在一些实施方案中，碱性溶液是用来既从细胞中分离核酸又将核酸的所述链分开。

在一些实施方案中，所述链通过将所述互补链彼此分开而被分配，并且然后温和地机械旋转所述链。不被任何特定的理论限制，温和的机械旋转可以使得单链多核苷酸的剪切最小化。温和的机械旋转可以在旋转构件中进行。在一些实施方案中，进行混合涉及打开和关闭与所述旋转构件流体连通的多个阀。在一些实施方案中，所述旋转构件包含环。在一些实施方案中，所述链被彼此分开，并且然后被置于所述旋转构件中。在一些实施方案中，所述链被置于所述旋转构件中，并且然后被彼此分开。机械旋转之后，所述链可以被在多个溶液中分配。

在一些实施方案中，通过将所述互补链彼此分开而分配所述链，并且然后被动扩散所述链进入多个溶液。在一些实施方案中，所述链被置于被动扩散器中，其包含与所述多个溶液流体连通的被动扩散膜。在一些实施方案中，所述链首先彼此分开，并且然后被置于所述被动扩散器中。在一些实施方案中，所述链被置于所述被动扩散器中，然后彼此分开再扩散进入所述多个溶液。

通过在多个不同溶液中分配所述链，对于每条染色体(或其它双链多核苷酸)，所述互补的核酸在分开的溶液中的可能性可非常高。在一些实施方案中，对于每条染色体，所述互补的核酸在分开的溶液中的可能性为至少95％，例如大约95.1％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或99.99％。对于所有双链多核苷酸的互补链在分开的溶液中的可能性可能取决于不同的双链多核苷酸的数量，其可以被单个细胞中的染色体数量和单个细胞的倍性所影响，并且因此，需要提供特定可能性的不同溶液数量可以不同。值得注意的是，通常，单个细胞中染色体(或双链核酸)的总数越低，所述链被分配使得所述互补核酸在分开的溶液中的可能性越高。在一些实施方案中，24个不同溶液提供相同的双链多核苷酸的两条链不在相同的溶液中的可能性大于95％。24个不同溶液能够确保对于二倍体人类基因组(23个染色体对)和二倍体小鼠基因组(19个染色体对)该至少95％的可能性，注意的是，由于二倍体小鼠比二倍体人类具有更少的染色体，对于二倍体小鼠，所述可能性会比二倍体人类稍微更高。在一些实施方案中，有至少10个不同溶液，例如，10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、、60、70、80、90或100个不同溶液。在一些实施方案中，所述不同溶液被放置于微流控装置中。在一些实施方案中，所述不同溶液与如本文所述的构件流体连通。

在一些实施方案中，所述多个溶液中每一个具有4nl或更少的体积，例如大约4nl、4nl、3.5nl、3nl、2.5nl、2nl、1.5nl、1nl、0.5nl、0.4nl、0.3nl、0.2nl、0.1nl、0.09nl、0.05nl和0.01nl，包括所列值的任意两个之间的范围。在一些实施方案中，所述多个溶液中每一个具有2nl或更少的体积。在一些实施方案中，所述多个溶液中每一个具有1nl或更少的体积。在一些实施方案中，所述多个溶液中每一个具有0.4nl或更少的体积。

在一些实施方案中，所述测序包括在所述溶液中对每条链进行扩增。在一些实施方案中，所述扩增包括多重置换扩增。不被任何特定的理论限制，已经可以在本文中观察到大约1000倍或更少的每条链的扩增产生沿着每个核酸非常均一的扩增(参见例如图1和3)。此外，不被任何特定的理论限制，虽然1000倍的扩增产生相对于大基因组(如人类和小鼠)非常均一的扩增，本文包括对于更小基因组可以用基本上更高倍数的扩增产生均一性。因此，在一些实施方案中，每条链被扩增不超过大约10,000倍，例如，不超过大约10,000倍、9000倍、8000倍、7000倍、6000倍、5000倍、4000倍、3000倍、2000倍、1500倍、1400倍、1300倍、1200倍、1100倍、1000倍、950倍、900倍、850倍、800倍、750倍、700倍、650倍、600倍、550倍、500倍、450倍、400倍、350倍、300倍、250倍、200倍、150倍、或100倍。在一些实施方案中，测序包括扩增每条链大约100倍－1000倍、大约200倍－1000倍、大约300倍－1000倍、大约400倍－1000倍、大约500倍－1000倍、大约600倍－1000倍、大约700倍－1000倍、大约800倍－1000倍、大约900倍－1000倍、大约950倍－1000倍、大约100倍－900倍、大约200倍－900倍、大约300倍－900倍、大约400倍－900倍、大约500倍－900倍、大约600倍－900倍、大约700倍－900倍、大约800倍－900倍、大约100倍－800倍、大约200倍－800倍、大约300倍－800倍、大约400倍－800倍、大约500倍－800倍、大约600倍－800倍或大约700倍－800倍。

期望的倍数扩增可以通过各种方法实现，例如反应体积、试剂的选择、试剂的浓度、反应条件(如温度等)和反应时间。在一些实施方案中，反应时间被用于控制所述倍数扩增。在一些实施方案中，每条链被扩增不超过24小时，例如大约24小时、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1小时。对于许多应用(例如，用于许多基因组大小)，扩增不超过5小时可能是合适的，但是本领域技术人员应当理解的是，这可能取决于本文所述的其它因素。在一些实施方案中，每条链被扩增不超过5小时。在一些实施方案中，每条链被扩增不超过3小时。

根据本文的一些实施方案可以使用各种扩增技术。在一些实施方案中，使用多链置换(multiple strand displacement)。多链置换可以在等温条件下进行，例如在大约30℃。可以被用于多链置换的示例性的酶包括Φ29DNA聚合酶和Bst聚合酶的大片段。不被任何特定的理论限制，模板核酸可以与多个随机引物接触(典型地，六聚体，但在一些实施方案中，五聚体、七聚体、八聚体等也可以是合适的)，其可以被聚合酶延伸，得到具有多个链的分支网络。所述网络可以通过将所述网络与产生切口的核酶(例如，S1核酶)接触来被去分支。然后，产物中的切口被用聚合酶修复，例如DNA聚合酶I。在一些实施方案中，采用热扩增，例如采用热稳定的聚合酶如Taq的热循环。可以进行引物与模板核酸的退火、引物的延伸和所得到的双链多核苷酸的变性的重复循环，以提供核酸的多个拷贝。在一些实施方案中，所述引物是随机的。在一些实施方案中，所述引物是非随机的。

各种技术可以被用于对溶液中的每条链进行测序。在一些实施方案中，所述测序包括每条链的扩增，例如Illumina^TM测序、IonTorrent^TM测序等。在一些实施方案中，所述测序是多重的(multiplex)。在一些实施方案中，所述测序监视在单个分子中碱基的掺入(包括，例如，碱基类似物的掺入)。在一些实施方案中，所述测序监视荧光标记的可逆终止子的掺入，使得允许核苷酸被一次一个地加入，所述碱基被识别并且荧光团被裂解以允许下一个荧光标记的可逆终止子的掺入。在一些实施方案中，所述链在包括所述构件的相同微流控装置中被测序。在一些实施方案中，所述链在所述微流控装置中扩增，并且扩增子被从所述微流控装置取出，并随后被用于制备测序文库。在一些实施方案中，所述扩增子通过显微操作从所述微流控装置取出。

在一些实施方案中，测序的错误率是单链体外测序的错误率的平方。似乎如果在两条链上相同的位置发生相同的错误，体外测序错误才会被错过。因此，假定没有偏差，对于特定碱基及其互补碱基将会发生的错误的可能性大约是体外测序错误率的平方。例如，如果对于个体链的错误率是10^-6，在两条链上相同位置将会发生错误的可能性是10^-6x 10^-16＝10^-12。此外，即便体外测序错误在两条链上相同位置发生，三分之二的核苷酸测序中随机错误会导致可检测到，并被识别为错误的错配碱基配对(例如，假定特定的位置具有碱基对A-T，在第一链上的随机错误可能是G、C或T，并且在第二链上的错误可能是A、G或C；因此，虽然三种可能的配对或错误的碱基可能不被检测到，G-C、C-G或T-A，剩下的六个可能配对，G-A、G-G、C-A、C-C、T-G或T-C会被识别为错误)。因此，在一些实施方案中，对于单个链错误率大约是体外测序错误率的平方的三分之二。在一些实施方案中，当两条链被测序时所述测序错误率是小于10^-9，例如大约10^-9、10^-10、10^-11、10^-12、10^-13、10^-14或10^-15、大约10^-9至大约10^-15、大约10^-9至大约10^-14、大约10^-9至大约10^-13、大约10^-9至大约10^-12、大约10^-9至大约10^-11、大约10^-9至大约10^-10、大约10^-10至大约10^-15、大约10^-10至大约10^-14、大约10^-10至大约10^-13、大约10^-10至大约10^-12、大约10^-10至大约10^-11、大约10^-11至大约10^-15、大约10^-11至大约10^-14、大约10^-11至大约10^-13、大约10^-11至大约10^-12、大约10^-12至大约10^-15、大约10^-12至大约10^-14、大约10^-12至大约10^-13、大约10^-13至大约10^-15、大约10^-13至大约10^-14或大约10^-14至大约10^-15。在一些实施方案中，所述错误率小于大约10^-12。

微流控装置

在一些实施方案中，提供了用于对核酸进行测序的微流控装置。所述装置可以包括单个细胞捕获模块。所述装置可以包括被配置用于细胞裂解和核酸链分隔(partitioning)的构件，例如旋转构件或被动扩散器。所述装置可以包括多个室(chamber)。所述单个细胞捕获模块可以与所述构件流体连通。所述构件可以与所述多个反应室流体连通。所述装置可以被配置为在所述多个室中基本上平均分配(distribute)多个被分隔的单链核酸。

图1A是根据本文一些实施方案的微流控芯片100的示意图。所述装置100可以包括单个细胞捕获室110，被配置用于细胞裂解和核酸链分隔120(例如，旋转构件和被动扩散器)的构件，和多个例如24个反应室130。在一些实施方案中，所述构件120裂解单个细胞并混合核酸。在一些实施方案中，所述构件120裂解单个细胞并分配核酸。在一些实施方案中，所述构件120与所述单个细胞捕获模块110相连。所述构件120可以与所述单个细胞捕获模块110流体连通。在一些实施方案中，所述构件120与每个反应室130相连。所述构件120可以与所述反应室130流体连通。在一些实施方案中，所述构件120直接与每个反应室130相连。在一些实施方案中，所述构件120通过通道与每个反应室130相连。在一些实施方案中，所述构件120直接与每个反应室130和/或单个细胞捕获模块110相连。因此，所述单个细胞捕获模块110、构件120和反应室130均彼此流体连通。在一些实施方案中，每个反应室与输出140例如出口阀流体连通。

参考图1B，后续提取和多核苷酸分析的单个细胞可以被放置于所述装置中。所述装置的单个细胞捕获模块110可以被配置为将溶液中的一个细胞移动至所述构件120。在一些实施方案中，所述单个细胞捕获模块与所述构件120流体连通。在一些实施方案中，所述单个细胞捕获模块120与用于向所述微流控装置加入包含一个或更多个单个细胞的样品的输入端口流体连通。在一些实施方案中，所述单个细胞包含模块110包括至少一个收窄口(constriction)，使得不超过一个细胞能够刚好一次通过所述收窄口。在一些实施方案中，所述单个细胞捕获模块110包括至少两个交叉的通道，其中所述交叉包括收窄口，使得不超过一个细胞能够一次通过所述通道之间。示例性的单个细胞捕获模块110如图1B中所示。

根据本文的一些实施方案的示例性微流控装置的图示于图1D中。本文所述的装置的实施方案有助于精确控制具有最小非特异性结合的DNA分子的混合和分隔。在一些实施方案中，所述装置采用构件如旋转构件，其允许染色体完全变性并就单链DNA分子平均分配到24个用于独立扩增的扩增室)。这能够确保两条互补DNA链被装载在两个分开的室中的可能性为至少大约>95％。此外，刚刚足够的扩增实现最大限度地减少来自单个细胞扩增偏差。在一些实施方案中，所述构件包括被动扩散膜。

溶液中核酸的分开的链能够在溶液室中进行分配。在一些实施方案中，所述链可以在所述室中被扩增。在一些实施方案中，所述装置具有24个室。在一些实施方案中，所述装置具有至少24个室。在一些实施方案中，所述装置具有至少48个室。在一些实施方案中，所述装置具有至少10个室，例如，10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个室，包括所列值的任意两个之间的范围。在一些实施方案中，所述装置具有20－30个室、20－40个室、25－30个室、25－40个室、15－25个室、15－30个室或15－40个室。在一些实施方案中，所述室的每一个与所述构件流体连通。在一些实施方案中，所述室的每一个通过连接所述构件至每个室的通道与所述构件流体连通。在一些实施方案中，所述室的每一个具有4nl或更少的体积，例如大约4nl、3.5nl、3nl、2.5nl、2nl、1.5nl、1nl、0.5nl、0.4nl、0.3nl、0.2nl和0.1nl，包括所列值的任意两个之间的范围。在一些实施方案中，所述室的每一个具有大约100μm的直径。在一些实施方案中，所述室的每一个具有大约50μm至150μm、50μm至200μm、100μm至150μm或100μm至200μm的直径。根据本文一些实施方案的示例性室如图2A中所示。

最小化核酸、细胞、细胞碎片等与所述装置的粘附是有帮助的。因此，在一些实施方案中，所述装置的内表面涂有非粘性聚合物。在一些实施方案中，所述非粘性聚合物包含聚乙二醇(PEG)。在一些实施方案中，所述非粘性聚合物包含聚四氟乙烯(PTFE)。

在一些实施方案中，所述多个室中每一个被配置为用于多重置换扩增。在一些实施方案中，每个室被配置为用于在等温条件下的扩增。在一些实施方案中，所述等温条件包括大约30℃。在一些实施方案中，所述室包括用于多重置换扩增的试剂，例如如Φ29DNA聚合酶的聚合酶、随机引物(例如，六聚体引物、七聚体引物、十聚体引物等)和/或三磷酸核苷酸。在一些实施方案中，所述装置包括加热元件、冷却元件或其二者以维持等温条件。在一些实施方案中，等温条件可以通过控制所述装置的环境温度来进行维持。

在一些实施方案中，所述微流控装置被配置为自动捕获单个细胞、裂解所述细胞并将所述细胞的单链核酸基本上平均分配至所述多个室。所述微流控装置的操作可以在计算机处理器的控制之下。

在一些实施方案中，所述多个室中每一个被配置为转移一定量的流体至用于测序文库制备的反应容器。每个室可以与出口端口流体连通。在一些实施方案中，每个室与不同的出口端口流体连通。在一些实施方案中，两个或更多个室与相同的出口端口流体连通，并且每个室的内容物可以被分别(例如，连续地(serially))排入用于测序的不同反应容器。在一些实施方案中，每个室的内容物(例如扩增子)可以通过显微操作取出。

在一些实施方案中，SISSOR在具有细胞捕获、裂解和单链DNA分隔的三个功能模块和全基因组扩增的单个模块的微流控装置中实现。在一些实施方案中，SISSOR有助于精确控制具有最小非特异性结合的DNA分子(混合，分隔)。另外，在一些实施方案中，所述方法用“刚刚足够的扩增”完成，使得最大限度地减少来自单个细胞扩增偏差。在一些实施方案中，“刚刚足够的扩增”包括不超过大约1000倍的扩增。

一些实施方案包括装置(图1A&B)。在一些实施方案中，采用构件如旋转构件(例如，环)，其允许染色体的完全变并将单链DNA分子平均分配到24个用于独立扩增的扩增室的。这能够确保两条互补DNA链被装载在两个分开的室中的可能性为至少大约>95％。为了构建来自个体DNA链的DNA测序文库，多重置换扩增(MDA)可以纳升的体积进行，大致比Marcy el al.2007所实现的50nl的体积小10x。在本方法的一些实施方案中，在大约12nl或更少的体积中进行扩增，例如大约12nl、10nl、5nl、3nl、2nl、1nl或0.5nl。另外，在一些实施方案中，所述扩增时间被限制在大约10小时或更少，例如大约10小时或更少、大约5－10小时、大约5－7小时、大约7小时或更少、大约5小时或更少、大约3－5小时或大约3小时或更少。在一些实施方案中，低体积和相对短的扩增的这种组合产生大约1000倍或更少的扩增幅度，其能够实现基于采用纳米类型反应器的非常均一的扩增，如图2中所示。

高剪切力可引起DNA片段化。因此，在一些实施方案中，优化所述构件以使DNA片段化最小化。在一些实施方案中，所述构件包括旋转构件如被配置为进行温和混合的混合环。在一些实施方案中，所述构件包括被动扩散器，其可以包括被动扩散膜。尽管本文已经证实了无偏差的扩增，一些实施方案包括对所述方法和/或装置的另外的修饰。长的单链DNA分子的平均和随机分隔能够将真的突变与假阳性区分。在一些实施方案中，所述旋转元件(例如，混合环)和扩增室确保分隔的平均和/或随机。在一些实施方案中，所述装置的内表面涂有非粘性聚合物(如PEGs)以防止非特异性DNA结合。在一些实施方案中，通道和室的几何形状被优化以避免死体积。在一些实施方案中，基因组测序文库是由纳克级的MDA扩增子构建的。

一些实施方案包括基于DNA聚合酶I去分支和Tn-5转座子Tagmentation的操作步骤。该操作步骤比公开的方法有效>10x，并且获得具有>10x更高的复杂度的测序文库。在一些实施方案中，存在针对每个室的测序文库，使得单个细胞产生等于室的数量的许多测序文库(例如，如果有24个室，则能够有24个测序文库)。因此，随着更多的单个细胞被测序，该实验的规模会迅速增长。因此，在一些实施方案中，该文库制备操作步骤采用液体处理机器人进行自动化，以确保从所述微流控装置洗脱出的每个单个扩增子被转换成相应一致的测序文库。

本文一些实施方案的示例性应用包括癌症中稀有突变的早期检测，以及涉及非常有限的投入(input)材料和需要高度精确测序的其它遗传诊断应用。

在一些实施方案中，用于单个哺乳动物细胞的高精确度基因组测序的方法和/或设备(apparatus)本身将是一个重大的技术进步。在一些实施方案中，该技术被应用于表征成人脑中单个神经元的体细胞基因组多样性，其是很少被探索的领域，并可能会导致我们在理解成人脑和脑部疾病的神经元功能多样性的模式转变。

实施例1：文库制备

低投入(low-input)文库制备方法，开始于制备1ul从微流控装置中冲洗出来的MDA扩增子。首先，将超支化的MDA扩增子转化成双链平端的DNA。为此，1.5ul的碱性变性缓冲液(400mM KOH,100mM DTT,10mM EDTA)被加至所述1ul MDA扩增子，并且反应在室温下孵育3分钟，并转移至冰上。用1.5ul的中和溶液(400mM HCl,600mM Tris.HCl,pH 7.5)中和反应。然后加入2ul 10x DNA聚合酶I缓冲液、1ul 10mM dNTP、5ul 20uM随机六聚体、7ul无核酶的H2O和1ul DNA聚合酶I(10U/ul)。反应在37℃孵育1小时，并在65℃灭活10分钟。通过乙醇沉淀来纯化所得到的双链平端的DNA，并且将其重悬于10ul H2O中。

接下来，通过Nextera Tagmentation(Epicentre)将所述双链平端的DNA转换成Illumina测序文库。简而言之，将7ul的DNA与2ul的5x HMW缓冲液(Epicentre Nextera kit)和1:50稀释的转座酶(transposase)(Epicentre Nextera kit)进行混合，并在55℃孵育反应5分钟。然后，加入1ul 1:100稀释的蛋白酶(Qiagen)，并且反应在50℃孵育10分钟，以及70℃孵育20分钟。接下来，加入1ul没有外切酶活性的Klenow片段(10U/ul,NEB)和1ul 10mM dNTP，并在37℃孵育15分钟。将Tagmentation方法所得到的DNA(13ul)在50ul的1X KAPA Robust PCR Master Mix与200nM的Nextera引物混合物和0.4x Sybr Green I中，采用以下的热循环操作步骤进行PCR扩增：95℃30秒，接着15个循环的95℃10秒、62℃15秒和72℃2分钟。在实时热循环仪上监测该反应，并在扩增曲线刚刚达到平台期时终止反应。所得到的PCR扩增子用Agencourt AmPure磁珠进行纯化并提交测序。

实施例2：单个小鼠成纤维细胞的基因组测序

采用如本文图1B中所述的原型装置对单个小鼠胚胎成纤维细胞成功进行了实验。进行如实施例1中所述的操作步骤。所述操作步骤对完整的小鼠基因组实现了相当平均(even)的扩增(图1C)。

实施例3：表征在成人脑和体外(in vitro)分化的神经元中的体细胞基因组多样性

表征在成人脑和体外分化的神经元中的体细胞基因组多样性。累积的证据表明，在成人脑中存在基因组嵌合体，并且可能针对细胞类型、脑功能区域以及甚至某些脑疾病的状态是特异性的。采用SISSOR技术，表征了人类死后的脑中的基因组多样性的程度(大区域的单核苷酸变化和拷贝数变化)。

全面表征了人类死后的脑中单个神经元上单核苷酸分辨率上的体细胞基因组多样性。一个重点是前额叶皮层的神经元，因为现有证据表明这样的神经元倾向于展示获得的总DNA含量。Westra,J.W.,et al.(2010)“Neuronal DNA content variation(DVC)with regional andindividual differences in the human brain.J Comp Neurol 518:3981-4000，其全部公开内容通过引用并入本文。在成人脑中神经元是高度并紧密彼此连接的。申请人不知道之前的允许从死后的脑切片分离单个完整的神经元的技术。采用免疫染色、显微解剖和流式分选的组合，特异性针对SCISSOR分离神经元的细胞核。简而言之，对～20μm厚的脑切片进行激光捕获以从特定层收获～10,000个细胞(即，LayerIVc)，其中一个特定神经元细胞类型(即星形中间神经元)易于识别和占优势。将所捕获的细胞温和裂解、用NeuN抗体染色以特异性标记神经元细胞核并进行流式分选。单个NeuN+细胞核会被加载至我们的微流控芯片用于DNA链分离、分隔(partition)和扩增。首先对每个测序文库进行突变识别，将来自所有24个基因组子集的候选突变组合以鉴定真正的突变。24个数据集的覆盖深度也会被组合，用于鉴定大基因组区域的获得或丢失。Zhang,K.,et al.(2006)“Sequencinggenomes from single cells by polymerase cloning.Nat.Biotechnol 24:680-686，其全部公开内容通过引用并入本文。在相同皮层切片中的神经胶质细胞的细胞核(NeuN-)和来自相同脑的小脑的NeuN+细胞核用作对照，基于这些细胞倾向于具有正常的总DNA含量的现有证据。预计可以鉴定单核苷酸和大染色体片段的体细胞遗传变化。该实验可以表明：(i)在三种类型的单个细胞中体细胞突变的频率和相同类型的不同细胞中的变异性是什么；(ii)所述突变的基因组位置是什么，以及是否存在基因组位置、表观遗传学状态、基因或通路方面任何富集；(iii)突变的什么部分在不同类型或相同类型的细胞中共享？

实施例4：体细胞基因组变化起源的鉴定

这样的体细胞基因组变体的起源，通过检查在从人多能干细胞体外分化为神经元过程中单个细胞基因组的完整性进行鉴定。

在单个神经元中通过分析由人多能干细胞体外分化的神经元和神经元前体来鉴定体细胞突变的来源。具体地，该方法可以区分两个假设：(i)突变是胚胎发育早期由神经元分化和细胞命运决定过程中积累的；(ii)突变发生于有丝分裂后的成年神经元中，并且可能直接或间接与功能性神经元活动有关。用于来自人胚胎干细胞和游离体再编程hiPS细胞的神经元干细胞进行体外分化的示例性操作步骤，可参见Yuan,S.H.,et al.(2011)“Cell-surface marker signatures for the isolationof neural stem cells,glia and neurons derived from human pluripotentstem cells.”PLoS One 6:e17540和Israel et al.(2012)Probing sporadicand familial Alzheimer’s disease using induced pluripotent stem cells.Nature 482:216-220中，其每一篇的全部内容通过引用并入本文。采用活细胞成像和在我的组中最近建立的显微操作系统，进行细胞追踪，并且提取单个细胞。这些单个细胞通过用于单个细胞全基因组测序的确定数量的细胞分裂进行分离。在第一种假设下，预计观察到在细胞之间共享的突变。基于突变共享的程度，能够构建与发育层次结构一致的谱系树。此外，大多数突变应该在没有显著功能性富集的随机位置发生。另一方面，如果第二种假设是真的，应该在在发育谱系中彼此非常接近的细胞间存在很少或没有共享的突变。与来自死后的脑的神经元相比，如果在有丝分裂后发生突变形成，预计可在体外分化的静息神经元中观察到显著低水平的突变载荷。最后，如果突变形成是活动相关的，在相同功能性皮层区的神经元中可能观察到某些基因组区域或通路中的突变富集。

实施例5：对正常成人脑和体外分化的神经元进行另外的测序

对正常成人脑和体外分化的神经元进行另外的测序。研究了来自神经退化性疾病的患者的脑标本。如果某些基因组区域或通路通常在体内(in vivo)突变，可以在随访中进行功能性后果的表征。单个细胞测序可以原位(in situ)进行，例如以将体细胞突变作图至脑的三维解剖结构。

实施例6：单个人成纤维细胞的基因组测序

将人成纤维细胞加载至微流体处理器，并且在单个细胞捕获模块中捕获(trap)一个单个细胞。洗涤之后，用碱性缓冲液裂解细胞，并且将细胞内容物移至旋转构件，其中通过碱变性和温和机械搅拌的组合作用解离所有染色体的双链DNA(注意在V9设计中，该完整步骤在变性室中没有机械搅拌的情况下进行以使DNA片段化最小化)。大的单链DNA片段被随机分隔至24个0.4nL体积的下隔室(lowercompartment)，并且在24个上隔室的每一个中用中和溶液进行混合。然后每个隔室中中和的DNA溶液被推送至MDA反应室，并与23nL体积的扩增反应混合物进行混合。在24个扩增室中平行地进行过夜扩增，然后扩增子流出并被收集至单个的0.2mL PCR管用于构建Illumina测序文库(注意在V9设计中，对变性室中保留的DNA分子进行另外的扩增。因此，每个单个细胞总共收集25个扩增子)。每个扩增子被转换成用独特的DNA条形码标记的文库，并且所有24个测序文库被汇集(pooled)用于在Illumina GA IIx or HiSeq2500测序仪上进行测序。测序读出结果按照BWA/GATK最佳实践V4与人类基因组参考序列进行比对。在bam格式文件中比对的测序读出结果用SeqMonk进行可视化。代表性的结果如图3所示。值得注意的是，虽然对完整的人类基因组进行了测序，图3中仅示出了一个代表性的染色体19的2.5兆碱基的区域。

文献列表

以下文献在此通过引用并入本文用于所有目的：

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至于本文所有的基本上任意复数和/或单数术语，本领域技术人员能够在对所述上下文和/或本申请合适时从复数解释成单数和/或从单数解释成复数。为清楚起见，本文可以明确规定各种单数/复数排列(permutation)。

本领域技术人员应当理解的是，通常，本文以及尤其是在所附权利要求书(例如，所附权利要求的主体)中所使用的术语，通常意为“开放式”术语(例如，术语“包括(including)”应当被解释为“包括但不限于”，术语“具有”应当被解释为“至少具有”，术语“包括(includes)”应当被解释为“包括但不限于”等)。本领域技术人员还应当理解的是，如果对所引入的权利要求表述的特定数量有意图，这样的意图将明确地记载在所述权利要求中，并且在不存在该表述的情况下，没有这样的意图存在。例如，作为对理解的帮助，下面所附的权利要求书可以含有引导性短语“至少一个”和“一个或更多个”的用法，以引入权利要求表述(recitation)。但是，使用这样的短语不应当被认为表示通过不定冠词“a”或“an”引入权利要求表述限制了将这样的所引入的权利要求表述包含至仅含有一个这样的表述的实施方案的任何特定的权利要求，即便是当相同的权利要求包括引导性短语“至少一个”和“一个或更多个”和不定冠词如“a”或“an”(例如，“a”和/或“an”应当被解释为是指“至少一个”和“一个或更多个”)；这同样也适用于使用被用于引入权利要求表述的定冠词。此外，即便明确记载了所引入的权利要求表述中的特定数量，本领域技术人员将认识到，该表述中应被解释为是指至少所记载的数量(例如，仅记载“两个表述”而没有其它修饰词，是指至少两个表述、或者两个或更多个表述)。另外，在那些情况下，即使用类似于“A、B和C等中的至少一个”的约定(convention)，通常这样的结构是指本领域技术人员将理解所述约定的意义(例如，“具有A、B和C中至少一个的系统”将包括但不限于具有只有A、只有B、只有C、A+B、A+C、B+C和/或A+B+C等的系统)。在那些情况下，使用类似于“A、B或C等中的至少一个”的约定时，通常这样的结构是指本领域技术人员将理解所述约定的意义(例如，“具有A、B或C中至少一个的系统”将包括但不限于具有只有A、只有B、只有C、A+B、A+C、B+C和/或A+B+C等的系统)。本领域技术人员还应当理解的是，几乎表示两个或多个可选术语的任何析取性(disjunctive)单词和/或短语，无论在说明书、权利要求书或附图中，应该被理解为设想包括术语中的之一、术语中的任一或两个术语的可能性。例如，短语“A或B”应当被理解为包括“A”或“B”或“A和B”的可能性。

此外，当本公开内容的特征或方面被以马库什组的方式进行描述时，本领域技术人员将会认识到，本公开内容还因此被以所述马库什组的个体成员或成员的亚组进行描述。

如本领域技术人员应当理解的是，为了任何及所有目的，如就提供书面描述而言，本文中公开的所有范围还包括任何及所有可能的子范围和子范围的组合。任何列出的范围可以被容易地识别为充分描述并使该相同的范围被分解为至少相等的二分之一、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为一个非限制性的例子，本文所讨论的每个范围可容易地分解成下三分之一、中间三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员还应当理解的是，所有语言如“高达”、“至少”、“大于”、“小于”等包括所记载的数量，并且指可以被随后分解成如上所讨论的子范围的范围。最后，如本领域技术人员应当理解的是，范围包括每个个体成员。因此，例如，具有1－3个物品的组是指具有1个、2个或3个物品的组。类似地，具有1－5个物品的组是指具有1个、2个、3个、4个或5个物品的组，等等。

虽然本文已经公开了各种方面和实施方案，其它方面和实施方案对于本领域技术人员将是明显的。本文所公开的各种方面和实施方案用于说明的目的，并且不旨在限制由所附权利要求所示出的真实范围和精神。

虽然为了清楚和理解的目的，已经对本发明进行了一定的详细描述，本领域技术人员应当理解的是，在不偏离本发明的真实范围的情况下可以得到各种形式的和详细的变化。

如本文所使用的术语“包含”与“包括”、“含有”或“特征在于”同义，并且是包含性的或者开放式的，并且不排除另外的、未记载的元素或方法步骤。

说明书中所使用的表示成分、反应条件等的量的所有数字，应当被理解为在所有情况下通过术语“大约”来进行修饰。因此，除了有相反的指示，本文所列的数值参数是近似值，其根据所寻求获得所期望的性质可以变化。最起码，以及并非试图限制将等同原则应用于在本申请要求优先权的任何申请的任何权利要求的范围，每个数值参数应当鉴于显著数字的数目和普通四舍五入方法进行解释。

上述的描述公开了本发明的几种方法和材料。本发明易于对所述的方法和材料进行修改，以及在该制造方法和设备方面的改变。鉴于本发明在此公开的内容的公开或实践，这样的修改对于本领域技术人员将是明显的。因此，不打算将本发明限于本文所公开的具体实施方案，而是覆盖本发明的真实范围和精神内的所有的修改和替换。

前面的描述和实施例详述了某些实施方案。但应当理解的是，无论多么详细的前述可能出现在文本中，本发明可用许多方式实现，并且本发明应当根据所附的权利要求书及其任何等价内容来进行解释。