SKIN基因沉默质粒和包含该质粒的转化的植物细胞

技术领域

本发明涉及SKIN基因沉默质粒和包含该质粒的转化的植物细胞及转基因植物。SKIN是水稻生长和产量的负调节子，且内源SKIN表达的减少增加了水稻的产量。

背景技术

植物生命周期伴随着在生长和发育期间调节营养吸收和分配的源-库转换(source-sink transitions)。源-库交流(source-sink communication)的调控决定了整个植物中的碳分配的模式，并且在决定作物生产力方面发挥关键的作用。大多数研究一直关注在调控基因表达的碳供给和需求的过程，这些基因涉及在源组织(进行光合作用的叶子和储存器官)中碳水化合物的产生和贮藏物的代谢以及库组织(生长中的营养和生殖组织)中的利用。然而，引起调节源-库通信的信号转导途径的组分很大程度是未知的。对该调控机理的深入了解不仅对理解糖缺乏/需求如何调控植物生长和发育意义重大，而且对于为了作物改良的源库营养分配的基因操控而言也是重要的。

在谷物中萌发和幼苗生长期间的源-库转换可以在营养供需模型中观察到，并且其也代表了一种研究营养需求/缺乏信号发送以及源-库交流的基因调控的机理的理想体系。萌发和接下来的幼苗生长构成了植物中的新生命周期的开始的两个重要步骤，这些步骤的完成需要发育和生化过程的相互配合，这些过程包括种子(源组织)中储藏物的代谢以及胚轴的延长(库组织)。在谷物中的这些过程中，在胚乳中贮存的储藏物经一组水解酶降解并代谢为糖和其他养分，这些糖和养分被胚子叶吸收并转运至胚轴支持幼苗生长(Akazawa and Hara-Nishimura,1985；Beck and Ziegler,1989；Fincher,1989；Woodger et al.,2004)。占谷类干重约75％的淀粉(Kennedy,1980)提供了在萌发和幼苗生长期间用于生成能量和代谢物的主要碳源。因此，在所有水解酶当中，α-淀粉酶类是最丰富的并且在淀粉代谢和进而在幼苗生长的速率方面发挥核心作用。α-淀粉酶的表达受到激素赤霉素(GA)和糖需求/缺乏的诱导(Yu,1999a；Yu,1999b；Lu et al.,2002；Sun and Gubler,2004；Woodger et al.,2004；Chen et al.,2006；Lu et al.,2007；Lee et al.,2009)，这已作为用于研究糖缺乏信号发送以及与GA信号通路的交流的机理的模型。

我们之前在水稻上的研究表明糖缺乏通过控制其转录速率和mRNA稳定性来调控α-淀粉酶的表达(Sheu et al.,1994；Sheu et al.,1996；Chan and Yu,1998)。转录调控是通过α-淀粉酶基因启动子中的糖应答复合物(SRC)来介导的，在这些启动子中，TA盒是关键的调控因子(Lu et al.,1998；Chen et al.,2002；Chen et al.,2006)。MYBS1是糖抑制的R1MYB转录因子，该转录因子与所述TA盒相互作用并诱导在糖缺乏情形下，水稻悬浮细胞和萌发的胚胎中的α-淀粉酶基因启动子的活性(Lu et al.,2002；Lu et al.,2007)。GA也通过GA应答复合物(GARC)来活化α-淀粉酶基因启动子，GA应答复合物中相邻的GA应答因子(GARE)和TA/Amy盒是关键的因子且协同作用(Rogers et al.,1994；Gubler et al.,1999；Gomez-Cadenas et al.,2001)。MYBGA(也称为GAMYB)是GA可诱导的R2R3MYB，其在谷物糊粉细胞中响应于GA，结合至GARE上激活的α-淀粉酶以及其他水解酶的启动子(Gubler et al.,1995；Gubler et al.,1999；Hong et al.,2012)。我们近期的研究表明MYBS1的入核受到糖的抑制，而GA通过提高MYBGA和MYBS1的共入核以及形成稳定的二分MYB-DNA复合物以激活α-淀粉酶基因启动子对糖抑制进行拮抗(Hong et al.,2012)。此外，不仅是糖缺乏信号，氮和磷缺乏信号也集中以及与GA交流以促进MYBGA和MYBS1的共入核以及上百种受GA诱导的但功能不同的水解酶、转运子和调解子的表达来补充全面的营养物的代谢以支持活跃的幼苗生长(Hong et al.,2012)。

水稻Snf1相关的蛋白激酶(SnRK1)家族，SnRK1A以及SnRK1B的结构和功能分别与它们的酵母和哺乳动物对应物，蔗糖非发酵1(SNF1)和AMP激活的蛋白激酶(AMPK)相似(Lu et al.,2007)。SNF1、AMPK以及SnRK1是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，并被认为是监控细胞的碳水化合物的状态和/或AMP/ATP水平以便维持对于适当生长而言所必须的糖产生和消耗的平衡的燃料表感应器(Halford et al.,2003；Hardie and Sakamoto,2006；Rolland et al.,2006；Polge and Thomas,2007)。SNF1、AMPK以及SnRK1是异三聚体蛋白复合物，由一个催化激活亚单元(α或Snf1)和两个调控亚单元(β、γ或Sip1/Sip2/Gal83和Snf4)构成(Polge and Thomas,2007)。这些蛋白激酶可分为N末端激酶域(KD)和C末端调控域(RD)(Dyck et al.,1996；Jiang and Carlson,1996,1997；Crute et al.,1998；Lu et al.,2007)。在葡萄糖充足的酵母细胞中，所述SNF1复合物以不活跃的自动抑制的构象存在，在该构象中，Snf1KD结合至Snf1RD(Jiang and Carlson,1996)。在葡萄糖缺乏的酵母细胞中，Snf4结合至Snf1RD，Snf1KD被释放，导致有活性的开放构象的Snf1(Jiang and Carlson,1996).Sip1/Sip2/Gal83充当与Snf1和Snf4 都结合的支架蛋白，并且糖缺乏也促进了该种结合(Jiang and Carlson,1996,1997)。

SnRK1蛋白激酶的保守的亚单元间和亚单元内的相互作用和功能已经在水稻中的糖缺乏信号通路中得到证实，并且SnRK1A在上游作用且在该糖缺乏信号通路中激活水稻中MYBS1和α-淀粉酶的表达发挥核心作用(Lu et al.,2007)。近来，我们发现CIPK15[钙调磷酸酶B类(CBL)相互作用蛋白激酶15]在SnRK1A上游作用并且在水稻中的O2缺乏耐受中发挥关键作用(Lee et al.,2009)。CIPK15调控SnRK1A蛋白的积累，以及与SnRK1A相互作用,且将O2缺乏信号与SnRK1A依赖性糖缺乏传感级联联系起来以调控糖和能量的生产且在水灾条件下安排(program)水稻的生长(Lee et al.,2009)。

已经有人提出在植物中，SnRK1协调和调节生长的生理和代谢的需求，这些需求包括碳水化合物代谢的调控、淀粉的生物合成、生育力、器官发生、衰老、应激反应以及与病原的相互作用(Polge and Thomas,2007)。SnRK1调控着诸如土豆块茎(McKibbin et al.,2006)以及豆类种子(Radchuk et al.,2010)的作物库中的碳水化合物代谢和发育。SnRK1的过度表达增加了土豆块茎中的淀粉积累(Purcell et al.,1998；Halford et al.,2003)，并且，SnRK1沉默会引起转基因大麦中不正常的花粉管发育和雄性不育(Zhang et al.,2001)。SnRK1(KIN10/11)激活了涉及降解过程和光合作用的基因，抑制了在拟南芥中那些涉及生物合成中的基因(Baena-Gonzalez et al.,2007)。

然而，在植物生长和发育期间调控源-库交流的机理不是很清楚。因此，有必要研究与在源组织和库组织之间糖和营养需求信号发送的有关基因。

发明内容

本发明供了一种新型的非生物胁迫诱导的植物特异的基因家族，SKIN1和SKIN2，其与SnRK1A相互作用并抑制SnRK1A功能。我们发现来自库组织(萌发的胚)的糖需求信号通过SnRK1A传递以诱导源组织(淀粉胚乳)中糖和其他养分的产生所必须的一整套酶的表达。通过使用植物激素脱落酸(ABA)作为胁迫信号转导诱导剂，我们进一步发现SKIN1和SKIN2通过抑制SnRK1A和MYBS1的共入核阻遏了SnRK1A依赖性糖/营养缺乏信号转导，并因此抑制了SnRK1A和MYBS1在诱导非生物胁迫条件下促进营养代谢的酶的表达方面的功能。

本发明提供了一种SKIN基因沉默质粒，所述质粒包含：启动子，两个DNA片段，所述两个DNA片段从来源于SKIN1或SKIN2 cDNA的一个DNA片段中获得并以正义 和反义的方向布置，以及插在所述两个DNA片段之间的第三个DNA片段。优选地，所述第三个DNA的序列来源于GFP的cDNA。更优选地，所述来源于SKIN1的一个DNA片段是SEQ ID No:58(307bp)，所述来源于SKIN2的一个DNA片段是SEQ ID No:59(245bp)，且所述第三个DNA片段为SEQ ID No:60(750bp)。

在SKIN基因沉默质粒的一个优选实施方式中，所述启动子选自35CaMV、actin1、GluB1、rbcS、cab、SNAC1、pin2、SAG12、Psaml、TobRB7或ubiquitin启动子。

本发明还提供了一种转化的植物细胞，所述植物细胞包含上述SKIN基因沉默质粒。具体而言，所述SKIN基因沉默质粒包含：启动子，两个DNA片段，所述两个DNA片段从来源于SKIN1或SKIN2 cDNA的一个DNA片段中获得并以正义和反义的方向布置，以及插在所述两个DNA片段之间的第三个DNA片段。优选地，所述第三个DNA的序列来源于GFP的cDNA。更优选地，所述来源于SKIN1的一个DNA片段是SEQ ID No:58(307bp)，所述来源于SKIN2的一个DNA片段是SEQ ID No:59(245bp)，且所述第三个DNA片段为SEQ ID No:60(750bp)。

在所述转化的植物细胞的一个优选实施方式中，所述启动子选自35CaMV、actin1、GluB1、rbcS、cab、SNAC1、pin2、SAG12、Psaml、TobRB7或ubiquitin启动子。

在所述转化的植物细胞的一个优选实施方式中，所述植物是选自玉米(maize)、小麦(wheat)、大麦(barley)、黍(millet)、甘蔗(sugarcane)、芒草(Miscanthus)、柳枝稷(switchgrass)或高粱(sorghum)的单子叶植物。

在所述转化的植物细胞的一个优选实施方式中，所述植物是选自拟南芥(Arabidopsis)、西红柿(tomato)、土豆(potato)、芸苔(brassica)、大豆(soybean)、油菜(canola)或甜菜(sugarbeet)的双子叶植物。

本发明还提供了一种转基因植物，所述转基因植物包含上述SKIN基因沉默质粒。具体而言，所述SKIN基因沉默质粒包含：启动子，两个DNA片段，所述两个DNA片段从来源于SKIN1或SKIN2 cDNA的一个DNA片段中获得并以正义和反义的方向布置，以及插在所述两个DNA片段之间的第三个DNA片段。优选地，所述第3三DNA的序列来源于GFP的cDNA。更优选地，所述来源于SKIN1的一个DNA片段是SEQ ID No:58(307bp)，所述来源于SKIN2的一个DNA片段是SEQ ID No:59(245bp)，且所述第三个DNA片段为SEQ ID No:60(750bp)。

在所述转基因植物的一个优选实施方式中，所述启动子选自35CaMV、actin1、GluB1、rbcS、cab、SNAC1、pin2、SAG12、Psaml、TobRB7或ubiquitin启动子。

在所述转基因植物的一个优选实施方式中，所述植物是选自玉米、小麦、大麦、黍、甘蔗、芒草、柳枝稷或高粱的单子叶植物。

在所述转基因植物的一个优选实施方式中，所述植物是选自拟南芥、西红柿、土豆、芸苔、大豆、油菜或甜菜的双子叶植物。

附图说明

图1.包含GKSKSF域(KSD)的调节蛋白的新家族。(A)植物中包含KSD的蛋白的序列比对。相同的氨基酸用黑色背景上的白色字母显示，相似的氨基酸用灰色背景上的黑色字母表示。框示出了GKSKSF域(KSD)，推定的核定位信号(NLS)以及蛋白激酶A诱导域(KID)。星号表示单子叶植物中的保守域。(B)植物中包含KSD的蛋白的系统发生分析。刻度值0.1表示每个位点有0.1个氨基酸取代。彩色区域表示单子叶植物特异性基因簇。

图2.SKIN的N末端与SnRK1A的激酶域相互作用。为了进行GAL4-UAS双杂交分析，用效应子(effector)和报告质粒共转染水稻胚，在-S培养基中培育24小时，然后进行荧光素酶活性测定。将轰击了效应子Ubi:GAD,Ubi:GBD以及报告子(reporter)5XUAS-35S mp:Luc的水稻胚的荧光素酶活性设定为1X，其他数值相对于此数值进行计算。误差棒显示三次重复试验的标准差(SE)。显著性水平：*p<0.1,**p<0.05。Y轴表示不同构建的相对荧光素酶活性。(A)质粒构建。(B)用效应子Ubi:GAD-SnRK1A和Ubi:GBD-SKIN(野生型或截短的)以及报告子5XUAS-35S mp:Luc共转染水稻胚。(C)用效应子Ubi:GAD-SnRK1A[野生型、激酶域(KD)或调节域(RD)]，Ubi:GBD-SKIN以及报告子5XUAS-35S mp:Luc共转染水稻胚。(D)用效应子Ubi:GAD-SnRK1A、Ubi:GBD-SKIN以及报告子5XUAS-35S mp:Luc共转染水稻胚，并将其在含有1μM ABA的-S培养基中培育。

图3.高度保守的GKSKSF域(KSD)对于SKIN拮抗SnRK1A的功能而言是至关重要的。将转染有质粒的水稻胚在具有100mM葡萄糖(+S)培养基或不含葡萄糖的(-S)培养基中培育24小时，然后进行荧光素酶活性测定。将仅轰击了SRC-35S mp-Luc构建体并培养在+S培养基中的水稻胚的荧光素酶活性设定为1X，其他数值相对于此数值进行计算。误差棒显示三次重复试验的标准差(SE)。(A)质粒构建。(B)用效应子Ubi:SnRK1A、Ubi:SKIN1、Ubi:SKIN(Ri)单独和报告子SRC--35S mp:Luc共转染，或用效应子Ubi:SnRK1A和Ubi:SKIN或Ubi:SKIN(Ri)和报告子SRC-35S mp:Luc 共转染水稻胚。(C)从通过粒子轰击(particle bombardment)转染了Ubi:SnRK1A、Ubi:SKIN或Ubi:SnRK1A和Ubi:SKIN水稻胚中提取中总细胞蛋白，使用针对SnRK1A以及与SKIN的N末端融合的HA标签的抗体进行免疫印迹分析。通过丽春红S染色的蛋白上样对照显示于图15A中。(D)用效应子Ubi:SnRK1A和Ubi:SKIN1(野生型或截短的)以及报告子SRC-35Smp:Luc共转染水稻胚。(E)用效应子Ubi:SnRK1A和Ubi:SKIN(野生型的、删除了KSD的，或以6个Ala替代了KSD的)以及报告子SRC-35Smp:Luc共转染水稻胚。

图4.SKIN抑制了SnRK1A依赖性糖和营养缺乏信号转导通路。(A)来自野生型以及转基因系SKIN1-Ox(O3)、SKIN1-Ri(R3)、SKIN2-Ox(O2)、SKIN2-Ri(R1)的两天龄的幼苗在+S或-S条件下以14h光照/10h黑暗循环生长18h。从细胞中纯化出总RNA，使用所示基因特异性引物进行定量RT-PCR分析，mRNA的水平相对于Act1mRNA的水平进行标准化。将野生型的最低mRNA的水平设定为1X，其他样品相对于该数值进行计算。最高的mRNA的水平设定为100％。误差棒显示三次重复试验的SE。(B)从两天龄的SKIN-Ox转基因系的幼苗中提取中总细胞蛋白，使用针对SnRK1A和与SKIN的N末端融合的HA标签的抗体进行免疫印迹分析。通过丽春红S染色的蛋白上样对照显示于图15B中。

图5.SKIN通过抑制在胚乳中营养代谢阻遏幼苗生长。以下试验中使用了转基因系SKIN1-Ox(O3)、SKIN1-Ri(R3)、SKIN2-Ox(O2)以及SKIN2-Ri(R1)。(A)种子在28℃以14h光照/10h黑暗循环或一直黑暗的无蔗糖(图版1)或有3％(90mM)蔗糖(图版2)条件下萌发并生长6天。(B)将(A)中幼苗芽和根的长度进行测量。图板1和图板2分别表示无或有蔗糖。(C)将幼苗以14h光照/10h黑暗循环或一直黑暗的条件下生长3天。提取总RNA并用αAmy3(图版1)和EP3A(图版2)特异性引物进行定量(实时)RT-PCR分析。误差棒表示显著水平的SE(n＝12)：(B)和(C)中*p<0.1,**p<0.05。

图6.SKIN抑制在低氧条件下幼苗生长所必需的糖的生成。水稻种子在28℃以14h光照/10h黑暗循环在空气或有或无90mM蔗糖的水中萌发不同的时间长度。每天对幼苗芽的长度进行测量。误差棒表示芽长度的S.E.(n＝10)。图版1：过表达SKIN1的转基因系SKIN2-O4；图版2：过表达SKIN2的转基因系SKIN2-O4。对于使用更多SKIN2-Ox和SKIN2-Ri系的数据，也可在线看图16。

图7.SKIN和SnRK1A主要在细胞质中相互作用。将质粒构建体转染至大麦糊粉 层并在-S培养基中培育24小时。为每种细胞制备了30个0.9至1.1μm厚度的光学切片(optical sections)，此处只显示了5个有规则地间隔的切片(切片3、9、15、21以及27)。C和N分别表示在细胞质和细胞核中较强的GFP信号，c和n分别表示在细胞质和细胞核中较弱的GFP信号。对于各细胞的更多切片图像，也可以在线参见图17。

图8.SKIN在细胞质和细胞核中均可拮抗SnRK1A的功能。(A)质粒构建。(B)用Ubi:SKIN-GFP或Ubi:SKIN△NLS-GFP轰击大麦糊粉层细胞。细胞在+S培养基或-S培养基中培育24小时。为每种细胞制备了30个0.9至1.1μm厚度的光学切片(optical sections)，此处只显示了5个有规则地间隔的切片(切片3、9、15、21以及27)。C和N分别表示在细胞质和细胞核中较强的GFP信号，c和n分别表示在细胞质和细胞核中较弱的GFP信号。对于各细胞的更多切片图像，也可以在线参见图18。(C)使用SnRK1A和Ubi:SKIN-GFP或Ubi:SKIN△NLS-GFP共转染水稻胚，并在+S培养基或-S培养基中培育24小时，然后进行荧光素酶活性测定。将仅轰击了SRC-35S mp-Luc构建体的+S培养基中的水稻胚的荧光素酶活性设定为1X，其他数值相对于此数值进行计算。误差棒显示三次重复试验的标准差(SE)。

图9.SKIN的表达受多种非生物胁迫以及ABA的诱导，并且SKIN提高了ABA的敏感性。(A)在不同时间长度，从2天龄水稻幼苗的叶片中纯化总RNA，这些幼苗已经被风干，使用200mM的盐处理，在4℃培育，或用1μM的ABA处理，或从水下生长(低氧)的幼苗的胚胎中纯化总RNA。使用SKIN1和SKIN2的特异性引物对RNA进行定量RT-PCR分析。将最高的mRNA水平设定为100％。将最低的mRNA水平定为数值1X，其他样品的mRNA水平相对于该数值进行计算。误差棒显示三次重复试验的标准差(SE)。(B)转基因系SKIN1-Ox(O3)、SKIN1-Ri(R3)、SKIN2-Ox(O2)以及SKIN2-Ri(R1)的种子在28℃以14h光照/10h黑暗循环含有不同ABA浓度的水中萌发并生长6天。对芽的长度进行测量。误差棒表示在显著水平的SE(n＝8)：*p<0.1,**p<0.05。也可以在线看图20中经处理的幼苗的照片。

图10.在糖缺乏时ABA限制的SKIN、SnRK1A和MYBS1于细胞质中。用所示的质粒构建体共转染大麦糊粉层，并在具有ABA(+ABA)或没有ABA(-ABA)的+S培养基或-S培养基中培育48小时。为每种细胞制备了30个0.9至1.1μm厚度的光学切片(optical sections)，此处只显示了5个有规则地间隔的切片(切片3、9、15、21以及27)。C和N分别表示在细胞质和细胞核中较强的GFP信号，c和n分别表示在细胞质和细胞核中较弱的GFP信号。对于各细胞的更多切片图像，也可以在线参见 图22。(A)单独用Ubi:SKIN1-GFP、Ubi:SKIN2-GFP、Ubi:SnRK1A-GFP或Ubi:MYBS1-GFP转染大麦糊粉层。(B)单独用Ubi:MYBS1-GFP(图版1)转染，或用Ubi:MYBS1-GFP和Ubi:SnRK1A(图版2),或用Ubi:MYBS1-GFP和Ubi:SnRK1A(Ri)(图版3)共转染大麦糊粉层。(C)用Ubi:SnRK1A-GFP和Ubi:SKIN(Ri)共转染大麦糊粉层。(D)野生型水稻(WT)或用Ubi:SnRK1A-GFP(图版1-3)或Ubi:MYBS1-GFP(图版4-6)转染的过表达Ubi:SKIN(Ri)的转基因水稻。

图11.SnRK1A在调控谷物幼苗中的营养代谢的源库交流上发挥核心作用，且关键因子的差异性细胞定位调控着非生物胁迫下的所述过程。来自需要营养的库组织(萌发的胚胎和幼苗)的糖缺乏信号触发了SnRK1A和MYBS1的共核定位，引起了源组织(胚乳)中养分代谢所必须的水解酶的诱导。胁迫和ABA促进了SKIN的胞质定位，而后者与SnRK1A结合并阻止SnRK1A和MYBS1进入细胞核。下文将更详细地讨论。

图12.SKIN1和SKIN2与SnRK1A在酵母中相互作用。在酵母双杂交测定中，使用质粒构建体ADH1:GAD-SnRK1A和ADH1:GBD-SKIN作为效应子,而Mel1:LacZ、Mel1:Mel1和Gal1:HIS3作为报告子。单独含有GADSnRK1A或GAD(—)的酵母菌株AH109与单独含有GBD-SKIN或GBD(—)的酵母菌株Y187进行配对。使用p53与大T抗原(T-Ag)间的相互作用作为阳性对照。

图13.SKIN1和SKIN2的氨基酸序列比对。相同的氨基酸用黑色背景上的白色字母显示，而相似的氨基酸用灰色背景上的黑色字母表示。功能域的缩写：NLS，核定位信号；KSD，GKSKSF域；KID，蛋白激酶A诱导域。

图14.SKIN1N末端的1-83位氨基酸与SnRK1A的激酶域和自动抑制(autoinhibitory)域在酵母中相互作用。(A)使用质粒构建ADH1:GAD-SnRK1A和ADH1:GBD-SKIN1(野生型或N或C末端缺失的)作为效应子,而Mel1:LacZ、Mel1:Mel1和Gal1:HIS3作为报告子。(B)在酵母双杂交测定中，SKIN1的N末端与SnRK1A相互作用。(C)SnRK1A的激酶域(KD)和自动抑制域(AID)与SKIN1以及SKIN2相互作用。单独含有GAD-SnRK1A或GAD(—)的酵母菌株AH109与含有各种GBD-SKIN1构建体或单独含有GBD(—)的酵母菌株Y187进行配对。使用p53与大T抗原(T-Ag)间的相互作用作为阳性对照。

图15.硝酸纤维素膜的丽春红S染色以显示免疫印迹分析中的蛋白上样量。(A)使用Ubi.SnRK1A、Ubi.SKIN或Ubi.SnRK1A和Ubi.SKIN通过粒子轰击(particle bombardment)转染水稻胚。提取总蛋白并将其印至硝酸纤维素膜用于图3C所示的免 疫印迹分析。接着，用丽春红S对同一张硝酸纤维素膜染色。泳道1至8中的蛋白在一块胶中电泳，泳道9至12中的蛋白在另一块胶中电泳。NT：没有进行转染的胚胎。(B)从二天龄的SKIN-Ox转基因系幼苗中提取总蛋白并将其印至硝酸纤维素膜用于图4B所示的免疫印迹分析。接着，用丽春红S对同一张硝酸纤维素膜染色。泳道1至4中的蛋白在一块胶中电泳，泳道5至8中的蛋白在另一块胶中电泳。WT：野生型幼苗。

图16.SKIN抑制水下的幼苗生长所必需的糖生成。SKIN-Ox和SKIN-Ri系的水稻种子在空气或具有或没有90mM的蔗糖的水里萌发不同的时间长度。每天对幼苗芽的长度进行测量。误差棒表示芽长度的S.E.(n＝10)。图版1：空气中；图版2：水中；图版3：具有蔗糖的水中。代表系的数据也在图6中示出。

图17.SKIN和SnRK1A主要在细胞质中相互作用。将质粒构建转染至大麦糊粉层并在-S培养基中培育24小时。为每种细胞制备了30个0.9至1.1μm厚度的光学切片(optical sections)。C和N分别表示在细胞质和细胞核中较强的GFP信号，c和n分别表示在细胞质和细胞核中较弱的GFP信号。框表示示于图7中的图像。

图18.没有NLS的SKIN定位在细胞质中。使用Ubi:SKIN△NLS-GFP轰击大麦糊粉层细胞。细胞用100mM葡萄糖(+S)或无葡萄糖(-S)处理24h。C和N分别表示在细胞质和细胞核中较强的GFP信号，c和n分别表示在细胞质和细胞核中较弱的GFP信号。框表示示于图7中的图像。

图19.SKIN在大多数水稻组织中表达。从水稻幼苗(7天龄)、成熟的植物(3月龄)、花和未成熟花序(授粉后1至22天，DAF)中纯化总RNA。使用SKIN1和SKIN2的特异性引物对RNA进行定量RT-PCR分析。将最高的mRNA水平设定为100％。将最低的mRNA水平定为数值1X，其他样品的mRNA水平相对于该数值进行计算。误差棒显示三次重复试验的SE。

图20.过表达SKIN的转基因水稻对ABA抑制更敏感。转基因系SKIN1-Ox(O3)、SKIN1-Ri(R3)、SKIN2-Ox(O2)以及SKIN2-Ri(R1)的种子在28℃以14h光照/10h黑暗循环的含有不同ABA浓度的水中萌发并生长6天。在第6天对幼苗进行拍照。芽长度的定量数据在图9B中示出。

图21.ABA和山梨醇抑制了SnRK1A在激活Amy3 SRC启动子方面的功能。将报告子SRC-35Smp:Luc连同或不随效应子转染水稻胚或大麦糊粉层，并在具有或没有ABA的条件下培育24h，然后进行荧光素酶活性测定。将仅轰击了SRC-35S mp-Luc构 建体并培养在+S培养基中的胚胎或糊粉层的荧光素酶活性设定为1X，其他数值相对于此数值进行计算。误差棒显示三次重复试验的标准差(SE)。(A)质粒构建。(B)用效应子Ubi:SnRK1A、Ubi:SKIN1、Ubi:SKIN(Ri)单独和报告子SRC-35S mp:Luc转染，或用效应子Ubi:SnRK1A和Ubi:SKIN或Ubi:SKIN(Ri)和报告子SRC-35S mp:Luc共转染大麦糊粉层。(C)转染了或未转染Ubi:SnRK1A的水稻胚(上图版)使用或不使用1μM ABA或50mM山梨醇培育，转染了或未转染Ubi:SnRK1A的大麦糊粉层(下图版)与5μM ABA或400mM山梨醇培育。

图22.在糖缺乏时ABA限制SKIN、SnRK1A和MYBS1于细胞质中。用所示的质粒构建体共转染大麦糊粉层，并在具有ABA(+ABA)或没有ABA(-ABA)的+S培养基或-S培养基中培育48小时。为每种细胞制备了30个0.9至1.1μm厚度的光学切片(optical sections)，此处只显示了5个有规则地间隔的切片(切片3、9、15、21以及27)。C和N分别表示在细胞质和细胞核中较强的GFP信号，c和n分别表示在细胞质和细胞核中较弱的GFP信号。框表示示于图10中的图像。(A)单独用SKIN1-GFP, SKIN2-GFP,SnRK1A-GFP或MYBS1-GFP转染大麦糊粉层。(B)单独用MYBS1-GFP转染，或用MYBS1-GFP和SnRK1A或SnRK1A(Ri)共转染大麦糊粉层。(C)用SnRK1A-GFP和SKIN(Ri)共转染大麦糊粉层。(D)野生型水稻(WT)或用SnRK1A-GFP或MYBS1-GFP(图版4-6)转染的过表达SKIN(Ri)的转基因水稻。

图23.SKIN1而非SKIN2通过抑制淀粉和赤霉素(GA)生物合成所必需的酶而妨碍了种子发育。(A)相同数量的转基因系SnRK1A-Ri(127-13)、SKIN1-Ox(O3)和SKIN1-Ri(R3)首尾相接排列进行长度比较(上图版)和并排排列进行宽度比较(下图版)。(B)对SKIN1-Ox、SKIN1-Ri和SnRK1A-Ri系的每一种的三个独立的转基因植物中的每株植物的千粒重(上图版)、粒长、厚度和宽度以及籽粒产量进行了测量。(C)从转基因系SKIN1-Ox(O3)、SKIN1-Ri(R3)、SKIN2-Ox(O2)和SKIN2-Ri(R1)的未成熟花序中提取总RNA，并用SKIN1,SKIN2,GIF和GA3ox2特异性引物进行定量RT-PCR分析。将最高的mRNA水平设定为100％。将最低的mRNA水平定为数值1X，其他样品的mRNA水平相对于该数值进行计算。误差棒显示三次重复试验的SE(n＝12)。显著性水平：*p<0.1,**p<0.05。

图24.SKIN阻碍植物生长。本实验中使用了转基因系SKIN1-Ox(O3)、SKIN1-Ri(R3)、SKIN2-Ox(O2)和SKIN2-Ri(R1)。对抽穗期植物的高度进行测量，具有±所示SE(n＝9)。

图25.在2014年的春季(二月至七月)，在非灌溉田(non-irrigated fields)里种植野生型、三个独立的SKIN1-Ox系(O2,O3以及O6)和三个独立的SKIN1-Ri系(R2,R3以及R5)。收获后测定籽粒产量。误差棒表示标准差(SE)。t-test的显著性水平:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

具体实施方式

材料和方法 

植物材料

本研究中使用了水稻(Oryza sativa cv Tainung 67)和大麦(Hordeum vulgare cv Himalaya)。胚愈伤组织在含有3％蔗糖和10mM 2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)的Murashige&Skoog(MS)培养基诱导5天。对于水稻幼苗的溶液培养(hydroponic culture)，使用1.5％NaOCl和Tween 20对种子消毒1h，并用蒸馏水充分清洗，并在具有湿滤纸的培养皿中在28℃以14h光照/10h黑暗循环的条件(除非另有说明)萌发。SnRK1A敲除的转基因水稻是以前生成的(Lu et al.,2007)。

我们之前的研究显示MYBS1的糖调控在大麦糊粉层中起作用(Lu et al.,2002)。尽管使用了不同的系统，使用水稻胚(Lu et al.,2007)的MYBS1功能的SnRK1A调控、使用水稻悬浮细胞的SnRK1A表达的CIPK 15调控(Lee et al.,2009),以及使用了水稻和大麦糊粉层的MYBS1和MYBGA相互作用的调控以及MYBS1的核质穿梭(nucleocytoplasmic shuttling)(Hong et al.,2012)都是一致的。为了进行荧光素酶活性的顺势表达测定，相比于水稻胚乳，优选糊粉层/胚，因为其便于操作用于大规模样品制备、粒子轰击和蛋白提取。为了研究和目标蛋白融合的GFP的细胞定位，优选大麦糊粉层。因为水稻糊粉层是单层细胞且较脆弱，而大麦糊粉层具有3至4层且相对较坚固，并在更便于在显微镜底下操作。此外，相比洋葱表皮细胞而言，大麦或水稻糊粉层细胞具有相对而言大的多的细胞核而较小的液泡，这更偏于研究蛋白的入核。

质粒

质粒p3Luc.18包含与CaMV35S最小启动子-Adh1内含子-荧光素酶cDNA(Luc)融合基因的融合的αAmy3 SRC(转录起始位点上游第-186至-82)(Lu et al.,1998)。质粒pUG包含融合在Ubi启动子和Nos终止子之间的β-葡萄糖醛酸酶cDNA(GUS)(Christensen and Quail,1996)。质粒pUbi-SnRK1A-Nos包含Ubi启动子和Nos终止子之间的SnRK1A全长cDNA(Lu et al.,2007)。质粒pUbi-SnRK1A-KD-Nos包含Ubi启 动子和Nos终止子之间的编码SnRK1A激酶域的cDNA(Lu et al.,2007)。质粒pUbi-SnRK1A-RD-Nos包含Ubi启动子和Nos终止子之间的编码SnRK1A调控域的cDNA(Lu et al.,2007)。质粒p5xUAS-35SminiP-Luc-Nos包含与CaMV35S最小启动子-Adh1内含子-Luc融合基因上游融合的5个UAS的串联重复。pAHC包含Ubi启动子和Nos终止子之间的所述荧光素酶cDNA(Bruce et al.,1989)。

酵母双杂交测定

为了克隆与SnRK1A相互作用的蛋白，酵母(Saccharomyces cerevisiae)双杂交cDNA文库通过源自从缺乏蔗糖8小时的水稻悬浮细胞分离的poly(A)mRNA与在噬菌体载体pAD-GAL4-2.1中的GAL4激活域(GAD)DNA融合来构建。大约1x10⁶个转化子(transformants)在缺乏亮氨酸、色氨酸和组氨酸但含有15mM的3-氨基-1,2,4-三氮唑(3-AT)的合成的完全(SC)培养基进行双杂交筛选。HIS3报告基因的表达使得克隆得以在选择培养基上生长，且测试了推定的阳性转化子对其他报告基因(例如lacZ)的诱导。通过重新转化进酵母对阳性克隆进行了鉴定，而通过DNA序列分析对cDNA插入片段(inserts)进行了鉴定。

为了研究SnRK1A与SKIN间的相互作用，依照制造商(Clontech,美国)的描述使用了酵母标记TM转化系统2。所述酵母双杂交测试在酵母(S.cerevisiae)菌株AH109以及Y187(Clontech)中进行，所述酵母菌株含有在GAL4响应元件(Chien et al.,1991)控制下的报告基因HIS3和lacZ。克隆在选择性培养基上生长并通过菌落-升起过滤测试方法(colony-lift filter assay method)测试β-半乳糖苷酶的活性。

质粒构建

使用GATEWAY基因克隆系统(Invitrogen,美国)来生成所有的构建体。首先生成了能够在所有实验中使用的的目的载体。为了生成在水稻胚瞬时表达测试中使用的构建体，用BamHI消化质粒pAHC18以移除荧光素酶cDNA插入片段，接着加入双-HA标签，生成pAHC18-2HA。用EcoRV线化pAHC18-2HA，并将两侧有attR1和attR2的ccdB DNA片段插入Ubi启动子和Nos终止子之间，生成pUbi-2HA-ccdB-Nos。为了生成在水稻稳定转化中使用的构建体，用HindIII线化pUbi-2HA-ccdB-Nos并将其插入已经用同样的限制性内切酶线化的双元载体pSMY1H(Ho et al.,2000)，生成目的载体pSMY1H-pUbi-2HA-DEST-Nos。

为了生成在酵母双杂交测试中使用的构建体，用SmaI线化含有与Gal4结合域DNA的融合的ADH1启动子(ADH1-GAD)的pAS2-1和含有与Gal4激活域DNA的融合的 ADH1启动子(ADH1-GBD)的pGAD424，接着将两侧有attR1和attR2位点的ccdB DNA片段插入ADH1-GAD或ADH1-GBD的下游，生成目的载体GAD-ccdB和GBD-ccdB。通过PCR合成SKIN1、SKIN2以及SnRK1A(野生型或截短的)的编码序列并插入pENTRTM/定向TOPO克隆试剂盒(Invitrogen，美国)中的attL1和attL2位点之间，生成pENTR-SKIN和pENTR-SnRK1A。融合在GAD和GBD的C末端的各种基因通过GATEWAYλ重组系统(LR Clonase II酶混合试剂盒，Invitrogen)受ADH1启动子的驱动。

为了生成SKIN RNA干扰(RNAi)构建体，通过PCR合成分别源自SKIN1和SKIN2的3'UTR的307bp片段和245bp片段。将两者中的任意一个以正义方向和反义方向融合在750bp GFP cDNA的两侧。将所述SKIN RNAi片段插入pENTRTM/D-TOPO中的attL1和attL2位点之间，生成pENTR-SKIN-Ri。通过GATEWAYλ重组系统(LR Clonase II酶混合试剂盒，Invitrogen)生成入门载体pENTR-SKIN(Ri)，并通过该系统生成pSMY1H-SKIN-Ri(包括pSMY1H-SKIN1-Ri和pSMY1H-SKIN2-Ri)。

源自SKIN1的3'UTR的307bp片段(SEQ ID No:58)：

GCTATTAGTACAAAAAAAATAATAATTTTTACAGTTAGAGCAAAAAGCCATTGATCTCCTTTTGGCTGGTAGAGTTGTTACTGCTACAACTGCTTACTATTAGTAACTATATAATTATAATTATAATTGCAATGCATAAGGTCCAAGTTTGTTGTGATCTACTATGATTCTAGTAACTCTCTGGTTTTTCTGAGTCCTGACCTGATTAAGAAGACATGTATCAACTATGTATATCTATGAACTGACCTAACTTGAGGCTATCATTAACTAATGATGGTTTATGATTAGTCAATTGCTTTGCTTTTGA 

源自SKIN1的3'UTR的245bp片段(SEQ ID No:59)：

CTCAAGAAAAAAAAATCTAGGTTTCTGCTTCTTCTCTTGTCTGAAAATTTTAGGGGTGTGAGAGAAATCATCAGTGTTGTTGTTACTGCTGCTGCTGCTGCTATATGATCAAGATATATATAACAAAAAAAAAGAACTCCATTTGTTTGTGTGCTTGTCTCTGGATGAACTCTGATCTTGATGATGATGATGAATCTTGTCTGTCTGGCATGAGGTCAACAACTCAACATTGCTATGAACAAAAA 

源自GFP cDNA的750bp片段(SEQ ID No:60)：

atggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccttcacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaa gtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacgggagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactcacggcatggacgagctgtacaagtctagataggagatccgtcgacctgcagatcgt 

为了研究蛋白细胞定位，将全长SKIN cDNA插入pENTRTM/D-TOPO中的attL1和attL2位点之间，生成入门载体pENTR-SKIN。通过GATEWAYλ重组系统将pENTR-SKIN中的SKIN插入在pSMY1H-pUbi-2HA-DEST-Nos中pUbi-2HA的下游，生成pSMY1H-pUbi-2HA-SKIN-Nos。

为了生成不含NLS的SKIN(SKINΔNLS)构建体，将缺少编码NLS(KRRR)的DNA的SKIN cDNA插入pENTRTM/D-TOPO中的attL1和attL2位点之间，生成入门载体pENTR-SKINΔNLS。通过GATEWAYλ重组系统将pENTR-SKINΔNLS中的SKINΔNLS插入pUbi-2HA-DEST-Nos中pUbi-2HA的下游，生成ppUbi-2HA-SKINΔNLS-Nos，并将该片段插入pUbi-GFP-DEST-Nos中pUbi-GFP的下游，生成pUbi-GFP-SKINΔNLS-Nos。

水稻转化

将用于过表达SKIN1和SKIN2的质粒(即，pSMY1H-pUbi-2HA-SKIN，包括pSMY1H-Ubi-2HA-SKIN1-Nos和pSMY1H-Ubi-2HA-SKIN2-Nos)用于沉默SKIN1和SKIN2的质粒(即，pSMY1H-SKIN-Ri，包括pSMY1H-SKIN1-Ri和pSMY1H-SKIN2-Ri)分别导入农杆菌菌株EHA105，依照之前所述(Ho et al.,2000)进行水稻转化。转化后获得许多转基因植物，其中由于过表达或沉默效果更好，(SKIN2-Ox)O2,(SKIN1-Ox)O3、(SKIN1-Ri)R3、(SKIN2-Ri)R1被挑选出来用于接下来的实验。此外，还使用了其他SKIN-Ox系(O6)和SKIN-Ri系(R2,R5)。

水稻胚和大麦糊粉瞬时表达测试

依照之前所述(Chen et al.,2006)制备用于粒子轰击的水稻胚。以4:2:1(对于单个效应子)的比例或4:2:2:1(对于两个效应子)比例用报告子、效应子和内部对照轰击水稻胚。由于每个独立实验中的转化效率可能不同，使用内部对照(Ubi：：GUS)使报告子的酶活标准化。将经轰击的水稻胚分为两等份，其中一份在含有100mM的葡萄糖Glc的MS液体培养基中培育24h，另一份在含有100mM甘露醇的MS液体培 养基中培育24h。使用细胞裂解缓冲液[0.1M磷酸钾,pH 7.8,1mM EDTA,10％甘油,1％triton X-100,和7mMβ-巯基乙醇]从胚中提取总蛋白。使用GUS测定缓冲液[0.1M磷酸钠,20mM EDTA,0.2％肌氨酸,0.2％Triton X-100,和20mMβ-巯基乙醇]进行GUS活性测定。GUS和荧光素酶的活性测定在别处描述(Lu et al.,1998)。所有的轰击至少重复三次。

依照之前所述进行大麦糊粉/胚乳瞬时表达测定(Hong et al.,2012)。每个独立的实验包括三次重复，每次处理使用了6个胚乳，并用相似的结果重复三次。依照之前所述进行荧光素酶和GUS活性测试(Hong et al.,2012)。误差棒显示三次重复试验的SE。

实时定量RT-PCR分析

使用Trizol试剂(Invitrogen)从水稻幼苗的叶片中提取总RNA，并用不含RNA酶的DNA酶1进行处理(Promega,麦迪逊市,威斯康辛州)。将5到10μg RNA用于使用反转录酶(Applied Biosystems,福斯特市,加利福尼亚州)的cDNA制备，然后将cDNA稀释至10ng/μl贮藏。将5μl cDNA和引物以及2X Power SYBR Green PCR Master mix试剂(Roche)混合，并用于ABI 7500实时PCR系统(Applied Biosystems)。通过相对定量CT法(delta-delta CT method)评价不同样品间的数量变异，使用18S核糖体RNA的扩增作为内部对照以使所有数据标准化。

抗体以及免疫印迹分析

生成针对源自SnRK1A的合成肽(5’-RKWALGLQSRAHPRE-3’，氨基酸残基385至399)的抗SnRK1的单克隆抗体。针对HA标签的鼠单克隆抗体(Sigma)购买获得。依照之前所述进行免疫印迹分析(Lu et al.,2007)。使用针对兔免疫球蛋白G的辣根过氧化物酶酶偶联的抗体(Amersham Biosciences)作为二抗。通过化学发光以及电化学发光(ECL)检测蛋白信号(Amersham Biosciences)。蛋白的丽春红S染色用于上样对照。

在空气中或水下的种子萌发

依照之前所述进行该实验(Lee et al.,2009)。为了在空气中萌发，将种子放置在含有半强度MS琼脂培养基的50ml离心管中用水浸湿的3M滤纸上。为了在水下萌发，将种子放置在50ml离心管中，将灭菌水仔细倒入管中以避免产生气泡，随后用盖子将离心管密封。

用于检测GFP的共聚焦显微镜

依照之前所述进行SKIN-GFP、SnRK1A-GFP以及MYBS1-GFP融合蛋白细胞定 位的检测(Hong et al.,2012)。将去胚的大麦(embryoless barley)和水稻种子用1％NaOCl消毒30分钟，并在含有20mM CaCl2以及20mM琥珀酸钠的缓冲液(pH 5.0)中培育4天。通过使用剃须刀片刮去胚乳中的淀粉提取糊粉层。将4个糊粉层布置在10cm的盘子中用于轰击。使用蔡司共聚焦显微镜(LSM510META)以488nm激光线(激发)和515-至560-nm的长通滤波器(发射)来检查表达GFP的糊粉层。

引物

表1和表2列出了所有用于质粒构建的克隆的引物。表3列出了用于定量RT-PCR的引物。

表1引物列表

表2用于质粒构建的引物对

表3用于定量RT-PCR分析的引物列表

登记号码

SKIN1(AK060116)；SKIN2(AK072516)；SnRK1A(AB101655.1)；MYBS1(AY151042.1)；αAmy3/RAmy3D(M59351.1)；αAmy8/RAmy3E(M59352.1),EP3A编码Cys蛋白酶(AF099203)；Lip1编码GDSL-基序脂肪酶(AK070261)；Phospho1编码磷酸酶样(AK061237)；ST编码糖转运子家族蛋白(AK069132)；ZmMTD1(ACG28615.1)；ZmKCP(ZAA48125.1)；Sorghum02g028960(XP_002462609.1)；AtKCP(NC_003076.8)；AtKCL1(NC_003075)；AtKCL2(NC_003071)；BnKCP1(AY211985)；ZmMTD186T7R4(EU961029)。

结果

新型的SKIN家族与SnRK1A相互作用

为了鉴定与SnRK1A相互作用的成分，我们进行了酵母双杂交筛选。将SnRK1A的全长cDNA与GAL4激活域DNA(GAD-SnRK1A)融合并用作筛选源自蔗糖缺乏的水稻悬浮细胞的水稻cDNA文库的诱饵。鉴定出编码新蛋白的一个基因，该蛋白被称为SnRK1A相互作用的阴性调节子1(SKIN1)。水稻基因组的生物信息学分析也鉴定出 SKIN1的类似物，其被称为SKIN2。使用酵母双杂交测定来分析与GAL4结合域融合的SKIN(GBD-SKIN)与GAD-SnRK1A间的相互作用。SKIN1和SKIN2均与SnRK1A在酵母中相互作用。

SKIN1的核苷酸序列如下所示：

SEQ ID NO:1

ATGTCGACGGCGGTGGCGGACGTGCCACCGGCGGCGGCCTACGGGTTCCCCGGATCGGCCAAGAGAGGGAAGCCTGAGGAGGTGGTGGTGCTGATGGGGAAGAGGAGGAACGAAGGGTTCTTCATCGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGTGCTGACGGAGAGCTCGTCGATCGGCGCGCCGTCGCCGGCGAGCTCGTCGATCGGGGAGAACTCCGGCGAGGAGGAGGGAGGGGACGACGAGGAGGAGGTGGAGAGCAAGCTCAAGGCGGAGGATGAGCAGGTCGGCCTCGGCTGCTTGGACGCCTTGGAGGAATCCTTACCCATCAAGAGGGGGCTCTCCAACTTCTACGCCGGCAAGTCCAAGTCGTTCACCAGCCTCGCCGAGGCGACGGCGTCGCCGGCGGCGGCGGCCAACGAGCTGGCCAAGCCGGAGAACCCCTTCAACAAGCGCCGCCGCATCCTCGCCACCTGGTCGCGGCGAGCCTCCTGCAGCTCCCTCGCCACCGCCACCTACCTCCCACCTCTCCTCGCGCCCGACCACGCCGTCGCCGAGGGCGACGAGGGTGAGGAGGAAGACGACGATTCAGACGACGATGAGCGGCAGCACCGTGGCAAGAACGGCGGCCGGCGAGAGTCGGCGGCGCCGCCATTGCCATTGCCGCCGCCGAGGCTCACCTTGCACACCCAGATGGGAGGAATGGTGAGGAGGAATGGAACATTCAGGTCGCCGAGGTCGCTCTCACTGTCTGATCTTCAGAACAGTGGCGGTTCATGTTAG 

SKIN2的氨基酸序列如下所示：

SEQ ID NO:2

mstavadvppaaaygfpgsakrgkpeevvvlmgkrrnegffieeeeeeeevltesssigapspasssigensgeeeggddeeevesklkaedeqvglgcldaleeslpikrglsnfyagksksftslaeataspaaaanelakpenpfnkrrrilatwsrrascsslatatylppllapdhavaegdegeeedddsddderqhrgknggrresaapplplppprltlhtqmggmvrrngtfrsprslslsdlqnsggsc 

SKIN2的核苷酸序列如下所示：

SEQ ID NO:3

ATGTCCACGGCGGTGGCGCGCGGCGGGATGATGCCGGCGGGGCACGGGTTCGGGAAGGGGAAGGCGGCGGCGGTGGAGGAGGAGGAGGATGAGGTGAACGGGTTCTTCGTGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGCGGCGGTGTCGGATGCGTCGTCGATCGGGGCGGCGTCGTCGGACAGCTCGTCGATCGGGGAGAACTCGTCGTCGGAGAAGGAGGGGGAGGAGGAGGGGGAGGAGGTGGAGAGCAAGGCGAAGGAGGTGGCGGTGGAGGTGGAGGGAGGGGGGCTCGGGTTCCATGGATTGGGGACTCTCGAATCCCTGGAGGACGCCCTTCCCATCAAGAGGGGACTCTCCAACTTCTACGCCGG CAAGTCCAAGTCGTTCACGAGCCTGGCCGAGGCGGCGGCGAAGGCGGCGGCGAAGGAGATCGCCAAGCCGGAGAACCCGTTCAACAAGCGCCGCCGCGTCCTCGCCGCGTGGTCGCGGCGGCGCGCGTCCTGCAGCTCGCTGGCCACCACCTACCTGCCCCCTCTCCTCGCCCCCGACCACGCCGTCGTCGAGGAGGAGGACGAGGAGGACGACTCCGACGCCGAGCAGTGCAGCGGCAGCGGCGGCGGCAACCGCCGGCGCGAGCCGACGTTCCCGCCGCCGAGGCTGAGCCTGCACGCGCAGAAGAGCAGCTTGACGCCGAGGAGCTCGAATCCGGCGTCGTCGTTTAGATCTCCTAGGTCATTCTCACTATCCGATCTCCAAAATGCAGGCTCCTATAACTAG 

SKIN2的氨基酸序列如下所示：

SEQ ID NO:4

mstavarggmmpaghgfgkgkaaaveeeedevngffveeeeeeeeeeeaavsdassigaassdsssigensssekegeeegeeveskakevaveveggglgfhglgtlesledalpikrglsnfyagksksftslaeaaakaaakeiakpenpfnkrrrvlaawsrrrascsslattylppllapdhavveeedeeddsdaeqcsgsgggnrrreptfppprlslhaqkssltprssnpassfrsprsfslsdlqnagsyn 

两个SKIN的氨基酸序列有59％的同一性和69％的相似性(图13)。生物信息学分析鉴定出在SKIN1、SKIN2和来自不同植物种属的若干个其他相关蛋白中存在的高度保守的GKSKSF域(KSD)(图1A和图13)。这些蛋白中的另外的保守域包括一个推定的核定位信号(NLS)以及蛋白激酶A诱导域(KID)样序列(图1A)。在这些基因当中，只有来自Brassica napus的含有KID域的蛋白(BnKCP1)已经得到了表征。BnKCP1是一种定位在核中的蛋白，它通过其C末端磷酸化的KID域与拟南芥中的组蛋白脱乙酰酶(HDA19)，并且在KID域第188位的丝氨酸对于其和HDA19的相互作用以及响应与冷胁迫和肌霉素处理的下游基因的激活而言是必需的(Gao et al.,2003)。SKIN的氨基酸序列与BnKCP1有40％的同一性和54％的相似性。氨基酸序列的系统进化树分析显示这些含有KID的蛋白可以分为双子叶和单子叶簇(图1B)。

SKIN的N末端区域与SnRK1A的激酶域相互作用

为了确定与SnRK1A相互作用的SKIN中的功能域，将5个截短的SKIN1与GBD融合并用酵母双杂交测定(图14A)进行分析。将SKIN1截短至包含第1至83位氨基酸，通过生物信息学程序预测这些氨基酸为推定的卷曲螺旋域(coiled-coiled domain)，将SKIN1截短至包含在KID域的5'端终止的第1至159位氨基酸。在酵母中，所有缺少第1至83位氨基酸的截短的SKIN1cDNA都不与SnRK1A相互作用，而第1至83位氨基酸本身能够与SnRK1A相互作用，这表明SKIN1(1至83位氨基酸)对于与SnRK1A在酵母中相互作用是充分且必要的。

为了确定在酵母双杂交测试中与SKIN相互作用的SnRK1A的域，将包含激酶域(KD)的SnRK1A(1-279),包含KD以及自动抑制域(AID)的SnRK1A(1-331),以及SnRK1A(280-503)包含调节域(RD)(Lu et al.,2007)与GAD融合。只有全长的SnRK1A和SnRK1A(1-331)能够与SKIN1和SKIN2相互作用，这表明KD以及AID对于与SKIN在酵母中相互作用是充分且必要的。

为了进一步验证SKIN与SnRK1A在植物中的相互作用，进行了水稻胚双杂交测试。将与GBD融合并在Ubi启动子的控制下表达的截短的SKIN1和SKIN2作为效应子。与CaMV35S最小启动子-荧光素酶(Luc)cDNA(5xUAS:Luc)上游融合的5个UAS的串联重复作为报告子(图2A)。通过SnRK1A与所有截短形式的SKIN1每一个的共表达，提高了荧光素酶活性(图2B)。也在植物中鉴定了SnRK1A与SKIN相互作用的功能域。全长SnRK1A与SnRK1A的KD与SKIN1和SKIN2均有相互作用，这一点是与酵母双杂交研究的结果，即KD和AID均为与SKIN1和SKIN2的相互作用所需的，是不同的(图14C)。这些数据证实了SKIN与SnRK1A在水稻细胞中的物理性相互作用，以及SKIN1的N末端第1至83位氨基酸和SKIN2N末端第1至85位氨基酸分别于SnRK1A的KD相互作用。

高度保守的GKSKSF域(KSD)对于SKIN拮抗SnRK1A的功能而言是必需的

SKIN在调控SnRK1A功能上的作用最先是通过使用水稻胚瞬时表达的功能获得以及丧失分析(gain-and loss-of-function analyses)来研究的。在Ubi启动子控制下表达的SnRK1A和SKIN RNA的cDNAs以及SKIN RNA干扰(Ri)构建作为效应子，将与CaMV35S最小启动子以及Luc cDNA融合的αAmy3 SRC(SRC-35Smp:Luc)作为报告子(图3A)。在含100mM葡萄糖(+S)或不含葡萄糖(-S)的条件下培育24小时，SnRK1A的过表达增强了αAmy3 SRC的启动子，SKIN的过表达抑制了αAmy3 SRC的启动子，而SKIN(Ri)的过表达解除了这种抑制(图3B)。SKIN和SnRK1A的共过表达将αAmy3 SRC的启动子抑制至类似于SKIN的单独过表达时的水平，而SKIN(Ri)和SnRK1A的共过表达增强了在+S和-S的条件下αAmy3 SRC的启动子(图3B)。这些结果表明SKIN拮抗了SnRK1A激活的αAmy3得表达。

如之前的报道(Lu et al.,2007)，在糖缺乏条件下，在非转化的水稻胚中的内源的SnRK1A的累积增加了(图3C，泳道1和2)。单独的SKIN1，SKIN2的瞬时表达，或其与SnRK1A的表达并没有改变SnRK1A的累积水平，只是重组的SnRK1A增加了总SnRK1A的水平(图3C，泳道5至12)，这表明SKIN拮抗了SnRK1A的活性而不是 影响SnRK1A的蛋白累积。

为了进一步理解SKIN拮抗SnRK1A功能的机制，我们对SKIN拮抗SnRK1A活性的功能域进行了研究。使用在Ubi启动子控制下表达的野生型以及阶段形式的SKIN1作为效应子，SRC-35Smp:Luc作为报告子(图3A)。SKIN1(1-83)以及SKIN1(160-259)并没有拮抗SnRK1A的功能(图3D)，这表明位于第84至159位的氨基酸的区域可能负责对SnRK1A功能的拮抗。这一观点通过删除了第84至159位的氨基酸的SKIN1丧失了抑制功能进一步得到证实(图3D)。

由于高度保守的KSD刚好位于SKIN1的第84至159位氨基酸内(图13)，将KSD从SKIN1中删除或以6个丙氨酸取代。两种突变形式的SKIN1均丧失它们对αAmy3 SRC启动子的抑制功能。有趣的是，我们注意到缺失了第84至159位的氨基酸或KSD的SKIN实际上提高了在+S和-S的条件下SnRK1A的功能，这暗示了这些截短形式的SKIN可能起内源SKIN显性负调节子的作用。然而，这些研究证实了SKIN是SnRK1A的负调节子，SKIN中的KSD是它们发挥这种抑制作用所必须的。

SKIN抑制了SnRK1A依赖性糖和营养缺乏信号转导通路

在携带有构建Ubi:SKIN和Ubi:SKIN(Ri)的转基因水稻种进一步研究了SKIN在调控SnRK1A依赖性糖和营养缺乏信号转导通路上的作用。在两天龄转基因水稻幼苗中，野生型中的内源的SKIN mRNAs在-S条件下上调，而在SKIN沉默(SKIN-Ri)系中在+S或-S条件下均下降，在SKIN过表达(SKIN-Ox)系中重组的SKIN的累积在+S或＝S条件下均显著提高(图4A，图版1)。SnRK1A依赖性糖和营养缺乏信号转导通路中标志物(包括MYBS1、αAmy3以及αAmy8)的表达在野生型中无S条件下均受到诱导，而在SKIN-Ox系中+S或-S条件下却显著下降(图4A，图版2至4)。

之前我们的研究表明用于贮存在胚乳中的各种营养的代谢的水解酶和转运子的表达可被在萌发刚开始的时候任何营养缺乏信号协调地打开。为了确定该SnRK1A依赖性通路是否也调控这些基因，我们随机选择了四个负责碳、氮和磷营养代谢的有代表性的基因供进一步分析。这些基因包括糖转运子(ST)、GDSL-基序列脂肪酶(Lip1)、半胱氨酸蛋白酶(EP3A)以及磷酸酶样蛋白(Phospho1)。一般而言，这四种基因的转录较低，但通过营养缺乏而激活(Hong et al.,2012)。这里我们显示了所述四种基因的mRNA的累积也在-S条件下激活而在SKIN-Ox系中受到抑制(图4A，图版5至8)。所有受测基因的累积在SKIN-Ri系中+S条件下有些许增加，而在-S条件下则不，这很可能是由于在所述的实验条件下SKIN1和SKIN2的功能冗余(functional  redundancy)。作为对照的水稻泛素基因,UbiQ5,的表达在SKIN-Ox系和SKIN-Ri系中没有发生变化(图4A，图版9)。

在-S条件下，内源性SnRK1A的累积略高，而转基因水稻中SKIN的过表达并没有改变该模式，只是重组的SnRK1A略微地增加了总SnRK1A的水平(图4B)，这表明SnRK1A依赖性信号转导通路的抑制并不是由于SnRK1A蛋白累积的降低而造成的。

SKIN通过抑制源自胚乳的淀粉及营养代谢来抑制幼苗生长

之前我们的研究表明萌发和幼苗生长在SnRK1A敲除(snf1a)和SnRK1A敲减(knockdown)(SnRK1-Ri)突变体中是迟缓的(Lu et al.,2007)。既然SKIN抑制了转基因水稻中SnRK1A依赖性营养缺乏信号转导通路(图4)，我们进一步研究了SKIN的在植物生长中的生理功能。SKIN-Ox和SKIN-Ri转基因系在光照/黑暗循环或连续黑暗的条件下生长6天。相比野生型植物而言，芽和根的生长在SKIN-过表达(SKIN-Ox)转基因系中受到抑制，而在SKIN1-沉默(SKIN1-Ri)转基因系得到增强，而且该差别在连续黑暗的条件下更为明显(图5A，图版1)。定量分析表明在光照/黑暗循环条件下幼苗中的芽和根的长度在SKIN-Ox系中均较短而在SKIN-Ri系中均较长，且该差别在连续黑暗的条件下更为明显(图5B，图版1)。如果向SKIN-Ox和SKIN-Ri系提供3％(88mM)的蔗糖，则不论生长条件如何，均没有检测到芽和根方面的差异(图5A和5B，图版2)，这表明蔗糖能够恢复SKIN-Ox的生长。

为了证实SKIN的过表达对幼苗生长的抑制是由于从种子淀粉水解中产生高需求的碳源的α-淀粉酶表达的降低而造成的，对αAmy3的表达进行了检测。在连续黑暗的条件下，野生型中3天龄幼苗中αAmy3的表达受到诱导，但在所有的生长条件下该诱导在SKIN-Ox系中降低，而在SKIN-Ri系中得到增强(图5C，图版1)。氮对于幼苗生长也是必要的。SKINs对于EP3A表达的调控类似于其对αAmy3，只是在连续黑暗的条件下EP3A的表达在SKIN-Ri系中没有得到增强(图5C，图版2)。

SKIN抑制在低氧条件下幼苗生长所必须的糖的生成

之前我们的研究表明SnRK1A是在低氧条件下水稻萌发和幼苗生长的重要的调节子(Lee et al.,2009)。因此，我们也研究了SKIN在调控低氧胁迫应答中的作用。如图6和图16所示，在空气中，SKIN-Ox系的芽的延伸略慢于野生型(图版1)，而在水中，芽的延伸则严重地受到抑制(图版2)。在水下，迟缓的芽延伸能够被蔗糖恢复(图版3)。SKIN-Ri系的生长类似于野生型。这些结果进一步证实了SKINs抑制了SnRK1A依赖的通路，从而导致在低氧条件下萌发后幼苗生长期间来自种子中淀粉水解的糖生成降低。

SKIN和SnRK1A主要在细胞质中相互作用

确定了SKIN和SnRK1A的亚细胞定位。由于SKIN与SnRK1A的KD相互作用，将SnRK1A的全长、KD和RD与绿色荧光蛋白(GFP)融合并在Ubi启动子的控制下在大麦糊粉细胞瞬时表达系统里表达(Hong et al.,2012)。如图7和17所示，SnRK1A-GFP和SnRK1A-KD-GFP大部分定位在细胞质中少部分在细胞核内，SnRK1A-RD-GFP主要在在细胞核内,而SKIN1-GFP主要定位在细胞核内而少部分在细胞质中。SnRK1A-GFP和SKIN1的共表达将所有SnRK1A-GFP排除在核外。SKIN1-GFP与SnRK1A或SnRK1A-KD的共表达将所有的SKIN1-GFP隔离在细胞质中，而SnRK1A-RD则维持了SKIN1-GFP的核定位。这些研究证实了SKIN1通过SnRK1A-KD与SnRK1A相互作用，这与使用植物双杂交测试获得的结果是一致的(图2C)，而这种作用将SKIN和SnRK1A留在细胞质中。

SKIN在细胞质和细胞核中均可拮抗SnRK1A的功能

由于SnRK1A和SKIN既出现在细胞质，也出现在细胞核中(图7)，我们测定了SKIN能否在细胞核和细胞质中都能拮抗SnRK1A的功能。将SKINs中推定的NLS删除(SKINΔNLS)并将其与GFP融合(图8A)。在+S和-S条件下，SKIN-GFP主要定位在细胞核中，而SKINΔNLS-GFP仅仅定位在细胞质中(图8B和图18)，这表明了推测的NLS是有功能的。SnRK1A与有NLS或没有NLS的SKIN-GFP的共表达将αAmy3 SRC启动子抑制至当SKIN-GFP单独过表达时的水平(图8C)。这也表明了细胞质中的SKIN能够将SnRK1A捕获至细胞质，这阻止了αAmy3 SRC活性所需的MYBS1表达的上调。

SKIN的表达受多种非生物胁迫以及ABA的诱导，并且SKIN提高了ABA的敏感性

能够在幼苗的所有组织、成熟植物、花和未成熟花序中检测到SKIN的表达，该表达尤其在开花后四天时在幼苗的第一个叶片中高度地受到诱导(图19)。我们也测定了SKIN的表达是否受到非生物胁迫的调控。将水稻幼苗进行干旱(暴露于干燥空气中)、盐(200mM NaCl)、冷(4℃)以及低氧处理。干旱胁迫后4h，SKIN1和SKIN2mRNA的累积被分别诱导达79和66倍；盐胁迫后6h，SKIN1和SKIN2 mRNA的累积被分别诱导达2.3和1.7倍；冷胁迫后48h，SKIN1和SKIN2 mRNA的累积均被诱导达4.6倍；在ABA处理后24h，SKIN1和SKIN2 mRNA的累积被分别诱导达4.2和1.7倍；在低氧处理后48h，SKIN1和SKIN2 mRNA的累积被分别诱导达3.5和5.1倍(图9A)。

为了确定SKIN对于ABA响应/信号发送是否重要，SKIN-Ox和SKIN-Ri系在包含不同ABA浓度的水中萌发。对于野生型和所有转基因系的生长的抑制程度随着ABA浓度从1μM到10μM而增加。然而，与野生型较比，SKIN-Ri系的生长较少地受到1μM和5μM ABA的抑制，而SKIN-Ox系的生长严重地受到1μM和5μM ABA浓度ABA的抑制(图9B和图20)。这些结果证实了SKIN提高了ABA的敏感性。

ABA限制了在糖缺乏时细胞质中的SKIN、SnRK1A和MYBS1

以上研究表明SKIN在+S培养基中仅定位在细胞核中，但其水平在-S培养基中是增加的，且它们在细胞核和细胞质中均可拮抗SnRK1A的功能(图7和图8)。既然SKIN的表达受多种非生物胁迫以及ABA的诱导，有必要确定SKIN是否能够以胁迫依赖的方式在细胞核和细胞质间穿梭。ABA和山梨醇，后者模拟渗透胁迫，不仅受到自身的抑制，而且能够在水稻胚和大麦糊粉中拮抗SnRK1A激活的αAmy3 SRC启动子(图21)。ABA还增强了SnRK1A和SKIN在水稻胚中的相互作用(图2D)。因此，ABA被当做胁迫信号诱导子。将与GFP融合的SKIN、SnRK1A以及MYBS1在有ABA或没有ABA的+S或-S培养基中培育的大麦糊粉中瞬时表达。在有ABA或没有ABA的+S培养基中，SKIN-GFP和SnRK1A-GFP分别仅定位在细胞核和细胞质中(图10A和图22A，图版1-3)。在没有ABA的-S培养基中，可在细胞质中检测到SKIN-GFP且相当数量的SnRK1A在细胞核中，然而，在含有ABA的-S培养基中，SKIN-GFP和SnRK1A-GFP都仅仅定位在细胞核中(图10A和22A，图版5-7)。定量分析表明，在缺乏ABA时，在+S或-S培养基中，定位在细胞核中的SnRK1A-GFP的百分比分别是19.7％和64.0％，这表明糖缺乏促进了SnRK1A的核定位(表4)。在-S培养基中，定位在细胞核中的SnRK1A-GFP的百分比从64.0％(无ABA)减少至8.0％(有ABA),这表明ABA抑制了SnRK1A的核定位(表4)。

表4.ABA抑制了SnRK1A的核定位

将Ubi:SnRK1A-GFP转染大麦糊粉并在具有ABA(+ABA)或没有ABA(-ABA)的+S或–S培养基中培育48h。百分率显示了在依据所检查的总细胞数目所划分的所示分类中具有GFP分布的细胞数目。

在+S培养基中，MYBS1-GFP主要定位在细胞质中，而在没有ABA的-S培养基中，则仅仅定位在细胞核中，这与我们之前的研究是一致的(Hong et al.,2012)。然而，在含有ABA的-S培养基中，MYBS1-GFP变成仅仅定位在细胞质中(图10A和图22A，图版4和8)。已表明MYBS1被SnRK1A转录式地激活(Lu et al.,2007)。这里我们发现MYBS1的入核也受在+S培养基中的SnRK1A的过表达的促进，而受到+S培养基中的SnRK1A沉默的抑制(图10B和图22B，图版2和3，分别地)，这表明SnRK1A对于促进MYBS1的核定位是充分且必要的。这些研究也表明SnRK1A和MYBS1的核定位受到-S培养基中ABA的抑制。

为了确定在含有ABA的-S培养基中SnRK1A-GFP和MYBS1-GFP的专属细胞质定位是否是由于SKIN和SnRK1A间的相互作用而导致的，将SnRK1A-GFP和SKIN(Ri)在大麦糊粉中瞬时地共表达。在SKIN(Ri)存在的情况下，无论是否存在ABA，SnRK1A-GFP在-S培养基中都高度地集中在细胞核中(图10C和图22C)。用SnRK1A-GFP和MYBS1-GFP转化过表达SKIN(Ri)的转基因水稻，无论是否存在ABA，SnRK1A-GFP在-S培养基中都高度地集中在细胞核中(图10D和图22D)。这些研究表明ABA促进了SKIN和SnRK1A间的胞质互作并减少了SnRK1A和MYBS1核定位。

SKIN1通过抑制淀粉和赤霉素(GA)生物合成所必须的酶而抑制了种子发育

既然已经有人提出SnRK1与碳水化合物代谢和淀粉生物合成相关(Polge and Thomas,2007)，我们对SKIN1-Ox、SKIN1-Ri以及SnRK1A-Ri转基因系的谷粒品质进行了检测。SKIN1-Ox和SnRK1A-Ri系的种子大小小于野生型(图23A)。定量分析显示SKIN1-Ox和SnRK1A-Ri系的种子长度、厚度和宽度(图23B)，以及千粒重和籽粒产量(图23B)均显著低于野生型和SKIN1-Ri系。

编码细胞壁转化酶(CIN2)的GIF1(籽粒不完全灌浆,Grain Incomplete Filling 1)基因，对于在早期籽粒灌浆期间的碳分配是必须的{Wang,2008#765}。通过定量RT-PCR分析，我们发现在SKIN1-Ox转基因系的未成熟花序中的GIF1mRNA的水平也减少了40％(图23C)。近来，我们发现组成型(constitutively)的活性钙依赖的蛋白激酶1(CDPK1-Ac)抑制了GA生物合成所必须的GA3ox2的表达，且减少了转基因水稻的籽粒大小{Ho,2013#909}。我们发现在SKIN1-Ox转基因系中的GA3ox2 mRNA的水平减少了60％(图23C)。在SnRK1A-Ri系中，GIF1的表达降低了20％而GA3ox2的表达没有变化，这表明GA3ox2的调控是SnRK1A非依赖型的。

总之，这些研究表明植物中籽粒的发育随着SnRK1A活性的降低而受到限制，这是由于抑制淀粉和赤霉素(GA)生物合成所必须的酶的SKIN1水平的提高而导致的。

在田间条件下，SKIN1-Ox成熟植物的高度只是略微降低了(图24)。然而，在SKIN1-Ox和SnRK1A-Ri植物中的籽粒大小，重量和产量显著减少了(图23A和图23B)。尽管已有研究表明在土豆块茎中，SnRK1通过对涉及淀粉生物合成中的酶的转录调控而间接控制碳水化合物的代谢{Halford,2003#134；Polge,2007#356}，我们无法检测编码可能涉及发育的水稻种子中的淀粉生物合成的几种酶的改变的mRNA累积，例如淀粉分支酶I(BEI)、异淀粉酶1(ISA1)、淀粉合成酶I(SSI,SSIIIa,SSIVa)、颗粒结合型淀粉合成酶(GBSSI),ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPS2a,AGPS1,AGPL1)以及蔗糖合成酶(Ss1,Ss2,Ss3)(数据未显示)。

在酵母中，SNF1激酶复合物对于用于在作为可选碳源的蔗糖上生长的葡萄糖抑制的转化酶的转录诱导是必须的{Hardie,1998#129}。在植物中，细胞壁转化酶将转运自源组织的蔗糖切割成被细胞吸收用于库组织中淀粉生物合成的葡萄糖和果糖，并被认为是源-库调控的关键酶{Roitsch,1999#906}。GIF1对于在水稻早期籽粒灌浆期间的碳分配是必须的，而gif1突变体尽管显示了正常的形态和结实，粒重却降低了{Wang,2008#765}。本研究证明了在水稻中GIF1受SnRK1A依赖的通路调控。GAs也调控包括雄花和雌花的繁殖器官发育{King,2003#917}，而GA3ox2是GA生物合成的必要酶{Olszewski,2002#754}。SKIN1可以独立地抑制SnRK1A信号发送和GA生物合成通路，这是由于以下观察结果：第一，在SKIN1-Ox系中籽粒产量的下降比SnRK1A-Ri系更显著(图23B)；第二，在SKIN1-Ox系中GIF1的表达降低了40％(图23C)，而在SnRK1A-Ri系中GIF1的表达降低了20％(图23D)；第三，GA3ox2在SKIN1-Ox系中降低了(图23C)而在SnRK1A-Ri系中则没有(图23D)。

SKIN是与SnRK1A相互作用并拮抗其功能的新型调解子

SKIN与SnRK1A在酵母和植物细胞中物理性地相互作用(图2和图12)。已经在植物中鉴定出了几个与SnRK1相互作用的蛋白。例如，在酵母中与两种拟南芥SnRK1(AKIN10和AKIN11)相互作用的PRL1WD蛋白，其负调节拟南芥中这两种SnRK1及下游葡萄糖调控的基因的活性(Bhalerao et al.,1999)。大麦基因SnIP1与种子特异性的SnRK1在体外相互作用(Slocombe et al.,2002)。来自苔藓小立碗藓(Physcomitrella patens)的两个蛋白，PpSK11和PpSK12与SnRK1在酵母中相互作用并抑制其活性(Thelander et al.,2007)。然而，这些蛋白与SKIN没有同源性。

在SKIN中的KSD在所有来自单子叶植物和双子叶植物的SKIN同源物中是高度保守的，并在C末端具有保守的NLS，该NLS代表了在5个植物物种中鉴定出来的SKIN密切相关家族的最显著的特征(图1A)。在来自单子叶植物中的该蛋白中具有几个明显的其他的保守区域，这意味着在单子叶植物和双子叶植物间可能存在有不同的结构以及/或功能特征。在以前SKIN相关的家族的任何一个成员都没有涉及KSD的功能，这里我们证明了KSD对于SnRK1A功能的拮抗是必须的(图3D)。在酵母和植物细胞中，SKIN1和SKIN2的N末端的第1至83位氨基酸和第1至85位氨基酸分别与SnRK1A-KD相互作用(图2和图14)。但是，KSD并不位于这些区域中(图3D)。还不清楚SKIN-KSD如何干扰SnRK1A的功能。在SKIN的N末端有几个区域是高度保守的，而它们当中的一些也是单子叶植物所特有的。SKIN中与SnRK1A-KD相互作用的核心域仍有待更好地定义。

据我们所知，该新蛋白家族唯一一个功能已被研究的成员是甘蓝的BnKCP1，其被认为是在拟南芥中与组蛋白去乙酰化酶HDA19相互作用并激活冷-诱导(cold-inducible)基因的转录因子(Gao et al.,2003)。BnKCP1中的KID是与HDA19相互作用所必须的，并与哺乳动物cAMP应答元件结合蛋白(CREB)家族中的KID具有一定的功能相似性(Gao et al.,2003)。包含RRXS(其中X代表任意氨基酸)的典型KID(Gonzalez et al.,1991)在SKIN1和SKIN2(RRAS)中都是保守的，然而其在整个蛋白氨基酸序列中的相对位置与BnKCP1的KID则截然不同(图1)。KID是否也在水稻SKIN中发挥作用仍有待确定。

在酵母中观察到的SnRK1A复合物中亚单元之间的类似的结构性的、功能性的以及调节性的相互作用也在植物中存在(Lu et al.,2007；Polge and Thomas,2007；Halfordand Hey,2009)。在酵母中，Snf1在含有葡萄糖的培养基中在细胞质中，而当葡萄糖缺乏时，在Gal83的协助下，大部分的Snf1都移位进细胞核中(Vincent et al.,2001)，并且Snf1-RD负责与Gal83的相互作用(Jiang and Carlson,1997)。在-S培养基中在细胞核中检测到SnRK1A-RD(图7)可能是由于其缺乏与其他细胞质因子的相互作用或缺乏与水稻Gal83类似物的有效相互作用。大量的SnRK1A-GFP定位于细胞质可能是由于其被他细胞质因子通过共入核的SnRK1A-KD或不足量的内源Gal83类似物而捕获(图7)。然而，与在+S培养基中相比，在-S培养基中SnRK1A在核中的累积显著增加了(图10A，图版3)。

已经证明Snf1和SnRK1的核定位分别对于它们在酵母细胞和拟南芥叶肉原生质 体中的蛋白激酶活性而言是必须的(Vincent et al.,2001；Cho et al.,2012)。还不清楚SnRK1的核定位是否对于调控营养缺乏信号通路的调控是必须的。我们之前的研究表明SnRK1的表达受糖缺乏诱导(Lu et al.,2007)。因此，在-S培养就中细胞核中的SnRK1A的水平可能会增加。具有或没有NLS的SKIN保持了它们的拮抗活性(图8C)，这表明了SKIN对于SnRK1A的拮抗作用与其细胞定位无关。在没有ABA时，在+S条件下SnRK1A在细胞核中并不存在(图10A，图版3)，而在-S条件下其在细胞核和细胞质中均存在(图10A，图版7)。尽管SnRK1A显著的提高了αAmy3 SRC启动子的活性，在-S条件下，所述SRC活性受SKIN抑制至背景水平(图3B和图8C)。因此，在细胞核和细胞质中，内源的SnRK1A可能被SKIN拮抗。

SnRK1A依赖性营养缺乏信号转导通路在调控源库交流上发挥关键作用

已经证明在适应于有限能源方面，SnRK1调控苔藓和高等植物间相似的生理活性。小立碗藓(Physcomitrella patens)的两个SnRK基因(snf1a和snf1b)的双敲除突变体响应于黑暗代谢淀粉储备的能力降低了，且其只能通过供以葡萄糖或提供持续光照才能保持存活(Thelander et al.,2004)。这一突变体在正常的白天(16h)-夜晚(8h)循环下无法生长，推测是由于在黑暗中不能进行正常的碳水化合物代谢(Thelander et al.,2004)。拟南芥两个SnRK1，KIN10和KIN11的过表达则增加了在低光照下有限能源时主根的生长，而由病毒诱导的基因沉默而产生的kin10和kin11的双敲除突变体，阻滞了来自叶片的淀粉代谢并因此阻滞了幼苗生长(Baena-Gonzalez et al.,2007)。尽管已经有报道提出SnRK1调控在植物中源组织和库组织的碳分配(Roitsch,1999)，由于在高等植物中snrk1无效突变体固有的生长缺陷，SnRK1在源库交流中的分子和细胞机理尚不清楚。

在水稻中，SnRK1家族具有两个成员，SnRK1A/OSK1和SnRK1B/OSK24，它们的氨基酸序列具有74％同源性(Takano et al.,1998；Lu et al.,2007)。我们之前的研究证实了SnRK1A，而非SnRK1B，介导了在生长的幼苗当中的糖缺乏信号级联反应(Lu et al.,2007)。由于SnRK1A均匀地表达在各种生长的组织中(包括幼根和幼芽、花和未成熟种子)，因此SnRK1A应该比SnRK1B在糖调控中发挥了更广泛的作用(Takano et al.,1998)。SnRK1A在MYBS1和αAmy3 SRC的上游起作用，而且在水稻中调控种子萌发和幼苗生长方面发挥关键作用(Lu et al.,2007)。能够在幼苗、成熟植物、花以及未成熟花序的所有组织中检测到两种SKIN的表达(图19)。这些研究表明，SnRK1A和SKIN在萌发的种子和生长的幼苗中都有表达。

我们证明了SKIN对于SnRK1A功能的拮抗是充分且必要的(图3B)。并且，在转基因水稻中，在早期幼苗生长阶段调控胚乳中营养代谢的源库交流被认为是通过SnRK1A依赖性营养缺乏信号转导通路作用的。SKIN的表达受糖缺乏的诱导，类似于在糖乏信号通路中的组分(图4、图版1)。在+S和-S条件下，MYBS1以及各种水解酶的mRNA的累积在SKIN-Ox系中受到抑制，而在+S条件下，它们的累积在SKIN-Ri系中仅仅是略微增加，而在-S条件下则没有。SKIN1和SKIN2可能有冗余的功能，这些功能导致了用于增强在-S条件下在单SKIN沉默系中内源基因表达的不显著响应。

幼苗芽和茎的生长在SKIN-Ox植物中受到抑制，而在SKIN-Ri植物中受到促进，而且这些效果在黑暗，模拟糖缺乏的条件下比在通过光合作用产生糖的光照/黑暗循环条件下更加明显(图5A和图5B)。在SKIN-Ox和SKIN-Ri植物中幼苗生长的延迟和促进分别伴随着αAmy3表达的减少和增加(图5C)。而且，SKIN-Ox幼苗的生长可以通过施加外源的糖而得到恢复。在低氧条件下也观察到类似的SKIN过表达对幼苗生长的负面作用(图6)。这些研究表明SnRK1A依赖性糖需求信号对于促进糖供给从胚乳/面粉蛋白(aleuron)(源)(在此产生用于营养代谢的水解酶)(图4和5)到萌发的胚/生长的种子(库)(在此利用营养)，并容许植物在黑暗或低氧下生长是充分且必要的。在幼苗中EP3A的表达受类似于αAmy的SKIN的调控(图5C)，这表明其他营养，虽然需求量较少，也很可能通过SnRK1A调节的通路协调地产生。

关键因子的不同的细胞定位调控非生物胁迫下的源库交流

植物经常遭受环境胁迫(例如，水缺乏、水灾、极端温度，以及高盐)，这些环境胁迫常常抑制光合作用、影响碳水化合物分配、限制生长，并因此引起产量显著降低。几方面的证据显示ABA可能是在非生物胁迫下通过SKIN调控SnRK1A依赖性糖缺乏信号转导通路的关键信号分子。首先，SKIN的表达受多种非生物胁迫和ABA的诱导(图9A)。第二，ABA和SKIN拮抗SnRK1A功能的方式相类似(图10)。第三，ABA促进了SnRK1A和SKIN间的相互作用(图2D)。第四，SKIN的过表达促进了ABA介导的对幼苗生长的抑制(图9B)。该观点通过以下发现得到了更进一步的支持，糖缺乏促进而ABA抑制了SnRK1A的核定位(图10A，图版3)。有趣的是，在-S条件下存在ABA的情况下，SKIN重新从细胞核定位至细胞质中，这一过程伴随着SnRK1A和MYBS1被排除在核外(图10A，图版5至8)。SnRK1A被排除在核外是由于它和SKIN在细胞质中相互作用，因为在用ABA处理的-S条件下，沉默瞬时过表达SKIN(Ri)的大麦糊粉细胞的SKIN或沉默稳定过表达SKIN(Ri)的转基因水稻糊粉细胞 的SKIN(图10D，比较图版2,3和图版1)显著地提高了SnRK1A在核中的累积(比较图10C和图10A，图版7)。

已经证实，SnRK1直接调控细胞质中酶活性并作为基因表达的调解子(Halford and Hey,2009)。SnRK1A似乎通过不同的机制调控糖缺乏信号通路。我们之前的研究表明，SnRK1A激活MYBS1启动子活性并很可能直接将MYBS1磷酸化(Lu et al.,2007)。此外，如之前报道的那样，MYBS1的入核受到糖抑制而受糖缺乏的促进(Hong et al.,2012)(图10B，图版1)。这里我们进一步证明了SnRK1A对于促进MYBS1分别在+S及-S条件下的入核是充分且必要的(图10B，图版2和3)。然而，由于相比细胞核而言，大量SnRK1A定位在细胞质中，还不清楚MYBS1如何在细胞质或核中受到SnRK1A的调控。通过SKIN沉默恢复SnRK1A的核定位同样也恢复了在用ABA处理的-S条件下转基因水稻种的MYBS1的核富集(图10D，比较图版5,6和图版4)，这表明了SnRK1A和MYBS1的核定位与SKIN紧密相连并受其抑制。可想而知，细胞质中的SKIN阻止了SnRK1A和MYBS1的核定位，使得它们无法上调αAmy3 SRC活性。

总之，如图11所示，库强度作为驱动力而SnRK1A在源库交流中发挥核心的调控作用。不同的细胞定位似乎是这一调控中的关键因子。之前已经证实了重要的GA调解子MYBGA促进了MYBS1的功能和入核(Chen et al.,2006；Hong et al.,2012)。这里，我们进一步证明了糖和营养需求作为来自库组织(萌发的胚和幼苗)中的重要信号诱发了两种缺乏信号分子(即，SnRK1A和MYBS1)的共核定位，从而诱导了源组织(胚乳)中营养代谢所必须的α-淀粉酶和其他水解酶。并且，胁迫和ABA不仅诱导了SKIN的合成，而且促进了其从核中撤出至细胞质或阻止其从细胞质入核。细胞质中的SKIN反过来与SnRK1A结合并阻止SnRK1A和MYBS1进核，并最终导致了对水解酶产生的抑制。然而，既然SnRK1A大量地集中在细胞质中(甚至在糖缺乏的情形下)且SnRK1蛋白激酶在细胞质中有底物(Halford and Hey,2009)，不能排除SnRK1A可能在细胞质中调控糖缺乏信号通路的可能性。值得注意的是在缺乏ABA或胁迫的情形下，SKIN定位在细胞核中，但功能未知。

当前全球气候变化趋向于将天气变化为更极端的干扰，例如，高低温、水灾以及水荒，这使本已进入停滞期的世界的作物生产力更加严重(IRRI,2010)。随着全世界人口迅速增加，更能忍受各种非生物胁迫并同时保持产量潜能的作物的发育仍然是重要和有挑战性的任务。在植物中，SnRK1调控在营养和生殖阶段的生长和发育的许多方面(Polge and Thomas,2007)。为了减轻SKIN过表达对植物生长的负面影响，理解 在非生物胁迫下SKIN在时间上和空间上对植物生长的限制的作用模式有助于对于谷物的改良，使其增强对非生物胁迫的耐受而不损失产量。

在中国台湾中兴大学的灌溉田(irrigated field)和非灌溉田(non-irrigated field)里种植野生型水稻，以及SKIN1-Ox和SKIN1-Ri转基因水稻。在2014年的第一季度，气候和台风带来了很多的雨，非灌溉田不如期望的那样干燥。然而，图25显示了即使在非灌溉田条件不是很完美的情形下，SKIN1-Ri转基因水稻依然增加了约7.4％的水稻产量。这证明了内源SKIN表达的降低增加了水稻产量。如果非灌溉田条件良好的话，产量差别会更好。

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