一种用于区别检测禽类重要经济病毒的mRT-PCR试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及可用于多种禽病毒检测的试剂盒，特别涉及一种用于区别检测禽类 重要经济病毒的mRT-PCR试剂盒及其应用，本发明属于病毒检测技术领域。

背景技术

禽流感(Avian influenza，AI)是全球性传播疾病，由正粘病毒科的禽流感病毒 引起，按病毒表面血凝素分类，已经发现有18个H亚型，按病毒神经氨酸酶分类已 发现有10个亚型。由于该两种蛋白存在高度变异，因此自然界中有许多不同种亚型 的禽流感病毒。

许多禽流感病毒在禽的呼吸道、消化道定居引起轻微症状或无症状，但高致病 性禽流感H5、H7、H9亚型的病毒能够感染人类并致病。H5、H7、H9禽流感在禽 类流行，H5、H7亚型引起人的感染和死亡。禽流感和其他禽类呼吸道病毒混合感染， 产生特征相似的临床症状，例如禽流感病毒感染和传染性喉气管炎病毒、新城疫病 毒、传染性支气管炎病毒感染的临床特征难以区别，因此使病原分离和鉴别异常困 难。

在中国禽类养殖中，传染性喉气管炎病毒、传染性支气管炎病毒、新城疫病毒、 传染性法氏囊病毒、减蛋综合症病毒的流行率较为普遍。尽管有减毒和灭活疫苗 上市控制流行，但对于疾病防控检测和养殖企业的生物安全仍是不够的。通常病毒 感染诊断采用病毒分离、鉴别和血清学试验的方法，但这些方法费时耗力，特别是 疫苗的大规模免疫使禽呼吸道病原分离和鉴别异常困难。因此，有必要开发灵敏、 特异、快速的诊断技术区分这6种病原。

最近几年，核酸扩增技术如环介导等温扩增技术(LAMP)、重组酶复制酶扩 增技术(RPR)、实时RT-qPCR、多重RT-PCR(mRT-PCR)技术在病毒检测和诊断方 面被广泛应用，其优点在于一个反应就可检测多种微量的病原分子，快速，准确性 高。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种能够区别检测3种亚型禽流感病毒以及 在国内流行的其他禽常见呼吸道感染5种病原的试剂盒，同时建立一种使用该试剂 盒进行检测的方法。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明的一种用于区别检测禽类重要经济病毒的mRT-PCR试剂盒，包括分别 用于检测禽流感病毒(Avian Influenza virus，AIV)M基因、禽流感病毒H7、H9、 H5亚型、新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)、传染性支气管炎病毒(Infectious  bronchitis virus，IBV)、传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus，ILTV)、 传染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)以及减蛋综合症病毒(Egg  drop syndrome virus 76，EDS 76)的引物对；

其中，用于检测禽流感病毒M基因的引物对如下所示：

M-WSN F：5′-GAA GGTAGATATTGAAAGATG-3′(SEQ ID NO.1)

M-1023R：5′-GAA ACAAGGTAGTTTTTTACTC-3′(SEQ ID NO.2)

其中，用于检测禽流感病毒H7亚型的引物对如下所示：

H7-397F：5′-ACA TAC AGT GGG ATA AGA ACC-3′(SEQ ID NO.3)

H7-391R：5′-TCT CCT TGT GCA TTT TGA TGC C-3′(SEQ ID NO.4)

其中，用于检测禽流感病毒H9亚型的引物对如下所示：

H9-1F：5′-AGC AAA AGC AGG GGA AYW WC-3′(SEQ ID NO.5)

H9-808R：5′-CCA TAC CAT GGG GCA ATT AG-3′(SEQ ID NO.6)

其中，用于检测禽流感病毒H5亚型的引物对如下所示：

H5-1：5′ACT ATG AAG AAT TGA AAC ACC T-3′(SEQ ID NO.7)

H5-2：5′-GCAATGAAATTT CCA TTA CTCTC-3′(SEQ ID NO.8)

其中，用于检测传染性支气管炎病毒的引物对如下所示：

IBV-F：5′-GCT TTT GAG CCT AGC GTT-3′(SEQ ID NO.9)

IBV-R：5′-GCC ATG TTG TCA CTG TCT ATT-3′(SEQ ID NO.10)

其中，用于检测新城疫病毒的引物对如下所示：

NDV-F：5′-GCAGCTGCAGGGATTGGGT-3′(SEQ ID NO.11)

NDV-R：5′-TCTTTGAGCAGGAGGATGTTG-3′(SEQ ID NO.12)

其中，用于检测传染性喉气管炎病毒的引物对如下所示：

ILTV-F：5′-ACG ATG ACT CCG ACT TTC-3′(SEQ ID NO.13)

ILTV-R：5′-CGT TGG AGG TAG GTG GTA-3′(SEQ ID NO.14)

其中，用于检测传染性法氏囊病毒的引物对如下所示：

VP2-F：5′-ACTGCCCAGAACCTACC-3′(SEQ ID NO.15)

VP2-R：5′-ACCRAGYCTCACATACC-3′(SEQ ID NO.16)

其中，用于检测减蛋综合症病毒的引物对如下所示：

Hexon-F：5′-CAARTTCAGRCAGACGGT-3′(SEQ ID NO.17)

Hexon-R：5′-TAGTGATGMCGSGACATCAT-3′(SEQ ID NO.18)。

在本发明中，优选的，所述的试剂盒中还包括反应混合液，逆转录酶和Taq DNA 多聚酶混合液以及不含RNase的双蒸水。

使用本发明所述的试剂盒，用于区别和检测禽类重要经济病毒时需进行三次 mRT-PCR反应：

第一次，称为三价mRT-PCR，使用检测禽流感病毒H7、H9、H5亚型的引物对， 以待检病毒DNA/RNA为模板，进行mRT-PCR扩增；

第二次，称为六价mRT-PCR，使用检测禽流感病毒M基因、新城疫病毒、传染 性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒、传染性法氏囊病毒以及减蛋综合症病毒的 引物对，以待检病毒DNA/RNA为模板，进行mRT-PCR扩增；

第三次，称为八价mRT-PCR，使用检测禽流感病毒H7、H9、H5亚型、新城疫 病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒、传染性法氏囊病毒以及减蛋综 合症病毒的引物对，以待检病毒DNA/RNA为模板，进行mRT-PCR扩增。

第一次mRT-PCR的反应DNA产物通过琼脂糖电泳观察包括300bp的H7扩增片 段、456bp的H5扩增片段、808bp的H9扩增片段。第二次mRT-PCR的反应DNA产物 通过琼脂糖电泳观察包括1个长约1023bp的禽流感病毒M基因扩增片段、149bp的 IBV扩增片段、356bp的NDV扩增片段、647bp的ILTV扩增片段、212bp的IBDV扩 增片段以及897bp的EDS-76扩增片段。第三次mRT-PCR的反应DNA产物通过琼脂 糖电泳观察包括149bp的IBV扩增片段、356bp NDV扩增片段、647bp ILTV扩增片 段、300bp的H7扩增片段、456bp的H5扩增片段、808bp的H9扩增片段、212bp的 IBDV片段以及897bp的EDS-76扩增片段。

在本发明中，优选的，所述的三次mRT-PCR反应均在热循环仪中进行，反应条 件为：45℃45min合成cDNA，96℃变性5min，95℃变性1min,53℃退火5min， 70℃延伸1min，共进行40个循环，完成循环后72℃延伸10min，保存于4℃。

进一步的，本发明还提出了所述的试剂盒在制备区别检测禽类重要经济病毒的 试剂中的用途，所述的禽类重要经济病毒包括禽流感病毒H7、H9、H5亚型、新城 疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒、传染性法氏囊病毒以及减蛋 综合症病毒。

本发明提供了一种快速鉴别和区别混合感染中禽流感病毒以及禽类5种经常流 行呼吸道病原的方法，使用本发明所建立的方法检测禽流感病毒和呼吸道其他病毒 具有灵敏度高、特异性强等特点，可及时检测和区别禽流感中最重要的亚型和在国 内最普遍流行的5种禽呼吸道病原，对人畜共患病控制混合感染病原的监测、防控、 养殖场生物安全、减少养殖业损失、食品安全和检疫有着重要意义。

与传统RT-PCR技术相比，采用本发明的方法可直接检测临床上的各种样本， 省时节力省材料试剂，可用于病毒感染的诊断和筛选、禽病监测。一次反应、一步 程序，省去了cDNA扩增后再反应的步骤，检测结果即时可见。特别是该方法对仪 器设备要求低，省去了昂贵仪器，如实时定量PCR仪的购买，普通的PCR循环仪和 琼脂糖电泳设备就能满足检测条件，适合我国动物养殖和生物安全的检测需要。

具体实施方式

下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施 例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。

实施例1、试剂盒的制备和组装

1、引物的设计及合成

参照基因库中国流行株已经发表的序列、通过软件对比优化，设计并合成了分 别用于检测禽流感病毒(Avian Influenza virus，AIV)M基因、禽流感病毒H7、H9、 H5亚型、新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)、传染性支气管炎病毒 (Infectious bronchitis virus，IBV)、传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis  virus，ILTV)、传染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)以及减蛋综 合症病毒(Egg drop syndrome virus 76，EDS 76)的引物对，具体引物序列如下表1 所示，各引物按100pmol/μL稀释贮存-20℃备用。

表1多重逆转录多聚酶连反应(mRT-PCR)所涉及引物序列

其中混合编码位点表示：Y＝C/T；R＝A/G；W＝A/T；M＝A/C；S＝C/G。

2、其他成分

RT-PCR反应混合液，Superscript II逆转录酶、PlatinumTaq DNA多聚酶混合 液、dNTP混合物以及不含RNase的双蒸水。

实施例2本发明的mRT-PCR试剂盒在区别和检测禽类重要经济病毒中的应用

1、病毒和样本

下列病毒用于标化多重逆转录多聚酶链反应：

H7N9分离毒

1.A/Chicken/威县/中国2013-4/03(H7N9)

2.A/Chicken/威县/中国/2013-5/04(H7N9)

3.A/Chicken/威县/中国/2014-4/04(H7N9)

H9N2分离毒

1.A/Chicken//邢台/中国/2014-6/01(H9N2)

2.A/Chicken/邢台/中国/2013-1/05(H9N2)

3.A/Chicken/威县/中国/2013-1/06(H9N2)

H5N2分离毒

1.A/Chicken/威县/中国/2013/03(H5N2)

2.A/Chicken/邢台/中国/2013/04(H5N2)

3.A/Chicken/邢台/中国/2013/06(H5N2)

以上这些毒株分离用9日龄鸡胚分离、鉴定、传至3代，并冻干保存。

从梅里亚公司的冻干活疫苗中提取新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒 (IBV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、传染性法氏囊病毒(IBDV，Georgia)、 减蛋综合症病毒EDS76(EDS76/ADS/92)标化检测方法。

从公司养殖场样本能被本发明的技术所鉴别的NDV、IBV、ILTV病毒如下：

1.Chicken/邢台/中国/WZL1303/05(IBV M-41)

2.Chicken/邢台/中国/WZL-2013/06(IBV M-41)

3.Chicken/邢台/中国/WZL-2013/05(NDV)

4.Chicken/邢台/中国/WZL-2013/07(NDV)

5.Chicken/邢台/中国/WZL-2013/06(ILTV)

6.Chicken/邢台/中国/WZL-2013/07(ILTV)

样本来自显示有呼吸道感染症状病鸡组织包括气管、肺、脾、小肠，组织和器 管和在一起提取RNA和DNA。

2、RNA和DNA的提取

使用QIAamp病毒RNA小提试剂盒Viral RNA Mini Kit(52906，Qiagen公司产 品)按厂商提供的说明书提取器官匀浆、鸡胚尿囊液、疫苗的病毒RNA。ILTV和 EDS76DNA用Easy DNA试剂盒(美国Invitrogen公司产品)提取。RNA或DNA浓度 用生物光度计测定(Eppendorf公司产品).

3、引物设计和优化

4对特异扩增禽流感病毒M基因、禽流感H7、H9、H5亚型基因以及用于扩增IBV、 ILTV、NDV、IBDV、EDS76基因的引物见表1，H7、H9、H5亚型病毒和其他病 毒引物是根据基因库中国流行株已经发表的序列、通过软件对比优化，设计合成， 按100pmol/μL稀释贮存-20℃备用。

3、mRT-PCR优化

逆转录和扩增一步法：

发明采用试剂盒RT-PCR kit(美国Invitrogen公司产品)，按厂商提供的说明书进 行，反应体积50微升。优化包括RT-PCR扩增的混合液，优化Mg²⁺浓度、dNTP、 稳定剂的浓度。不同模板RNA稀释，进行多次mRT-PCR试验获得优化模板浓度。

分别进行三次mRT-PCR，第一次，称为三价mRT-PCR，使用检测H7、H9、H5 亚型的引物和不同血凝亚型的病毒DNA/RNA作为模板，第二次mRTPCR，称为六 价mRT-PCR，使用检测禽流感病毒M基因、NDV、IBV、ILTV、IBDV、EDS76的 引物和特异性的病毒DNA/RNA作为模板，按优化条件进行mRT-PCR。第三次，称 为八价mRT-PCR，使用检测H7、H9、H5、NDV、IBV、IBDV、ILTV、EDS76的 引物和特异性的病毒DNA/RNA作为模板，确定优化的扩增条件。

mRT-PCR产物

DNA复制产物、1-kbDNA分子量标记物、溴乙锭用2％琼脂糖电泳、电压120V， 时间20分钟，使用凝胶成像系统拍照。

4、mRT-PCR灵敏性和特异性

使用产生相同临床症状禽病原和各亚型禽流感病毒样品混合，使用优化的 mRT-PCR在同一反应中检测和区别禽流感病毒和禽其它病原的能力。

禽流感H7、H9、H5、NDV、IBV、ILTV、IBDV、EDS76的DNA-RNA混合， 使最终模板含量在10fg-500ng的范围。为确定灵敏性，使DNA-RNA模板100ng按照 10倍体积进行稀释，按优化了的循环程序进行检测。

该法特异性通过检测禽流感病毒和区别禽流感亚型H7、H9、H5以及其他呼吸 道病毒NDV、IBV、ILTV、IBDV、EDS76的能力确定。病毒DNA-RNA 10fg-500ng 范围内，检测禽流感、H7、H9、H5的亚型引物进行优化了mRT-PCR扩增反应，观 察结果中是否有NDV、IBV、ILTV IBDV、EDS76的扩增产物。同样用NDV、IBV、 ILTV、IBDV、EDS76的引物进行优化模式的扩增，观察反应产物是否有AIV、H7、 H9、H5的扩增产物。

5、结果

5.1mRT-PCR优化

在反应的退火温度、延伸时间、循环数量、探针浓度、模板稀释和浓度做了多 次修改和优化，用优化的操作程序进行反应，优化后的反应体系及反应参数如下：

配制反应体系：1μL模板，用于扩增禽流感病毒M基因、H7、H9、H5、IBV、 ILTV、NDV、IBDV、EDS76的正反引物(100pmol/μL)各1微升(根据需要选择 引物对)，加入2.5μL酶混合液(含优化Superscript II逆转录酶和PlatinumTaq DNA 多聚酶)，RT-PCR扩增的2X反应混合液25μL，dNTP(各10mM)5μL，用无核酸 酶水补足50微升体积。

在热循环仪(GeneAmp PCR System 9700,AB生物系统公司产品)中进行：45℃ 45min合成cDNA，96℃变性5min,40个循环，每次循环包括：

95℃变性1min，53℃退火5min，70℃延伸1min，完成循环后72℃延伸 10min，保存于4℃。阴性对照不含模板cDNA，含主混合液、所有的引物对和无核 酸酶水。

反应产物用琼脂糖电泳观察：第一次mRT-PCR的反应DNA产物通过琼脂糖电泳 观察包括300bp的H7扩增片段、456bp的H5扩增片段、808bp的H9扩增片段。第二次 mRT-PCR的反应DNA产物通过琼脂糖电泳观察包括1个长约1023bp的禽流感病毒M 基因扩增片段、149bp的IBV扩增片段、356bp的NDV扩增片段、647bp的ILTV扩增 片段、212bp的IBDV扩增片段以及897bp的EDS-76扩增片段。第三次mRT-PCR的反 应DNA产物通过琼脂糖电泳观察包括149bp的IBV扩增片段、356bp NDV扩增片 段、647bp ILTV扩增片段、300bp的H7扩增片段、456bp的H5扩增片段、808bp 的H9扩增片段、212bp的IBDV片段以及897bp的EDS-76扩增片段。

5.2mRT-PCR灵敏性和特异性

本发明方法的敏感性用检测极限说明，对禽流感、禽流感病毒血凝素基因(H7、 H9、H5)扩增产物可视最小极限值为1ng，对IBV、NDV、ILTV、IBDV、EDS76的 检测可视极限值为100pg。检测AIV H7、H9、H5亚型和其他呼吸道病原时，不同的 DNA-RNA混合物(病毒模板)，阴性对照不含DNA-RNA(病毒模板)、含引物和 缓冲液和酶)并没有产生非特异反应。

检测和区别禽流感H7、H9、H5亚型以及对IBV、NDV、ILTV、IBDV、EDS76 具有特异性，H7、H9、H5亚型病毒扩增产物用2％琼脂糖、电压120V电泳时间20 分钟在1-kbDNA分子量标记物、溴乙锭染色观察到300bp、808bp、456bp的片段； IBV、NDV、ILTV、IBDV、EDS76扩增产物分别显示149bp、356bp、647bp、212bp、 897bp片段。采用检测禽流感、H7、H9、H5的亚型引物进行优化了的mRT-PCR扩增 反应，观察结果中没有发现NDV、IBV、ILTV IBDV、EDS76的扩增产物。同样用 NDV、IBV、ILTV、IBDV、EDS76的引物进行优化模式的扩增，观察反应产物中 没有发现有AIV、H7、H9、H5的扩增产物。说明本发明设计的引物对特异性良好。

以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性 的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进 行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。