针对血栓形成过程中胶原蛋白-整联蛋白α2β1相互作用的纳米抑制剂及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及针对血栓形成过程中胶原蛋白与整联蛋白α2β1相互作用的纳米抑制剂及 制备方法和应用，属于生物材料中的药物载体设计和医学中的血栓症的治疗研究领域。

背景技术

血栓性疾病严重危害人类的健康和生命安全，据世界卫生组织统计，在全球范围内， 血栓性疾病的发病率居高不下，并且在发展中国家呈现出逐年增加的趋势。其中，常见的 血栓性疾病如急性心肌梗死、脑梗死和缺血性中风导致的死亡和残疾占据极大比例，对人 类社会的经济和社会发展造成极大负面影响。动脉血栓的形成是由于血管内壁发生病变破 损，造成血管内皮下组织纤维物暴露于血浆之中，激活血小板诱发血液凝集形成血凝块阻 塞血管，导致血液循环流动受阻，甚至完全中断，危及人类的生命健康。血栓形成包括血 小板在破损血管内壁处的初始粘附、血小板的稳定吸附以及血小板聚集三个重要过程。目 前，市面上采用的血栓防治类药物多以血小板为靶向物，例如，阿司匹林(Aspirin)、利 多格雷(Ridogrel)、噻氯匹啶(Ticlopidine)等，这类药物通过不可逆抑制血小板表面受 体激活的关键代谢途径的酶活，以降低血小板的活力，达到抑制血栓形成的目的，但同时 也破坏人体的正常凝血与抗凝血的平衡，存在引发大规模出血的风险，有着很大的副作用。 因此，开发疗效显著、副作用小的血栓防治药物已经成为医学界研究的热点，具有重要意 义。

血小板表面的整联蛋白α2β1与胶原蛋白结合对血小板在破损血管壁处的稳定吸附有 着至关重要的作用。研究报道整联蛋白α2β1的过量表达将导致血栓的形成，而表达缺陷 型仅仅会轻微延长出血时间，并不会导致严重的出血不止的问题。因此，以胶原蛋白为靶 向物，通过阻隔血小板表面的整联蛋白α2β1与破损血管壁处暴露的胶原蛋白结合，是一 条有效的抑制血栓形成的手段，并且有助于减小大规模出血的风险。多肽抑制剂 LWWNSYY基于整联蛋白α2β1与胶原蛋白结合的关键残基设计筛选而来，被证实能有效 的吸附在胶原蛋白表面，阻隔整联蛋白α2β1与胶原蛋白结合从而抑制后续的血栓形成， 但由于其较强的疏水性导致LWWNSYY分子多聚形成分子团簇，严重影响药物在生理条 件下效能的发挥。因此，改善多肽抑制剂在生理环境下的溶解度和分散性对于药物效能的 提升有着重要意义。

将疏水药物与大分子或者纳米颗粒偶联，通过固定化的方法改善其在水相中的溶解度 和分散性被广泛证实是一条有效途径。甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)由于其较好的生物 相容性和丰富的表面活性基团，被广泛应用于药物修饰和载体输送的研究中，是一个优良 的药物载体。因此，将多肽抑制剂固定在GMA单体聚合形成的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯 (PGMA)纳米颗粒的表面是一条提升其水溶性和分散性的有效途径。

发明内容

本发明目的在于提出针对血栓形成过程中胶原蛋白-整联蛋白α2β1相互作用的纳米抑 制剂及制备方法和应用，所得纳米抑制剂是首次提出并经验证是有效的。多肽血栓抑制剂 LWWNSYY被证实能有效抑制胶原蛋白与整联蛋白α2β1结合从而抑制后续的血栓形成， 但是其较强的疏水性导致其在生理环境多聚形成分子团簇，严重影响其药物效能的发挥。 通过将多肽抑制剂固定于PGMA纳米颗粒表面制备获得纳米抑制剂LPN，可有效提升多 肽抑制剂在水溶液的溶解度和分散度。等温滴定量热实验、血小板吸附实验和大鼠体内血 栓实验证实该纳米抑制剂LPN相比原多肽抑制剂LWWNSYY能够更好抑制血栓形成，是 更加高效的血栓抑制剂。

本发明的纳米抑制剂制备技术方案概述如下：

本发明提出的纳米抑制剂结构上分为两个部分，一个部分是由甲基丙烯酸缩水甘油酯 聚合形成的粒径在80～120nm范围内的PGMA纳米球，另一部分是固定在PGMA纳米球 表面的发挥药物效能的多肽抑制剂LWWNSYY。我们将制备获得的纳米抑制剂命名为LPN (LWWNSYY-PGMA nanoparticles)。

本发明提出的纳米抑制剂LPN制备合成路线如下：

(1)通过甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)聚合形成基质PGMA纳米球；

(2)将获得的PGMA纳米球将表面的环氧基开环；

(3)通过加入环氧氯丙烷，在PGMA纳米球表面再次修饰上环氧基；

(4)通过环氧基与多肽抑制剂LWWNSYY的N末端氨基在碱性条件下反应，实现多肽 抑制剂在PGMA纳米球表面的固定，制备获得纳米抑制剂LPN。

具体优选各个步骤如下，但不局限于此，凡是达到本发明目的的方法，都使用本发明。

所述步骤(1)的方法如下：

在锥形瓶中，加入5～15％(v/v)甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)单体，0.1～0.5％(v/v) 乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)，5～15％(v/v)浓度为30～100mM的Na₂CO₃/NaHCO₃缓冲液，5～15％(v/v)浓度为1～5％(w/w)KPS溶液，0.01～1％(w/w)十二烷基硫酸钠(SDS)， 70～90％(v/v)过膜去离子水；随后向锥形瓶鼓入氮气，排净溶液中的氧气，持续10～20 min，然后密封瓶口；随后将加有反应物的锥形瓶置于空气浴摇床上，90～110rpm，20～30 ℃条件下乳化15～25min。乳化完成后将锥形瓶转移到水浴摇床上，160～200rpm，65～75℃ 条件下反应12～14h。将反应结束后的悬液装入透析袋(截留分子量8000～14000)于室温下 蒸馏水环境中透析3～5天，每天换透析液3～5次，获得纯净的PGMA纳米球。

所述步骤(2)的方法如下：

于锥形瓶中加入20～50％(v/v)的PGMA纳米球悬浮液，加入50～80％(v/v)浓度为0.3～1 M的硫酸溶液，55～65℃水浴，160～200rpm反应2～5h，打开PGMA纳米球表面的环氧基； 然后用步骤(1)所述透析方法，除去其中过量的硫酸分子，得到纯净的环氧基被开环的 PGMA-OH纳米球。

所述步骤(3)的方法如下：

于锥形瓶中加入20～50％(v/v)的PGMA-OH纳米球悬浮液于锥形瓶中，依次加入 20～30％(v/v)二甲基亚砜，10～15％(v/v)环氧氯丙烷，20～30％(v/v)NaOH(浓度为 0.5～2M)，150～200rpm，20～30℃条件下反应2～4h；反应后通过步骤(1)所述透析方法 除去过量的小分子，并在透析完成后用聚乙二醇20000进行浓缩；获得纯净的表面修饰有 环氧基的PGMA-ECH纳米球。

所述步骤(4)的方法如下：

于锥形瓶中加入20～50％(v/v)的PGMA-ECH纳米球悬浮液，加入0.01～2％(w/w) 多肽抑制剂LWWNSYY，再加入50～80％(v/v)的NaHCO₃(0.1～1M)溶液，20～30℃水 浴，150～200rpm反应10～14h，随后加入NaBH₄(控制终浓度为0.05～1M)反应10～14h。 反应结束后取出，用步骤(1)所述透析方法除去体系里的小分子，用聚乙二醇20000浓 缩，获得粒径80～120nm的纳米血栓抑制剂LPN，纳米血栓抑制剂LPN在透射电镜下呈现 出规整的球形；如图2所示。

本发明的纳米抑制剂LPN适应于对抑制血小板与胶原蛋白吸附方面的应用。

本发明的纳米抑制剂LPN适应于对抑制血栓形成大小方面的应用。

本发明的纳米抑制剂LPN适应于对抑制血栓形成速度方面的应用。

本发明的纳米抑制剂LPN作为血栓防治药物和保健品方面的用途。

本发明的有益效果：通过将多肽抑制剂LWWNSYY固定在PGMA纳米颗粒的表面制 备获得的纳米抑制剂LPN能有效克服多肽抑制剂由于较强的疏水性造成的分子多聚，从而 改善多肽抑制剂在生理环境下的水溶性和分散度。由此使得纳米抑制剂表面固定的多肽抑 制剂分子的有效亲和位点在生理条件下能够自由暴露，在等温滴定量热实验中实现与胶原 蛋白在生理环境规律结合，并且对抑制血小板与胶原蛋白吸附有着比原多肽抑制剂约3倍 药物效率的提升。不仅如此，通过在实际的大鼠血栓模型的对抑制剂的效果进行进一步的 研究中发现：多肽抑制剂LWWNSYY和纳米抑制剂LPN都能抑制血栓形成，但是纳米抑 制剂LPN的抑制效果更加明显。

附图说明

图1：本发明的纳米抑制剂LPN的制备流程图。

图2：本发明的纳米抑制剂LPN的透射电镜照片图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作详细描述，该实施例是用于解释、而不以任何方式限制本发 明。

纳米抑制剂LPN具体优选各个步骤如下，但不局限于此，凡是达到本发明目的的方法， 都使用本发明。

(1)在锥形瓶中，加入5～15％(v/v)甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)单体，0.1～0.5％ (v/v)乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)，5～15％(v/v)浓度为30～100mM的Na₂CO₃/NaHCO₃缓冲液，5～15％(v/v)浓度为1～5％(w/w)KPS溶液，0.01～1％(w/w)十二烷基硫酸钠(SDS)， 70～90％(v/v)过膜去离子水；随后向锥形瓶鼓入氮气，排净溶液中的氧气，持续10～20 min，然后密封瓶口；随后将加有反应物的锥形瓶置于空气浴摇床上，90～110rpm，20～30 ℃条件下乳化15～25min。乳化完成后将锥形瓶转移到水浴摇床上，160～200rpm，65～75℃ 条件下反应12～14h。将反应结束后的悬液装入透析袋(截留分子量8000～14000)于室温下 蒸馏水环境中透析3～5天，每天换透析液3～5次，获得纯净的PGMA纳米球。

(2)于锥形瓶中加入20～50％(v/v)的PGMA纳米球悬浮液，加入50～80％(v/v)浓 度为0.3～1M的硫酸溶液，55～65℃水浴，160～200rpm反应2～5h，打开PGMA纳米球表面 的环氧基；然后用步骤(1)所述透析方法，除去其中过量的硫酸分子，得到纯净的环氧 基被开环的PGMA-OH纳米球。

(3)于锥形瓶中加入20～50％(v/v)的PGMA-OH纳米球悬浮液于锥形瓶中，依次加 入20～30％(v/v)二甲基亚砜，10～15％(v/v)环氧氯丙烷，20～30％(v/v)NaOH(浓度 为0.5～2M)，150～200rpm，20～30℃条件下反应2～4h；反应后通过步骤(1)所述透析方 法除去过量的小分子，并在透析完成后用聚乙二醇20000进行浓缩；获得纯净的表面修饰 有环氧基的PGMA-ECH纳米球。

(4)于锥形瓶中加入20～50％(v/v)的PGMA-ECH纳米球悬浮液，加入0.01～2％(w/w) 多肽抑制剂LWWNSYY，再加入50～80％(v/v)的NaHCO₃(0.1～1M)溶液，20～30℃水 浴，150～200rpm反应10～14h，随后加入NaBH₄(控制终浓度为0.05～1M)反应10～14h。 反应结束后取出，用步骤(1)所述透析方法除去体系里的小分子，用聚乙二醇20000浓 缩，获得粒径80～120nm的纳米血栓抑制剂LPN，纳米血栓抑制剂LPN在透射电镜下呈现 出规整的球形；如图2所示。

具体说明和验证如下：

实施例1：新型纳米血栓抑制剂的制备，如图1所示。

在50mL反应锥形瓶中，加入1mL甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)单体，20μL乙二 醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)，0.5mL浓度为50mM的Na₂CO₃溶液，0.5mL浓度为50mM 的NaHCO₃溶液，1mL浓度为2％(w/w)KPS溶液，55mg十二烷基硫酸钠(SDS)，8mL 过膜去离子水。随后向锥形瓶鼓入氮气，排净溶液中的氧气，持续10min，然后用橡胶指 头套密封瓶口。随后将加有反应物的锥形瓶置于空气浴摇床上，100rpm，25℃条件下乳 化15min。乳化完成后将锥形瓶转移到水浴摇床上，180rpm，70℃条件下反应12h。将反 应结束后的悬液装入透析袋(截留分子量8000-14000)于室温下蒸馏水环境中透析3天，每 天换透析液3次，获得纯净的PGMA纳米球。

取10mL PGMA纳米球悬浮液置于100mL锥形瓶中，加入20mL浓度为0.5M的硫酸溶 液，60℃水浴，180rpm反应3h，打开PGMA纳米球表面的环氧基。然后用前述透析方法， 除去其中过量的硫酸分子，得到纯净的环氧基被开环的PGMA-OH纳米球。

取10mL PGMA-OH纳米球悬浮液转移到100mL锥形瓶中，依次加入10mL二甲基亚 砜，5mL环氧氯丙烷，10mL NaOH(浓度为1M)，170rpm，25℃条件下反应2.5h。反 应后通过前述透析方法除去过量的小分子，并在透析完成后用聚乙二醇20000进行浓缩。 获得纯净的表面修饰有环氧基的PGMA-ECH纳米球。

取5mL PGMA-ECH纳米球悬浮液于25mL锥形瓶中，加入6mg多肽抑制剂 LWWNSYY，再加入10mL NaHCO₃(0.5M)，25℃水浴，170rpm反应12h，随后加入 56.81mg NaBH₄(控制终浓度为0.1M)反应12h。反应结束后取出用透析除去体系里的 小分子，用聚乙二醇20000浓缩，获得纳米血栓抑制剂LPN，纳米血栓抑制剂LPN在透射 电镜下呈现出规整的球形，如图2所示。

实施例2：等温滴定量热实验验证

胶原蛋白片段(GPO)₂GFOGER(GPO)₃(片段包含有整联蛋白α2β1亲和位点GFOGER) 冻干粉末委托强耀生物科技有限公司(上海)进行合成，获得的产品已经高效液相色谱 (HPLC)纯化，纯度>95％。多肽抑制剂LWWNSYY冻干粉末委托吉尔生化有限公司(上海) 进行合成，产品通过高效液相色谱(HPLC)纯化，纯度>95％，纳米抑制剂LPN为实施实例 1所述方法合成。

实验采用美国Microcal公司的型号VP的等温滴定量热仪(ITC)进行等温滴定量热 实验。等温滴定量热实验中，在对多肽抑制剂和胶原蛋白的结合考察中，样品池中滴加浓 度为80μM的胶原蛋白片段，滴定针中加入浓度为1.0mM的多肽抑制剂LWWNSYY。在 纳米抑制剂和胶原蛋白的结合考察中，样品池中滴加浓度为48μM纳米血栓抑制剂LPN (所以实例中，LPN浓度等同于其表面固定的多肽抑制剂浓度)，滴定针中加入浓度为0.6 mM的胶原蛋白片段。所有样品均溶解于生理盐水溶液中，并且在加入样品池/滴定针前经 过20分钟的抽气处理。实验中的具体参数如下：滴定针每滴滴入体积为8μL；一共滴加 30滴；每两滴之间时间间隔为350s；基线设定为20μcal/s；转速设定为307rpm；样品池 温度设定为10℃。滴定针中溶液的稀释焓在后续的数据处理中扣除。通过抑制剂与的胶 原片段的滴定实验获得结合过程的热力学参数。数据利用MicroCal Origin(Version 7.0)和单 一位点结合模型处理，从而获得反应的焓变、熵变、吉布斯自由能变以及解离常数。

实验结果显示，多肽抑制剂由于疏水性过强造成分子多聚，遮蔽了结合位点，与胶原 蛋白呈现出无规律结合，无法获得规律的结合参数。而纳米抑制剂提升了多肽抑制剂的分 散度，结合呈现出一定的规律性，获得的反应焓变ΔH为1.35±0.21kcal/mol，熵变TΔS 为8.44±0.37kcal/mol，二者数值都为正值，表明纳米抑制剂LPN与胶原蛋白的结合由熵 驱动，疏水作用是结合过程的主要驱动力。吉布斯自由能变ΔG值为-7.09±0.16kcal/mol， 表明纳米血栓抑制剂LPN与胶原蛋白能自发结合。解离常数K_d的数值为3.45±1.06μM， 表明二者的结合作用属于强结合。

因此，ITC实验证实纳米抑制剂LPN能有效克服了分子多聚，实现了在生理条件下在 胶原蛋白的表面的规律结合，提升了药物在生理条件下的结合性能，有助于药效的更好发 挥。

实施例3：血小板吸附实验验证

胶原蛋白片段用0.01M醋酸溶解获得浓度为100μg/mL的溶液。在96微量孔板的每 个微量孔板中滴加100μL胶原肽溶液，于18℃条件下温浴4h，使胶原蛋白吸附固定在 微量孔板表面。随后加入100μL浓度为50mg/mL溶于TBS缓冲液(50mM Tris-HCl，140 mM NaCl，2mM MgCl₂，pH 7.4)的牛血清白蛋白(BSA)，于18℃下温浴2h，封闭孔 板上未吸附的结合位点，后用200μL TBS清洗微孔三遍。

在抑制剂的效果考察中，100μL不同浓度的多肽抑制剂LWWNSYY(50、40、30、 25、15、10、5、2、1μg/mL)添加到固定有胶原蛋白的微孔中；或者100μL不同浓度 的纳米抑制剂LPN(40、30、20、10、5、2、1、0.5、0.1μg/mL，以表面的多肽定量)添 加到固定有胶原蛋白的微孔中。反应1h，随后用200μL TBS清洗微孔三遍。

离心获得的血小板重悬于吸附缓冲体系(Adhesion buffer，TBS+0.1％BSA+2mM MgCl₂，pH 7.4)中；100μL血小板重悬液滴加到固定有胶原肽的微孔中，于18℃下温 浴1h后，用200μL TBS清洗微孔三遍，除去未吸附的血小板。

150μL细胞溶解液{Lysis buffer，0.1M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 5.4)，包含0.1％ (w/w)Triton X-100，1mg/mL磷酸对硝基苯脂(PNPP)}加入到吸附有血小板的微孔中， 于18℃下反应1h后，加入100μL 3M的NaOH终止反应，检测405nm的吸光值。

实验结果表明，当抑制剂达到一定浓度时，血小板吸附都会被完全抑制，说明纳米抑 制剂和多肽抑制剂都有着一定的血小板吸附抑制效果。其中，纳米抑制剂一半抑制的有效 浓度IC₅₀(1.83±0.29μg/mL)约为多肽抑制剂IC₅₀(5.66±1.13μg/mL)三分之一，说明 纳米抑制剂的作用效率比多肽抑制剂有着三倍的提升，有着更好的血小板吸附的抑制效 果。

实施例4：动物血栓模型验证

无特定病原体(Specefic Pathogen Free，SPF)级别Wistar种大鼠20只，体重180-220 g，购于北京华阜康生物科技股份有限公司，合格证号：SLXK(京)2012-0005。屏障动物 房饲养，温度20-25℃，相对湿度40-60％，每笼5只，自由饮食，每日更换垫料。动物购 入后检疫与驯化饲养2天，使其适应新环境并剔除不健康动物。检疫期动物编号，检疫结 束后按检疫号随机分组。实验前动物禁食12h，不禁水。

大鼠腹腔注射10％水合氯醛(0.3mL/100g)麻醉后取仰卧位置于37℃平板上，于颈 部正中线做直线切口，暴露右侧颈总动脉，并在动脉下垫塑料薄膜保护周围组织。取滤纸， 裁成2.5cm*0.8cm大小，用12％FeCl₃溶液50μL浸润的滤纸包被暴露的动脉，诱导大鼠 形成颈总动脉急性血栓模型。实验组于FeCl₃诱导前15min尾静脉注射抑制剂(多肽抑制 剂LWWNSYY或者纳米抑制剂LPN，给药剂量都为0.625mg/kg)，空白对照组注射等体 积生理盐水。诱导血栓形成30min后将包含血栓的血管上下两端结扎，剪断后用小镊子轻 轻将血管内血栓取出，放在离心管中称重，记录下血栓湿重数据，以衡量血栓形成的严重 程度。

表1大鼠体内30min形成血栓质量

空白对照组(生理盐水)血栓重量为7.41±1.75mg。多肽抑制剂组(LWWNSYY)血 栓重量为4.40±0.50mg，相对于空白对照组下降了约40％，下降程度显著(p<0.01)。纳 米抑制剂组(LPN)形成的血栓最小，重量为3.70±0.45mg，相对于空白对照组下降了约 50％，下降程度显著(p<0.01)，相对多肽抑制剂组下降15％，下降程度显著(p<0.05)。

综上，实验结果说明两种抑制剂都能有效的阻隔整联蛋白α2β1与胶原蛋白的结合， 从而抑制后续的血栓形成，减小血栓形成的大小，其中纳米抑制剂LPN抑制效果更加显著， 说明将多肽抑制剂固定在PGMA纳米颗粒表面获得纳米抑制剂LPN，改善了药物的水溶 性和分散度，使得纳米抑制剂LPN相对原有的多肽抑制剂有着更好的药物作用效率，是一 种更高效的血栓抑制剂。

本发明提出针对血栓形成过程中胶原蛋白-整联蛋白α2β1相互作用的纳米抑制剂及制 备方法和应用，并通过热力学实验、血小板吸附抑制实验以及大鼠体内血栓实验考察纳米 抑制剂LPN对血栓形成的抑制效果，已通过现场较佳实施例子进行描述，相关技术人员明 显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组 合，来实现本发明技术。特别需要指出的是，所有相类似的替代和改动对本领域技术人 员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。