含唾液酸糖基萘酰亚胺类化合物及其在流感病毒检测中的应用

技术领域

本发明涉及一种含糖基的萘酰亚胺类化合物及其用途，具体地说，涉及一种含唾液酸糖 基的萘酰亚胺类化合物及其在流感病毒检测中的应用。

背景技术

禽流感病毒通常只感染鸟类，但由于病毒变异，使禽流感病毒跨种传播从而感染人、畜 以及其它动物。至今发现能直接感染人的禽流感病毒亚型有：H5N1、H7N1、H7N2、H7N3、 H7N7、H9N2、H7N9和H10N8等。由于禽流感病毒感染人后，发病急、病程短、致死率高， 因此该类病毒对人类生命健康造成巨大危害。历史上禽流感病毒曾引起多次全球性的大流行， 导致无数人员死亡和严重的经济损失。例如，1997年香港爆发的H5N1流感流行，2013在中 国南方爆发的H7N9流感流行，不仅对人类公共卫生安全造成严重威胁，而且对社会经济产 生重大影响。因此，构建对禽流感病毒快速、便捷、经济化的新型检测方法，对于预防和控 制大面积禽流感流行具有极其重要的社会意义和经济价值。

目前针对禽流感病毒的诊断方法主要有酶联免疫吸附试验法、中和抗体检测、聚合酶链 反应法等。虽然此类方法具有较高的灵敏度，然而其设备昂贵，操作繁琐，不易普及应用。 因此，发展一种可有效应用于禽流感病毒简单、快速、准确检测的新方法是目前国际上亟待 解决的科学难题。

发明内容

本发明的发明人经广泛及深入的研究，设计并合成了两种基于糖基萘酰亚胺的荧光探针 化合物。经实验发现：通过荧光光谱法，所述式Ⅰ糖基萘酰亚胺类化合物可以灵敏检测出禽 流感病毒(如H5N1、H7N9或H10N8等)的存在，所述式Ⅱ糖基萘酰亚胺类化合物可以灵 敏检测出人流感病毒(H1N1或H3N2)等的存在。即在病毒的存在下，相应探针可发生一种 “折叠—解折叠”过程，促使其在540nm波长处的荧光随病毒滴度的增加而显著增强。此外， 探针可用于评估上述禽流感病毒在人群中大面积传播的风险。因此，本发明所述糖基萘酰亚 胺化合物可作为检测禽流感病毒的一类新型荧光探针。

本发明的一个目的在于，提供一类含糖基的萘酰亚胺类化合物。

本发明所述萘酰亚胺类化合物为式Ⅰ或Ⅱ所示化合物，或其在药理学上可接受的盐：

本发明的另一个目的在于，揭示上述含糖基的萘酰亚胺类化合物的一种用途，即式Ⅰ或 Ⅱ所示化合物，或其在药理学上可接受的盐作为检测禽流感病毒或人流感病毒的荧光探针的 应用。或者说，式Ⅰ或Ⅱ所示化合物，或其在药理学上可接受的盐在制备检测禽流感病毒或 人流感病毒的荧光探针中的应用。

附图说明

图1为随不同禽流感病毒H5N1浓度，化合物Ⅰ的荧光光谱变化曲线；

图2为随不同禽流感病毒H7N9浓度，化合物Ⅰ的荧光光谱变化曲线；

图3为随不同禽流感病毒H10N8浓度，化合物Ⅰ的荧光光谱变化曲线；

图4为随不同病毒颗粒与化合物Ⅰ反应后的荧光增强程度(F/F₀)柱状图；

图5为随不同人流感病毒H3N2浓度，化合物II的荧光光谱变化曲线；

图6为随不同人流感病毒H1N1浓度，化合物II的荧光光谱变化曲线；

图7为随不同病毒颗粒与化合物II反应后的荧光增强程度(F/F₀)柱状图。

具体实施方式

通过实施例及说明书附图对本发明作进一步阐述。

实施例1

式I和式II所示化合物(简记为化合物I和化合物II，下同)的制备：

合成式I和式II所示化合物的路线如下

(1)化合物IV的制备：

将化合物III(638mg,1.6mmol)溶于15mL的N,N-二甲基甲酰胺中，缓慢加入叠氮钠 (312mg,4.8mmol)，反应体系升温至60℃，TLC检测反应完全后，减压蒸馏除去溶剂，并 用硅胶柱分离，得450mg黄色固体(化合物IV)，产率81％。

其中，化合物III的合成步骤参见A.Pain,S.Samanta,S.Dutta,A.K.Saxena,M. Shanmugavel,H.Kampasi,G.N.Quazi,U.Sanyal,Acta Poloniae Pharmaceutica,2003,60, 285-291。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.68(d,J＝7.3Hz,1H),8.61(d,J＝8.5Hz,1H),8.44(d,J＝ 7.9Hz,1H),8.06(d,J＝7.9Hz,1H),7.87(t,J＝7.9Hz,1H),4.61(t,J＝7.1Hz,2H),3.67(t,J＝ 7.1Hz,2H).

(2)化合物V的制备：

将化合物IV(431mg,1.25mmol)溶于20mL的乙二醇单甲醚中，缓慢滴加乙二胺(0.2mL, 2.5mmol)的，反应体系升温至90℃，TLC检测反应完全后，减压蒸馏除去溶剂，并用硅胶 柱分离，得319mg红色色固体(化合物V)，产率79％。

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO)δ8.73(d,J＝8.4Hz,1H),8.48-8.44(m,1H),8.29(d,J＝8.6 Hz,1H),7.71(dd,J＝8.3,7.4Hz,1H),6.83(t,J＝7.2Hz,1H),4.27(t,J＝6.1Hz,2H),3.59(t,J＝ 6.1Hz,4H),2.95(t,J＝6.4Hz,2H).

HR-ESI-MS:m/z[M+H]⁺calcd for C₁₆H₁₇N₆O₂325.1408,found 325.1419.

(3)化合物VI的制备：

将1-芘丁酸(558mg,1.72mmol)溶于40mL的二氯甲烷中，在0℃条件下加入EDC(989 mg,5.16mmol)和HOBt(348mg,2.58mmol)，1h后加入化合物V(500mg,1.72mmol)， 反应体系升温至室温，TLC检测反应完全后，减压蒸馏除去溶剂，并用硅胶柱分离，得671mg 黄色固体(化合物VI)，产率65％。

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO)δ8.59(d,J＝7.6Hz,1H),8.34(d,J＝6.5Hz,1H),8.26(dd,J ＝14.9,7.4Hz,3H),8.17(d,J＝7.8Hz,2H),8.13-8.10(m,2H),8.05(t,J＝7.6Hz,1H),7.86(d,J ＝7.8Hz,1H),7.65-7.58(m,1H),6.86(d,J＝8.7Hz,1H),4.20(t,J＝6.0Hz,2H),3.52(dd,J＝ 20.9,14.7Hz,5H),3.26-3.19(m,2H),2.26(d,J＝7.1Hz,2H),2.00(d,J＝7.3Hz,3H).

HR-ESI-MS:m/z[M+H]⁺calcd for C₃₆H₃₁N₆O₃595.2452,found 595.2457.

(4)化合物VII的制备：

将化合物VI(390mg,0.656mmol)和化合物N-Boc-O-炔丙基羟氨(112mg,0.656mmol) 溶于20mL的二氯甲烷(滴加少量H₂O)中，加入五水硫酸铜(329mg,1.31mmol)和抗坏 血酸钠(524mg,2.62mmol)，TLC检测反应完全后，减压蒸馏除去溶剂，并用硅胶柱分离， 得426mg黄色固体(化合物VII)，产率85％。

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO)δ8.59(d,J＝7.6Hz,1H),8.34(d,J＝6.5Hz,1H),8.26(dd,J ＝14.9,7.4Hz,3H),8.17(d,J＝7.8Hz,2H),8.13-8.10(m,2H),8.05(t,J＝7.6Hz,1H),7.86(d,J ＝7.8Hz,1H),7.62(s,1H),7.60-7.58(m,1H),6.86(d,J＝8.7Hz,1H),4.20(t,J＝6.0Hz,4H), 3.52(dd,J＝20.9,14.7Hz,5H),3.26-3.19(m,2H),2.26(d,J＝7.1Hz,2H),2.00(d,J＝7.3Hz, 3H),1.67(s,9H).

HR-ESI-MS:m/z[M+H]⁺calcd for C₄₄H₄₄N₇O₆766.3353,found 766.3353.

(5)化合物VIII的制备：

将化合物VII(50mg,0.066mmol)溶于10mL的二氯甲烷中，在0℃条件下缓慢滴加4 mL三氟乙酸，TLC检测反应完全后，减压蒸馏除去溶剂，并用硅胶柱分离，得37mg黄色 固体(化合物VIII)，产率86％。

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO)δ8.59(d,J＝7.6Hz,1H),8.34(d,J＝6.5Hz,1H),8.26(dd,J ＝14.9,7.4Hz,3H),8.17(d,J＝7.8Hz,2H),8.13-8.10(m,2H),8.05(t,J＝7.6Hz,1H),7.86(d,J ＝7.8Hz,1H),7.62(s,1H),7.60-7.58(m,1H),6.86(d,J＝8.7Hz,1H),4.20(t,J＝6.0Hz,4H), 3.52(dd,J＝20.9,14.7Hz,5H),3.26-3.19(m,2H),2.26(d,J＝7.1Hz,2H),2.00(d,J＝7.3Hz, 3H).

HR-ESI-MS:m/z[M+H]⁺calcd for C₃₉H₃₆N₇O₄666.2823,found 666.2832.

(6)化合物I的制备：

将化合物VIII(20mg,0.03mmol)和3’-Sialylactose(38mg,0.06mmol)溶于12mL的 乙腈/水(2/1,v/v)的溶剂体系中，缓慢滴入无水醋酸(0.3mL,0.45mmol)和苯胺(0.15mL, 0.15mmol)，TLC检测反应完全后，减压蒸馏除去溶剂，并用硅胶柱分离，得32mg黄色固 体(化合物I)，产率84％。

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO)δ8.59(d,J＝8.3Hz,1H),8.32-8.23(m,5H),8.18-8.03(m, 7H),7.87(d,J＝7.9Hz,2H),7.62(s,1H),6.87(d,J＝8.8Hz,1H),5.41(d,J＝9.1Hz,2H),5.33 (d,J＝5.1Hz,1H),5.22(s,2H),4.94(d,J＝5.7Hz,2H),4.67(d,J＝5.6Hz,2H),4.57-4.50(m, 2H),4.36(d,J＝8.2Hz,1H),3.94(d,J＝5.8Hz,2H),3.67(d,J＝17.2Hz,4H),3.56-3.40(m, 10H),3.29-3.16(m,4H),2.67(s,1H),2.27(d,J＝6.8Hz,3H),2.02(s,3H),1.95(s,2H)；

HR-ESI-MS:m/z[M+H]⁺calcd for C₆₂H₇₂N₈O₂₂:1281.4845,found:1281.4849.

(7)化合物II的制备：

将化合物VIII(20mg,0.03mmol)和6’-Sialylactose(38mg,0.06mmol)溶于12mL的 乙腈/水(2/1,v/v)的溶剂体系中，缓慢滴入无水醋酸(0.3mL,0.45mmol)和苯胺(0.15mL, 0.15mmol)，TLC检测反应完全后，减压蒸馏除去溶剂，并用硅胶柱分离，得30mg黄色固 体(化合物II)，产率80％。

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO)δ8.59(d,J＝8.3Hz,1H),8.32-8.22(m,5H),8.18-8.04(m, 7H),7.87(d,J＝7.9Hz,2H),7.62(s,1H),6.87(d,J＝8.8Hz,1H),5.41(d,J＝9.1Hz,2H),5.33 (d,J＝5.1Hz,1H),5.22(s,2H),4.94(d,J＝5.7Hz,1H),4.67(d,J＝5.6Hz,2H),4.57-4.50(m, 2H),4.36(d,J＝8.2Hz,1H),3.94(d,J＝5.8Hz,2H),3.67(d,J＝17.2Hz,4H),3.54-3.40(m, 10H),3.29-3.18(m,4H),2.67(s,1H),2.27(d,J＝6.8Hz,3H),1.98(d,J＝28.9Hz,3H),1.95(s, 2H)；

HR-ESI-MS:m/z[M+H]⁺calcd for C₆₂H₇₂N₈O₂₂:1281.4845,found:1281.4849.

实施例2

将实施例1中制备的化合物Ⅰ和化合物II在检测禽流感病毒中的应用，

其具体操作方法及结果如下：

向1cm×1cm×4cm的比色皿中依次加入1mL PBS缓冲溶液，1μL 5mM化合物Ⅰ的 DMSO溶液，制备浓度为5μM的化合物Ⅰ溶液。依次向上述溶液中加入浓度梯度上升的 H5N1、H7N9和H10N8的PBS溶液，并测定其荧光光谱曲线(图1、图2和图3)。从图1、 图2和图3可以看出，随着体系中流感病毒浓度滴度的增加，540nm处的荧光发射峰均逐渐 上升，荧光光谱呈现一种“增强式”的变化。

分别向上述浓度为5μM的化合物Ⅰ溶液中加入相同浓度的H1N1、H3N2、H5N1、H7N9 和H10N8的PBS溶液，并测定其荧光光谱曲线(图4)。从图4可以看出，化合物Ⅰ只对主 要结合Neu5Aca2,3Gal受体的禽流感病毒H5N1、H7N9和H10N8有“增强式”响应，而对主 要结合Neu5Aca2,6Gal受体的人流感病毒H1N1和H3N2等均无明显响应，说明探针Ⅰ对禽 流感病毒具备高选择性。

向1cm×1cm×4cm的比色皿中依次加入1mL PBS缓冲溶液，1μL 5mM化合物II的 DMSO溶液，制备浓度为5μM的化合物II溶液。依次向上述溶液中加入浓度梯度上升的H1N1 和H3N2的PBS溶液，并测定其荧光光谱曲线(图5和图6)。从图5和图6可以看出，随着 体系中流感病毒浓度滴度的增加，540nm处的荧光发射峰均逐渐上升，荧光光谱呈现一种“增 强式”的变化。

分别向上述浓度为5μM的化合物II溶液中加入相同浓度的H1N1、H3N2、H5N1、H7N9 和H10N8的PBS溶液，并测定其荧光光谱曲线(图7)。从图7可以看出，化合物Ⅰ对可以 结合Neu5Aca2,6Gal受体的H1N1、H3N2和H7N9病毒有“增强式”响应，而对只结合 Neu5Aca2,3Gal受体的H5N1和H10N8病毒等均无明显响应，说明探针II对可结合 Neu5Aca2,6Gal受体的流感病毒具备高选择性，可进一步用于评估流感病毒在人群中大面积 传播的风险。