与辣椒抗根结线虫基因Me1紧密连锁的分子标记、及其SSR引物和应用

技术领域

本发明涉及分子标记领域，具体涉及与辣椒抗根结线虫基因Me1紧密连锁的分 子标记、及其SSR引物和应用。

背景技术

根结线虫严重危害辣椒，根结线虫主要危害我国南方的辣椒生产，但近年来随 着北方保护地生产面积的增加、复种指数的提高、连作重茬现象普遍，使得线虫病 害向北方地区迅速蔓延。根结线虫引起的农作物损失中90％以上都是由南方根结线 虫(M.incognita)、花生根结线虫(M.arenaria)、爪哇根结线虫(M.javanica)及北方根结 线虫(M.hapla)四个最常见种引起的，以南方根结线虫危害最重。辣椒根结线虫防治 化学防治容易污染环境、物理防治高耗能并效果不明显。因此培育抗病品种是防治 线虫的一种有效的方法。利用传统的育种方法一般容易受环境影响、选择效率低。 开发与抗病基因连锁的分子标记，利用分子标记辅助选择育种是近年发展起来的高 效育种手段。目前，在辣椒上已经发现并且命名的抗线虫的基因至少有6个，基因n， Me1，Me2，Me3，Me4，Me5，均为显性单基因控制，其中Me3与Me4连锁，Me3 对温度稳定。

Me3与Me4的分子遗传定位已完成，将其定位到同一条染色体上，相差9.9cM， 并开发了一个与紧密连锁的AFLP标记，与之间的遗传距离仅2.7±1.7cM。基因Me1 的分子遗传定位还没有报道，因为Me1基因发现较早，抗病性强(接近免疫)，因此 对该基因的分子标记的研究和利用更有意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种与辣椒抗根结线虫基因Me1紧密连锁的分子标记。

本发明的再一目的是提供用于鉴定辣椒根结线虫抗性的SSR引物对。

根据本发明的可用于辅助抗根结线虫Me1基因选择的分子标记通过以下步骤获 得：

本发明以辣椒抗病品种DH330(Me1)和感病品种0516及其构建的BC1群体为 试验材料，研究辅助辣椒根结线虫抗基因Me1选择的分子标记。利用SNP标记筛选与 Me1基因连锁的分子标记，利用连锁最紧密的两侧SNP标记对应的unigene比对到辣 椒CM334和Zunla基因组信息9号染色体上 (http://passport.pepper.snu.ac.kr/？t＝PGENOME/； http://peppersequence.genomics.cn/page/species/index.jsp)，获取两标记之间的DNA序 列并利用其开发SSR标记，共开发233对SSR引物，经过初筛，其中6对在双亲及群 体中表现多态性。通过与BC1群体抗根结线虫的表型对应，将目标基因定位在SSR 标记24-20和ZY6-13之间0.21Mb(物理区间250.08～250.29Mb)，遗传距离分别为 1.825和0.753cM。利用这两对分子标记在新的BC1群体中进行抗根结线虫鉴定，可 以有效地用来辅助育种工作。

SSR标记24-20在材料中DH330(Me1)扩增片段大小225bp，在感病材料0516 以及分离群体的感病材料中的大小为210bp。

SSR标记ZY6-13在材料中DH330(Me1)扩增片段大小175bp，在感病材料 0516以及分离群体的感病材料中的大小为181bp。

本申请的用于特异性筛选辣椒根结线虫抗性的SSR引物，其信息如下所示。

本发明的优点是不通过抗病性鉴定，只是在苗期对辣椒植株的DNA检测，就可 以判断辣椒对于根结线虫。可以广泛应用到分子标记辅助育种。

本发明提供了分子标记24-20和ZY6-13在辣椒根结线虫抗性鉴定中的应用。

本发明提供了分子标记24-20和ZY6-13在辣椒分子标记辅助育种中的应用。

本发明提供的分子标记实现了在苗期对辣椒植株抗根结线虫鉴定，大大缩短了 育种时间，节约了人力物力。通过利用本发明提供的特异性引物采用PCR和凝胶电 泳技术检测待测辣椒基因组DNA：扩增SSR标记24-20，在辣椒感病亲本和未发生 重组感病单株中扩增出210bp的条带，在抗病亲本中及未发生重组抗病单株中扩增 225bp的条带；扩增SSR标记ZY6-13，在辣椒感病亲本和未发生重组感病单株中扩 增出181bp的条带，在抗病亲本中及未发生重组抗病单株中扩增175bp的条带。通 过这两个分子标记可对辣椒根结线虫抗性进行鉴定，提高了育种效率。相比较国内 外已发现的其它分子标记，本发明的分子标记24-20和ZY6-13与辣椒抗根结线虫基 因Me1紧密连锁，遗传距离分别为1.825和0.753cM，在辣椒抗根结线虫育种中有 重要意义。

附图说明

图1显示五个SSR标记在BC1群体部分单株扩增结果。(a)R24，(b)S7，(c)S24， (d)24-20，(e)28-1。注：M：50bp marker；S：与感病亲本条带相同；H：含有感病 和抗病亲本条带。

图2显示SSR标记与Me1基因连锁关系。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背 离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均 属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本发明以辣椒抗病品种DH330(Me1)和感病品种0516及其F1同0516回交构 建的BC1群体。

实施例1根结线虫品种鉴定以及与Me1基因紧密连锁的分子标记24-20和 ZY6-13的获得

1、辣椒抗性鉴定遗传群体构建

以含有南方根结线虫抗性基因Me1的材料辣椒品系DH330(Capsicum annuum  L.)(法国农科院A Palloix提供)及感病材料甜椒自交系0516(Capsicum annuum L.) (中国农业科学院蔬菜花卉研究所育成)为双亲，杂交后获得F1，F1与0516回交 获得的BC1为作图群体，共1679个单株。

2、基因组DNA的提取

用CTAB法提取BC1所有单株、亲本及F1的基因组DNA，用Biospec-nano微 量分光光度计测定浓度和质量，将浓度稀释至5ng/μl。

3、BC1群体抗性鉴定

植株5-6叶期进行苗期接种，所有植株浇透水，待水沥干，在植株根系2cm附近 打孔，用移液枪注入1mL线虫悬浮液。生长期控水控温，不宜过干过湿，温度控制 在18-28℃。60d后，用清水小心地洗净根系，注意不洗掉卵块，装入自封袋4℃保存。 用伊红黄(0.1g/L)染根系10min左右(Roberts et al.1990)，洗去浮色后数卵块数(EM, egg mass)。EM>5为感病株(S)，EM≤5为抗病株(R)(鉴定方法的来源)。结果统 计两次。DH330、0516、F₁及BC1最终鉴定株数分别为：40、34、40、1583株。根 据抗感标准，抗病亲本DH330及F₁抗病率100％，且卵块数均为0；亲本0516全部 表现为感病；BC1抗感比1.04:1，χ²＝0.495<3.84，符合显性基因1:1理论分离比。

4、SSR标记开发

利用SNP标记筛选与Me1基因连锁的分子标记，利用连锁最紧密的两侧SNP标记 对应的unigene比对到辣椒CM334和Zunla基因组信息9号染色体上 (http://passport.pepper.snu.ac.kr/？t＝PGENOME/； http://peppersequence.genomics.cn/page/species/index.jsp)，获取两标记之间的DNA序 列并利用其开发SSR标记，设置参数：2～6个碱基重复，二核苷酸重复次数不少于7 次，三、四核苷酸重复不少于5次，五、六核苷酸重复次数最少4次。选择上述简 单重复序列，截取重复序列上下游各150bp片段，根据引物设计原则用Primer 3input (http://primer3.ut.ee/)设计引物，引物扩增片段80-270bp。

5、SSR连锁标记筛选

以亲本DNA为模板，对SSR引物进行多态性筛选，共筛选到6对具有多态性 的标记，再以筛选到的多态性的标记对BC1群体进行分析，这6对引物均与Me1基 因连锁。其中标记24-20和ZY6-13是与辣椒抗根结线虫Me1基因连锁最紧密的位于 基因两侧的分子标记。

PCR扩增体系(10μL)：DNA(5ng/μL)4μL，10x Green Mix 5μL，上游引物 (10μM/μL)0.5μL，下游引物(10μM/μL)0.5μL。

PCR扩增程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s， 72℃延伸1min，共32个循环；72℃延伸8min；16℃保存。

SSR产物检测采用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。

实施例2分子标记24-20和ZY6-13的应用

利用已开发的分子标记24-20和ZY6-13在以辣椒DH330和0516为亲本构建的 F2群体中进行抗性鉴定，共鉴定298个单株，抗感表型比符合3：1分离比，利用分 子标记24-20和ZY6-13分别进行鉴定，分子数据与表型鉴定数据吻合，两个标记分 别检测出6个和2个重组单株。

分子标记24-20和ZY6-13鉴定根结线虫抗性的方法为：

(1)提取待检测F2群体单株的DNA；

(2)对F2群体接种南方根结线虫；

(3)以提取的DNA为模板，利用标记24-20和ZY6-13PCR扩增条带；

(4)聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物；根据产物条带大小判断基因型。

PCR扩增体系(10μL)：DNA(5ng/μL)4μL，10x Green Mix 5μL，上游引物 (10μM/μL)0.5μL，下游引物(10μM/μL)0.5μL。

PCR扩增程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s， 72℃延伸1min，共32个循环；72℃延伸8min；16℃保存。