同时预防新孢子虫和弓形虫感染的疫苗及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及寄生虫病疫苗基因工程技术领域，提供一种同时预防新孢子虫和弓形虫感染的疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

新孢子虫病和弓形虫病是严重危害养殖业健康发展和人类身心健康的主要寄生虫病，目前尚无有效的药物和疫苗防控。

新孢子虫病是由犬新孢子虫(Neospora caninum)寄生于犬、牛、羊等多种哺乳动物细胞内而引起的一种原虫病，该病主要引起母畜流产、死胎或新生儿运动障碍和神经系统疾病。犬是新孢子虫的终末宿主，多种哺乳动物都可以作为中间宿主，它的寄生部位是中枢神经系统、脑、肝、肌肉及其它内脏组织。国外对新孢子虫的研究已取得了一定进展，而国内对新孢子虫的研究尚属起步阶段。

弓形虫病是由刚地弓形虫(Toxophasma gondii)引起的人畜共患病。该病多呈隐性感染，主要侵犯眼、脑、心、肝、淋巴结等，虫体可通过胎盘感染胎儿，引起孕畜早产、流产、畸形胎等，严重危害人类及养殖业的健康发展。

新孢子虫与弓形虫是亲缘关系相近的细胞内寄生性原虫，二者在形态结构、分子生物学特征以及发病的临床症状和病理变化等方面都很相似。AMA1顶端膜抗原定位于微线体，是新孢子虫和弓形虫的速殖子期和缓殖子期表达蛋白，与虫体侵入宿主细胞和自身复制的功能密切相关。AMA1是新孢子虫和弓形虫一个潜在的共同候选疫苗抗原，可用来控制新孢子虫和弓形虫的入侵。

对于新孢子虫疫苗的研究大多采用传统方法，如利用新孢子虫表面抗原蛋白基因制备重组蛋白亚单位疫苗，或利用真核表达载体制备核酸疫苗等，而制备的亚单位疫苗或核酸疫苗均存在免疫效果不佳、保护率低下等问题， 尚不能用于新孢子虫病的有效防控；而对弓形虫疫苗的研究虽然取得了一定进展，但疫苗的免疫效果也均不理想。并且，国内外尚无同时预防新孢子虫和弓形虫疫苗的问世，也未见同时预防新孢子虫和弓形虫重组腺病毒载体疫苗的相关报道。

发明内容

本发明是鉴于现有技术中存在的上述问题而做出的，其目的是提供一种能够同时预防新孢子虫和弓形虫感染的疫苗，该疫苗为重组腺病毒载体疫苗，可用于同时预防新孢子虫和弓形虫的感染。

本发明的另一目的是提供一种编码上述疫苗抗原的核苷酸序列。

本发明的再一目的是提供一种上述疫苗的制备方法。

本发明的又一目的是提供抗原的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2及SEQ.ID.NO.4在制备用于预防新孢子虫和弓形虫感染的疫苗中用途。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种同时预防新孢子虫和弓形虫感染的疫苗，该疫苗抗原的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2及SEQ.ID.NO.4所示。

进一步地，所述疫苗抗原通过腺病毒载体进行表达。

进一步地，所述腺病毒载体为pCR259、HighQ-1Transpose-Ad^TM294和HighQ-1^TM。

一种编码上述疫苗抗原的核苷酸序列，该核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1及SEQ.ID.NO.3所示。

一种制备同时预防新孢子虫和弓形虫感染的疫苗的方法，包括：

a.引物设计，根据新孢子虫(AB265823.1)AMA1基因序列和弓形虫(AF010264.1)AMA1基因序列的开放阅读框，设计新孢子虫和弓形虫交叉抗原AMA1基因的通用引物P1、P2，所述引物P1、P2为：

P1：5’-CCGCTCGAGGCCACCATGAGCAAAATCAAGGCGAGTA-3’

P2：5’-CTAGTCTAGATTAAGAATCCGAAACCAGGCA-3’；

b.扩增与克隆，分别以新孢子虫基因组DNA和弓形虫基因组DNA为模板，以P1和P2为引物，对AMA1基因进行PCR扩增，将PCR扩增产物克隆于pMD18-T Simple Vector得到pMD18-T-Nc/TgAMA1重组克隆质粒， 进行PCR鉴定、酶切鉴定及测序分析；

c.亚克隆，将Nc/Tg AMA1基因亚克隆至pCR259腺病毒穿梭载体，构建重组腺病毒穿梭质粒pCR259-Nc/Tg AMA1；

d.转化，依次转化HighQ-1Transpose-Ad^TM294和HighQ-1^TM感受态细胞，构建重组腺病毒表达质粒H294-Nc/Tg AMA1；

e.转染，采用脂质体介导转染法转染QBI-HEK293细胞包装重组腺病毒Ad5-Nc/TgAMA1，检测AMA1基因在QBI-HEK293细胞中的表达；以及

f.疫苗制备，扩增，纯化以制备所述疫苗。

进一步地，所述新孢子虫的扩增基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，所述弓形虫的扩增基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示。

进一步地，所述PCR扩增的反应体系为25μL：10ⅹBuffer 2.5μL、dNTP2μL、上下游引物各1μL、模板DNA 2μL、Taq酶0.25μL以及灭菌去离子水16.25μL；所述PCR扩增的反应条件为：95℃预变性5min，94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸7min，4℃保存。

进一步地，所述引物P1含有XhoI酶切位点，所述引物P2含有XbaI酶切位点。 

本发明的同时预防新孢子虫和弓形虫感染的疫苗的制备方法，根据新孢子虫(AB265823.1)AMA1基因序列和弓形虫(AF010264.1)AMA1基因序列的开放阅读框，设计新孢子虫和弓形虫交叉抗原AMA1基因的通用引物，构建pMD18-T-Nc/TgAMA1重组克隆质粒、重组腺病毒穿梭质粒pCR259-Nc/TgAMA1及表达质粒H294-Nc/TgAMA1，脂质体介导转染至QBI-HEK293细胞包装Ad5-Nc/TgAMA1重组腺病毒，测定病毒滴度后扩增、纯化制备Ad5-Nc/Tg AMA1重组腺病毒载体疫苗。

本发明的疫苗能够诱导免疫动物产生强烈的免疫应答反应，可应用于同时预防新孢子虫和弓形虫的感染，该疫苗还可应用于用于同时预防新孢子虫和弓形虫的感染的药剂中。抗原的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2及SEQ.ID.NO.4可应用于制备用于预防新孢子虫和弓形虫感染的疫苗中。

有益效果

本发明的同时预防新孢子虫和弓形虫感染的重组腺病毒载体疫苗，经动物免疫试验和攻虫试验证实，能够诱导免疫动物产生强烈的免疫应答反应， 对新孢子虫和弓形虫攻击具有良好免疫保护作用，从而可以达到同时预防新孢子虫和弓形虫的目的。

本发明应用的腺病毒载体转基因效率高，可以有效地将外源基因表达成具有活性的蛋白；可转导不同类型的组织细胞，不受靶细胞是否为分裂细胞所限；容易制得高滴度病毒载体；进入细胞内并不整合到宿主细胞基因组，仅瞬间表达，安全性高。

附图说明

为使本发明的具体实施方式的描述更加清楚，下面对具体实施方式中使用的附图进行说明。

图1为新孢子虫AMA1基因和弓形虫AMA1基因的PCR扩增产物的电泳图，其中，M泳道代表DL2000DNA marker，1泳道代表PCR扩增新孢子虫产物；2泳道代表PCR扩增弓形虫产物；3泳道代表PCR扩增水对照。

图2为包装重组腺病毒Ad5-Nc/TgAMA1的QBI-HEK293细胞图。

图3为攻击新孢子虫各免疫组及对照组BABL/c小鼠存活率图。

图4为攻击弓形虫各免疫组及对照组BABL/c小鼠存活率图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明进行详述。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但不是对本发明保护范围的限定。下述实施例中的实验方法如无特别说明均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特别说明均为常规市售生化试剂。

本发明中的实验材料来源：

新孢子虫：由延边大学预防兽医学实验室从延边地区流产牛脑组织分离获得，并由延边大学预防兽医学实验室保存，关于该分离方法，申请人在申请号为201410550101.6、发明名称为犬新孢子虫的分离方法和体外培养方法的已公开专利申请文件中已详细描述，上述申请文件的全部内容引入于此作为参考。新孢子虫基因组DNA由延边大学预防兽医学实验室提取。

弓形虫RH株：由日本带广畜产大学原虫病研究中心玄学南教授惠赠， 弓形虫基因组DNA由延边大学预防兽医学实验室提取。

限制性内切酶Xho I、Xha I购自：宝生物(大连)生物工程公司。

pMD18-T Simple Vector购自：宝生物(大连)生物工程公司。

pCR259腺病毒穿梭载体购自：Qbiogene,US。

HighQ-1Transpose-Ad^TM294和HighQ-1^TM感受态细胞购自：Qbiogene,US。

QBI-HEK293细胞购自：Qbiogene,US。

BALB/c小鼠由延边大学预防兽医学实验室提供。

第一实施例 

本发明的同时预防新孢子虫和弓形虫感染的疫苗，该疫苗抗原的氨基酸序列为：

MSKIKASTELGKCAEFAYKTTAMDKSNQATQYRYPFVYDSKRRLCYILSVSMQRMEGSKYCSTNDDPVNLTWYCFEPQKSPTANHNLIFGSAYVGKDPDAFLTKCPNQALKGYRFGHWTNGRCHDYTELADSWIEAVDSKAQCWVKTFTNDEVASDQPRTYPLTSQHSWNDWWPVHEKDQPHSGGDGRNYGFFYFDSNGKGKCALSHKAPDCLVSDS(SEQ.ID.NO.2)；以及

MSKIKASTDLGRCAEFAFKTVAMDKNNKATKYRYPFVYDSKKRLCHILYVSMQLMEGKKYCSVKGEPPDLTWYCFKPRKSVTENHHLIYGSAYVGENPDAFISKCPNQALRGYRFGVWKKGRCLDYTELTDTVIERVESKAQCWVKTFENDGVASDQPHTYPLTSQASWNDWWPLHQSDQPHSGGVGRNYGFYYVDTTGEGKCALSDQVPDCLVSDS(SEQ.ID.NO.4)。

编码上述疫苗抗原的核苷酸序列为：

CCGCTCGAGGCCACCATGAGCAAAATCAAGGCGAGTACAGAGCTTGGGAAGTGCGCCGAATTCGCCTACAAGACGACTGCTATGGATAAAAGCAATCAGGCGACTCAGTACCGCTATCCATTTGTGTATGACTCTAAGCGGCGGCTGTGTTACATCCTTTCCGTATCGATGCAGCGAATGGAGGGCAGTAAGTACTGTTCTACCAACGATGACCCGGTTAATCTCACATGGTATTGCTTCGAGCCCCAAAAGAGTCCTACGGCGAATCATAATCTCATCTTCGGATCGGCCTACGTTGGAAAAGACCCAGATGCGTTCCTCACTAAATGCCCAAACCAAGCTCTTAAGGGGTACAGATTCGGTCATTGGACAAACGGTCGGTGCCA  CGATTACACTGAGCTGGCCGACTCGTGGATAGAAGCTGTGGATTCAAAGGCACAGTGCTGGGTCAAAACATTTACAAATGATGAGGTTGCCAGTGACCAACCCCGGACGTATCCACTGACATCGCAACATTCGTGGAACGATTGGTGGCCTGTCCACGAAAAGGATCAACCTCACTCAGGTGGCGACGGGCGTAATTACGGTTTTTTTTATTTTGACAGCAACGGAAAGGGCAAGTGTGCGCTCTCTCACAAAGCACCCGACTGCCTGGTTTCGGATTCTTAATCTAGACTAG(SEQ.ID.NO.1)；以及

CCGCTCGAGGCCACCATGAGCAAAATCAAGGCGAGTACGGATCTTGGGAGGTGCGCCGAGTTTGCCTTTAAGACGGTCGCTATGGATAAAAACAATAAGGCGACGAAGTACCGTTACCCATTTGTTTATGACTCCAAGAAGCGACTGTGCCACATCCTCTACGTATCGATGCAGCTGATGGAGGGTAAAAAGTACTGTTCAGTCAAGGGCGAACCTCCAGATCTCACATGGTATTGCTTCAAGCCCCGAAAGAGTGTTACGGAGAATCATCATCTCATCTACGGATCGGCCTATGTTGGAGAGAACCCAGATGCGTTCATCAGTAAATGCCCAAATCAAGCTCTTCGCGGGTACAGGTTCGGTGTTTGGAAGAAAGGCCGTTGCCTCGACTACACTGAATTGACCGACACTGTGATAGAACGTGTTGAGTCAAAGGCACAGTGCTGGGTGAAAACCTTTGAAAACGACGGGGTCGCGAGTGACCAACCCCATACGTATCCACTGACGTCGCAAGCATCATGGAACGATTGGTGGCCTCTCCACCAGAGTGACCAACCTCACTCAGGTGGCGTTGGGCGTAATTACGGTTTCTACTACGTGGACACGACTGGAGAGGGCAAGTGTGCACTCTCTGACCAGGTACCCGACTGCCTGGTTTCGGATTCTTAATCTAGACTAG(SEQ.ID.NO.3)。

本发明的同时预防新孢子虫和弓形虫感染的疫苗通过pCR259、HighQ-1Transpose-Ad^TM294和HighQ-1^TM腺病毒载体病毒表达。

本发明的同时预防新孢子虫和弓形虫感染的疫苗的制备方法，包括：新孢子虫/弓形虫AMA1基因的扩增与克隆；以及新孢子虫/弓形虫AMA1基因重组腺病毒载体疫苗的制备。具体步骤如下：

根据GenBank检索到的新孢子虫(AB265823.1)AMA1基因序列和弓形虫(AF010264.1)AMA1基因序列的开放阅读框，设计新孢子虫和弓形虫交叉抗原AMA1基因的通用引物P1、P2，所设计的引物P1、P2为：

P1：5’-CCGCTCGAGGCCACCATGAGCAAAATCAAGGCGAGTA-3’

P2：5’-CTAGTCTAGATTAAGAATCCGAAACCAGGCA-3’

其中引物P1中含有酶切位点Xho I，引物P2中含有酶切位点Xba I。

以按照常规基因组提取方法提取的新孢子虫基因组DNA和弓形虫RH株基因组DNA为模板，以P1、P2为扩增引物，对AMA1基因分别进行PCR扩增，PCR扩增的反应体系为25μL：10ⅹBuffer 2.5μL、dNTP 2μL、上下游引物各1μL、模板DNA 2μL、Taq酶0.25μL以及灭菌去离子水16.25μL，反应条件为95℃预变性5min，94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸7min，4℃保存。经1％琼脂糖凝胶电泳检测，如图1所示，以通用引物P1、P2扩增的AMA1基因扩增产物长度均为679bp，AMA1基因扩增产物的实际长度均为648bp(不含引物中保护性碱基、酶切位点序列、起始密码子和终止密码子等)。

纯化PCR扩增产物，将纯化后的PCR扩增产物克隆于pMD18-T Simple Vector得到pMD18-T-Nc/Tg AMA1重组克隆质粒。

进行PCR鉴定、酶切鉴定，pMD18-T-Nc/TgAMA1重组克隆质粒中克隆的AMA1基因正确。PCR鉴定结果表明，pMD18-T-Nc/TgAMA1重组克隆质粒扩增出679bp的目的片段。双酶切鉴定结果表明获得2692bp和679bp的两条片段。测序分析结果表明，克隆的新孢子虫AMA1基因序列和弓形虫AMA1基因序列与GenBank中发表的新孢子虫(AB265823.1)AMA1基因序列和弓形虫(AF010264.1)AMA1基因序列同源性均为100％，即以通用引物P1、P2扩增的AMA1基因与抗原AMA1基因匹配。

将测序正确的Nc/Tg AMA1基因亚克隆至pCR259腺病毒穿梭载体，构建重组腺病毒穿梭质粒pCR259-Nc/TgAMA1。经PCR鉴定和双酶切鉴定后，依次转化HighQ-1Transpose-Ad^TM294和HighQ-1^TM感受态细胞，构建重组腺病毒表达质粒H294-Nc/TgAMA1。脂质体介导转染至QBI-HEK293细胞包装Ad5-Nc/Tg AMA1重组腺病毒，图2示出QBI-HEK 293细胞包装Ad5-Nc/Tg AMA1重组腺病毒图。

IFAT和Western blot检测AMA1基因在QBI-HEK293细胞中的表达，获得的Ad5-Nc/Tg AMA1病毒滴度为6×10⁹TCID₅₀/mL，大量扩增，纯化后制备得到能同时预防新孢子虫和弓形虫感染的疫苗。

本发明应用的腺病毒载体有优于其它病毒载体的特点：腺病毒载体转基因效率高，可以有效地将外源基因表达成具有活性的蛋白；可转导不同类型的组织细胞，不受靶细胞是否为分裂细胞所限；容易制得高滴度病毒载体；进入细胞内并不整合到宿主细胞基因组，仅瞬间表达，安全性高。

本发明选择的AMA1基因是顶端膜抗原基因，AMA1是新孢子虫和弓形虫一个潜在的共同候选疫苗抗原，是具有广阔开发前景的抗原基因。该基因在新孢子虫和弓形虫的速殖子期和缓殖子期均表达蛋白，与虫体侵入宿主细胞和自身复制的功能密切相关。

第一实验例 

本发明第一实施例中制备的重组腺病毒载体疫苗的动物免疫试验

以BALB/c小鼠为实验动物，将60只BALB/c小鼠随机分为3组，每组20只，分别为Ad5-Nc/Tg AMA1疫苗组、pVAX1-Nc/TgAMA1质粒组及PBS对照组，每隔2周肌肉注射接种一次，共接种3次。其中，pVAX1-Nc/TgAMA1是指Nc/TgAMA1基因亚克隆至pVAX1真核表达载体上，pVAX1-Nc/TgAMA1由延边大学预防兽医学实验室构建并保存，在此引入以对不同表达载体制备的疫苗的免疫效果进行对照。Ad5-Nc/TgAMA1疫苗组一免接种6×10⁹TCID₅₀，二免、三免分别接种1.2×10¹⁰TCID₅₀；pVAX1-Nc/TgAMA1质粒组一免接种0.1mg，二免、三免分别接种0.2mg；PBS对照组一免接种0.1mL，二免、三免分别接种0.2mL。每次免疫前与三免后2周进行尾尖采血，并分离血清，间接ELISA测定小鼠血清中IgG抗体水平和细胞因子IFN-γ、IL-4水平。接种疫苗三免2周后，IgG抗体水平，Ad5-Nc/TgAMA1疫苗组(1:2048)极显著高于pVAX1-Nc/TgAMA1质粒组(1:64)和PBS对照组(0)(P<0.01)；IFN-γ水平，Ad5-Nc/TgAMA1疫苗组(525.12pg/ml)极显著高于pVAX1-Nc/TgAMA1质粒组(246.75pg/ml)和PBS对照组(123.46pg/ml)(P<0.01)；IL-4水平，Ad5-Nc/TgAMA1疫苗组(124.26μg/ml)极显著高于pVAX1-Nc/TgAMA1质粒组(86.15μg/ml)和PBS对照组(41.96μg/ml)(P<0.01)。动物免疫试验证实，本发明制备的Ad5-Nc/TgAMA1重组腺病毒疫苗接种BABL/c小鼠后，能够诱导BABL/c小鼠产生强烈体液免疫和细胞免疫应答。

第二实验例 

新孢子虫/弓形虫攻击实验

三免2周后，将每组中20只BABL/c小鼠分别再分为一二两小组，每小组10只，一小组每只腹腔攻击新孢子虫速殖子10⁶个，二小组每只腹腔攻击弓形虫RH株速殖子10³个，进行疫苗的免疫保护性试验，并观察小鼠的临床症状和统计存活率。攻虫实验21d后，接种Ad5-Nc/TgAMA1重组腺病毒疫苗的BABL/c小鼠对新孢子虫速殖子的攻击有80％存活率，而pVAX1-Nc/TgAMA1质粒组和PBS对照组分别为50％和20％存活率；接种Ad5-Nc/TgAMA1重组腺病毒疫苗的BABL/c小鼠对弓形虫的攻击有60％的存活率，而pVAX1-Nc/TgAMA1质粒组和PBS对照组分别为20％和0％存活率。

新孢子虫/弓形虫攻击实验结果证实，本发明制备的疫苗对新孢子虫和弓形虫攻击具有良好免疫保护作用，可以达到同时预防新孢子虫和弓形虫的感染的目的。

本发明制备的同时预防新孢子虫和弓形虫感染的Ad5-Nc/TgAMA1重组腺病毒载体疫苗是一种新型载体疫苗，是应用新孢子虫和弓形虫交叉抗原AMA1基因制备的疫苗，制备的Ad5-Nc/TgAMA1重组腺病毒载体疫苗对新孢子虫攻击的BABL/c小鼠具有80％免疫保护率，对弓形虫攻击的BABL/c小鼠具有60％的免疫保护率，均达到了预防新孢子虫和弓形虫疫苗的最好水平。

以上所述的实施方式仅用于具体说明本发明的精神，本发明的保护范围并不局限于此，对于本技术领域的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过变更、置换或变型的方式轻易做出其它的实施方式，这些其它的实施方式都应涵盖在本发明的保护范围之内。