用于检测并且量化由可见光谱中的蓝光和紫光造成的眼睛损伤的变化的设备和方法

技术领域

本发明的目的是用于检测并且量化由可见光谱中的蓝光和紫光(即， 从自然光或人工光到来自诸如基于LED技术的屏幕的发射器的光的任何 发光源的380nm至500nm的波长之间的电磁辐射)造成的眼睛损伤的 变化的设备和方法。

背景技术

电磁光谱(EME)是物质发射(发射光谱)或吸收(吸收光谱)的 整个电磁波的能量分布。EME包括很大范围的辐射，从较短波长的电磁 波例如伽马射线和x射线，经过紫外辐射、光线和红外线到具有较长波长 的电磁波例如无线电波。

光线光谱是人眼能够感知的电磁光谱的范围。在该波长范围内的电磁 光谱还被称为“可见”光或被简单地称为光线。对于可见光谱不存在精确 的限制；通常人眼对从380nm至780nm的波长有反应，尽管适应于黑 暗的眼睛可以看到从360nm至830nm的更大范围。

视网膜以以下几种方式自发保护自身不受短波长影响：光受体以在黄 斑中央凹中不存在对短波长敏感的光受体的方式的不均匀分布以及通过 存在于相同区域中也执行保护行为的黄色素(叶黄素、玉米黄质以及内消 旋玉米黄质)的行为。此外，晶状体随年龄增大其黄色生色团的比例。

针对最短波长的这些天然的人眼保护(晶状体以及视网膜的天然保 护)可能发现它们自身受到某病状和/或外科手术并且甚至随时间推移的 严重影响。

已开发了保护健康的眼睛、白内障手术后的眼睛以及处于神经系统退 化过程中的眼睛不受短波长影响的一些技术：

-增补人眼的亏缺作为治疗和预防措施以通过选择性滤光器、反射滤 光器和干涉吸收滤光器来代替和/或改进自然保护。

-自从90年代中期以后，已在白内障手术后的眼睛上植入了设置有 黄色滤光器的眼内透镜。这替代地给外科手术过程加入了所有其明显的风 险和困难。还存在大量做过白内障手术的人，这些人已被植入透明的眼内 透镜以代替晶状体的内部物质，被植入的眼内透镜不具有必要的黄色素保 护。在这些情况下，有必要用吸收或者阻挡短波长的黄色素支持系统的插 入物来补充没有黄色素的人工晶状体。

短波长的阻挡元件是被设计成分离、通过或删除总混合物的一组对象 或物质的设备。阻挡元件是针对所选择的特定范围的波长的光而设计的。 该机制由以下构成：阻挡波长以及使其他波长能够通过。

市场上存在应用于人眼的不同类型的滤光器。例如，专利申请WO 98/44380描述了一种在隐形眼镜中应用的滤光器，该滤光器不覆盖所述隐 形眼镜的全部，所述全部被理解为虹膜区域、瞳孔区域和隐形眼镜本体， 该事实是避免视觉的不规则性的基础。另一方面，文献WO 91/04717描 述了一种用于治疗老年黄斑病变(AMD)的眼内透镜，治疗老年黄斑病 变不是本发明的目的。例如通过文献GB 1 480 492还已知以下事实：在 眼部透镜中使用黄色滤光器。

黄色滤光器可以在多种应用中使用，如在本领域的当前发展状况中的 文献所示出的那样。因此，文献DE 358 948描述了一种应用于电子照明 设备的黄色滤光器，但是与第二红色滤光器组合，该第二红色滤光器远离 了在本发明中描述的发明概念。

文献ES 1 046 793 U描述了具有不同颜色的不同的照明滤光器的外 部支持设备，这远离了本发明的发明概念，本发明立足于针对独特的短波 长的阻挡元件，由于该光范围的高能量产生的有害影响，因此将该阻挡元 件集成在给定的材料中以在该短波长到达用户之前将该短波长从可见光 光谱中消除，使用该文献明显未达到上述目的。

文献WO 90/05321描述了具有一系列技术特征的滤光器，但是这些 技术特征绝对地限定了病理生理应用，并且此外，在专利申请WO  90/05321中描述的滤光器的吸收率不均匀，并且可能产生不想要的影响。

Celia Sanchez-Ramos博士是专利ES2247946、ES2257976、 ES2281301、ES2281303、ES2289957、ES2296552、ES2298089、ES2303484 和ES2312284的发明人。然而，虽然这些文献涉及由环境光尤其是从380 nm至500nm的光谱的短波长造成的损伤的问题，但是这些文献中没有 一个文献说明对在用于智能电话、电子平板电脑、膝上型电脑和电视机、 投影仪以及总的来说使用LED技术和/或LED背光的任何屏幕的其他尖 端技术之中的屏幕的大量和日常使用而衍生的问题，所述屏幕主要基于以 其不同的变体形式的LED技术例如OLED、LCD-LED、AMOLED。

显然，今天任何特定用户平均每天在LED型的显示器前花费4至8 小时或者更多，即，通常在非常小的距离(30cm至50cm的量级)处接 收短波长的发射，这对眼睛和人的视力有非常显著的负面影响。在本领域 中，[Behar-Cohen等人“Light-emitting diodes(LED)for domestic lighting: Any risks for the eye？”Progress in Retinal and Eye Research 2011年第30 期第239-257页]中描述了该问题。

另一文献[Cajochen等人“Evening exposure to a light-emitting diodes (LED)-backlight computer screen affects circadian physiology and cognitive  performance”,Jounal of Applied Physiology,2011年第110期第1432-1438 页,2011年3月17日第一次出版]中描述了相关联的问题，在该文献中描 绘了使发光适应睡眠周期的需要。

由于用于室内环境的LED型照明的增加的存在性，所述文献在其结 论中表示了取决于在市场上可用的各种设备来评估由LED发射的光的潜 在危害的方便，使得对国内的照明制造商做出有效的建议。然而，该文献 没有提出将LED技术的发展与无风险的日常使用相结合的解决方案。即， 该文献直接拥护对发光的限制和法律条例，而没有对已经被市场化的产品 提出任何类型的解决方案。

然而，没有一个已知文献表示了需要一种检测并且量化可见光谱中的 蓝光的这些有害发射以使得可以警告用户可能过度暴露于这些发射的设 备和/或方法。

另一方面，在文献[“Effects of light-emitting diode radiations on human  retinal pigment epitelial cells in vitro”,C.Sánchez-Ramos等人在Photochem  Photobiol 2013年3月-4月；第89卷第2期第467-73页，doi: 10.1111/j.1751-1097.2012.01237.x]中描述了蓝光的危害，在该文献中分析 了由电视机、移动电话和个人计算机中通常使用的屏幕上的LED的发射 造成的损伤。

因此，迫切需要一种能够检测并且量化蓝光的存在性的系统，警告用 户通过连续使用这些发射源而被暴露于该蓝光的可能风险。

不存在用于警告380nm至500nm的范围内的发射的已知设备，尤 其不存在警报并且量化对眼部系统的损伤的设备。然而，已知与检测UV 发射相关的文献，例如EP 1 441 208、文献GB 2 419 665以及US  2009/0135003。

发明内容

为了解决所指出的技术问题，本发明在第一方面中描述了用于检测并 且量化来自可见光谱中的蓝光和紫光的方法，所述方法包括以下步骤：检 测光源的发射；计算包含所述光的380nm至500nm的范围内的发射； 确立所述范围内的最大发射阈值；检测针对所述范围设置的阈值是否已被 超过；计算暴露于光源的发射的暴露时间；以及警告所述阈值被超过。

该阈值可取决于每个人。即，其可以是一般阈值或者是针对每个人定 义的阈值。

在本发明的第二方面中，所描述的方法被实现在用于检测并且量化可 见光谱中的蓝光和紫光带的便携式电子设备中，所述便携式电子设备包 括：可见光谱的范围内的光检测器；连接至检测器的信号调节电路；模数 转换器；处理器；以及程序，该程序存储在处理器的存储器中并且被配置 成由处理器运行，该程序包括用于运行所描述的方法的指令。

在本发明的第三方面中，所述方法被实现在计算机系统中，该计算机 系统包括：连接至屏幕控制器的屏幕；程序存储器；相机；处理器；以及 程序，该程序存储在处理器的存储器中并且被配置成由处理器运行，该程 序包括以下指令：选择屏幕的类型；确立屏幕的发射功率并且运行所描述 的方法。

最后，在本发明的第四方面中，要求保护包括执行所述方法的指令的 计算机程序产品。

贯穿描述和权利要求，词语“包括”及其变体不意在排除其他技术特 征、添加物、部件或步骤。对于本领域普通技术人员而言，本发明的其他 目的、优点和特性一部分从对本发明的描述中显露并且一部分从对本发明 的实践中显露。随后的示例和附图以说明的方式提供，并且不意在限制本 发明。此外，本发明涵盖本文所指出的特定实施方式和优选实施方式的所 有可能组合。

附图说明

在下文中非常清楚地描述的是有助于更好地理解本发明的一系列附 图，并且所述一系列附图与本发明的实施方式明确相关，所述实施方式被 呈现为本发明的非限定性示例。

图1示意性地示出了实现用于检测并且量化可见光谱中的蓝光的方 法的便携式电子设备(100)和计算机系统(200)。

图2示出了本发明的短波长的阻挡元件针对以下不同年龄的人的三 个示例的选择性吸收率：25岁(图2a)、45岁(图2b)和76岁(图2c)。

图3示出了由本发明所描述的示例使用的LED型光源的视图。A.使 用短波长的阻挡元件和不使用短波长的阻挡元件的照明设备的示意性表 示。B.使用的LED中的每个LED的光谱发射曲线。C.其中种植细胞的 孔板的设计。

图4示出了LED光对细胞生存力的影响以及选择性地吸收短波长的 阻挡元件对细胞生存力的光保护效应的图，细胞生存力指示人类视网膜色 素上皮细胞中的细胞存活。

图5示出了LED光对人类组织蛋白H2AX的活化的影响以及选择性 地吸收短波长的阻挡元件对人类组织蛋白H2AX的活化的光保护效应， 人类组织蛋白H2AX的活化指示人类视网膜色素上皮细胞中的DNA损 伤。

图6示出了LED光对胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶7的活化的影响以 及选择性地吸收短波长的阻挡元件对胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶7的活化 的光保护效应的图，胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶7的活化指示人类视网膜 色素上皮细胞中的细胞凋亡。

具体实施方式

图1示出了本发明的不同的实际实施方式。图1A示出了可在逻辑上 由某一位置的用户运输以使得允许其上的入射光被读取的便携式电子设 备100。

该便携式设备包括可见光检测器101，例如LDR、CMOS传感器、 CCD传感器、光电二极管、太阳能电池以及总体上连接至信号调节电路 102的任何可见光检测器，该信号调节电路102对由检测器101发射的信 号进行滤波并且调节以用于其随后的数模转换器A/D 103。数字化的信号 被传到处理器104，处理器104包括内部存储器(尽管其可以以处理器104 的外部的存储器实现)中的由处理器104执行的指令组成的程序，该处理 器104被配置成检测光源的发射，即，确立可见光谱中的蓝光的存在性。

当检测到可见光谱中的蓝光时，处理器104被配置成计算380nm至 500nm之间的短波长的范围内的发射量。这可以例如通过选择在所述范 围内响应的光电二极管作为检测器101，使得通过在处理器104上调节信 号并且评估所述信号强度，使得可以设置发射量(蓝光的较大信号、较大 存在性)。然后，该信号与针对该范围的发射的预定值进行比较，使得如 果存在高于所述阈值的发射，则暴露于蓝光即暴露于380nm至500nm 之间的光谱，该光谱范围被理解为对对象的视觉健康有害。

处理器104还计算期间对象被暴露的时间，使得允许以各种方式例如 向他/她的移动电话300发送蓝牙信号105来警告用户(对象)。此外，移 动电话具有连接至外部服务器400并且评估该暴露、存储该评估或者创建 有害行为的记录、然后使用该记录警告或阻止将来的用户的能力。

类似地，设备100自身包括信号灯，该信号灯在图1中示出的实施方 式中包括执行所述警告的红色LED 106和绿色LED 107，在所述警告中， 当允许的发射阈值被超过时，在逻辑上点亮红色LED 106。此外，可以加 上声学信号108。

在另一实施方式中，本发明的设备对象可以以以下方式被集成在如图 1b中示出的计算机系统中：可以测量源处即发射源自身例如LED型屏幕 或其他等价物处的发射。计算机系统必须被理解为包括被配置为用于所述 目的的在可见光谱范围内发光的屏幕的任何可编程设备，例如膝上型电 脑、平板电脑、下一代移动设备、台式计算机或电视机。

因此，计算机系统200包括：连接至控制器的屏幕201，该控制器又 连接至至少一个处理器202、程序存储器203和相机204，使得存储在存 储器203中的程序205被配置成由处理器(202)执行，一个或多个程序 (205)包括选择屏幕(201)的类型并且确立屏幕(201)的发射功率的 指令，该发射功率与例如屏幕201的亮度相关。

此后，例如通过存储在存储器203中并且被先前选择的屏幕201的型 号的特性来计算包含该发光的380nm至500nm的范围内的发射。随后， 设置所述范围内的最大发射阈值，并且检测针对该范围设置的阈值是否被 超过，计算暴露于光源的发射的暴露时间并且警告上述阈值被超过。此外， 可以连接外部服务器400并且评估该暴露，存储该评估，或者创建对有害 行为的记录，然后使用该记录警告或阻止将来的用户。

如已大范围地指出的本发明的目的是推断和评估光暴露对眼睛的损 伤，即，所描述的设备必须能够测量、评估、并且警告用户暴露于380nm 至500nm的范围内的发射量。为此，首先，必须设置影响眼睛损伤的变 化的量化的内在和外在因子的存在性。

在逻辑上，要被考虑的第一因子是由设备自身通过检测器101检测的 环境照明，或者第一因子是被确立为对环境照明信号加权的独立因子。应 当注意，环境光直接取决于用户的位置和一天中的时间，因此在设备中包 含GPS电路以得知：

i.位置

ii.气候

iii.一天中的时间

因此，例如如果用户12月在比利牛斯山，则对发射的程度加权的一 些气候条件例如雪被假设，以相同的方式得知海拔，因为在海拔2000米 处的发射与海平面处的发射的类型不同，以及一天中的时间，所接收到的 发射由于在中间小时，以及取决于位置而不同。

要被考虑的第二因子是由用户观看的发射设备，包括该设备的尺寸、 观察该设备的估计距离，发射强度(即，亮度)以及是否实现了针对380 纳米至500纳米之间的光谱的发射的滤光器。

在本发明的实际实施方式中，设备100包括存储在存储器中可由用户 选择的不同类型的显示器，使得用户选择来自发射源的数据。在其他实施 方式中，例如，如果本发明以以下方式在移动电话、电视机或其他发射源 上实现：来自每个源的发射被发送至例如作用为网络主机的计算机系统 200，或者用户的具有相同功能的电话，则检测是自动的。因此，在本发 明的另一实际实施方式中，在针对一个或多个用户的房子或办公室中存在 的不同的发射源可以建立通信网络以在所述一个或多个用户之间交换发 射和暴露时间的信息，针对特定用户对这些数据进行合计，并且在逻辑上 改进针对特定用户的眼部损伤的量化和推断的质量。

另一方面，必须考虑与用户直接相关的许多因子，例如，年龄、疾病 状态(例如，青光眼和/或视网膜病)、活动的小时、眼睛活动的类型、折 射状态，即，他/她是否为近视、远视、散光和/或是否有老花眼或其他眼 部异常，以及是否他/她具有任何颜色疾病。

眼部活动的类型可以因生活习惯和例如职业习惯两者以及用户针对 每个活动的集中状态而异。生活习惯影响了暴露等级，渔民经受的暴露等 级与焊工或服务员经受的暴露等级不同，因此将假设某些条件，例如在渔 民的情况下水的反射和工作的小时数，因此，这是在量化眼睛损伤的比率 时用来加权的因子。

另一方面，用户的集中状态是有关的，由于显示表明集中度越高，用 户眨眼越少，因此作为结果，由眼部系统直接接收的发射增加。此外，用 户恢复精神的类型和时间是不同的。

因此，设备100可以由用户定制，或者设备100可以在工厂处针对特 定用户通过集成其特定特性而定制。

下表以示例的方式而不是限制的方式阐述了具有最大百分比和最小 百分比的一系列因子，以精确地设置保护滤光器在所述波长范围内应当具 有的最大吸收率和最小吸收率。

表1

表1中以示例的方式列出的各种因子的和是给出与图2对应的最大吸 收率阈值和最小吸收率阈值的结果，其中，以示例的方式指出，对于用计 算机工作(4/2)、用户暴露于光源的时间小于3小时(2/1)、用户与明LED 型光源交互的地方的环境照明(2/1)并且没有疾病状态的25岁左右(最 大5，最小2)的用户对380nm至500nm的范围内的最大吸收率为 (5+2+2+2)％，即13％，而最小吸收率为6％，如例如图2中的示例(示 例1)所示。然而，如果同一个人在高照明和低照明的环境下使用各种电 子设备(计算机、平板电脑和智能电话)超过10小时，则优选的吸收率 范围可以在11％至24％之间(示例2)。另一方面，如果这个人具有一般 的视网膜疾病状况并且在强光条件下每天3小时至5小时暴露于电视机， 则推荐的吸收率范围可以是47％至74％(示例3)。

因此，该值的倒数是可以被设置为针对每个加速因子A_i的权重k_i(虽 然可以定义其他等同物)。以相同的方式，将这些权重k_i定义为加速因子 A_i的整数倍数。可以被均等地施加至减小因子Rj的权重被定义为k_j，这 正好可以是具有适当吸收率的滤光器的存在性。

定义了因子，暴露于380nm至500nm的范围内的发射的比率被定 义为如下：

其中年龄是表示用户的年龄的整数，其与蓝光的条件成比例(从表中 可以看出，除了由于眼睛还没有完全成形所以需要特殊保护的较小孩子以 外，人的年龄越大，吸收率的百分比越高)，时间微分被定义为暴露时间 减去休息时间，在休息时间，视力往往以可变的方式被恢复。

该比率是所接收的发射的倍数，使得这些发射的重要性直接受年龄影 响(年龄是在对眼部系统损伤的估计中有较大影响的因子)，并且该比率 是加速因子和有效的暴露时间的直接函数，并且与减小因子成反比，这些 因子中的每个因子被特定权重加权。

一些人可能认为不必要具有最大吸收率范围并且完全阻挡380nm至 500nm之间的短波长的通过。然而，对蓝光的完全阻挡影响屏幕的能见 度以及影响个人的生物钟二者，所以合理的是设置最小吸收率和最大吸收 率范围，最小化这样的负面影响。总体上已有研究指出：25％的光是蓝光 并且不可以去除大于总数的13％，即根据不同的变量，这是7％的蓝光。

在设置了对发射的接收和加权后，本发明取决于一系列阈值来通知用 户。因此，例如，可以是具有暴露的三个/四个程度(低、中间、高、危 险)的条，使得不仅警告用户，而且能够与发射源手动地或自动地交互。 因此，如果源是移动电话或计算机屏幕自身，则当达到高等级时会警告用 户，并且用户可以例如通过降低屏幕的亮度来与其交互，使得当减小该加 速因子的权重k时，比率I将降低，并且可以校正风险的等级，即，接收 的发射乘以该比率。类似地，如果解决方案是激活软件滤光器，则减小因 子的权重将显著增大，以减小比率并且因此降低风险的等级。

在任何情况下，在特定实施方式中，可以规定，当超过某阈值时，发 射源(即屏幕)直接关断，所以被应用于用于游戏的移动电话或电视机或 移动设备中的本发明甚至可以被用作父母控制以防止未成年人的滥用。

如所指出的，本发明可以被实现在移动电话以及一般来说任何便携式 电子设备例如Google型的眼镜上。即，检测器可以在电话自身上， 检测器可以是如图1描绘的独立的设备100或任何其他可编程电子设备。

在本发明的实施方式中，设备检测用户何时睁开眼睛。当设备被激活 时，例如，当设备的加速度计检测到该设备的运动时，系统可以理解用户 是醒着的并且因此他/她的眼睛是睁开的。也可以推断用户在户外，因为 通过对位置变化的检测可以精确地知道所述位置变化与室内运动不同，存 在对位置变化的各种检测方法：GPS、GPS天线的三角测量、检测WIFI 网络等。

还可以预测某人将接收的发射量，使得例如，电影可以在其文件中包 括发射的总发射并且当与其视觉活动相关的这些发射过度时警告用户、预 期信息并且使用户能够决定他/她是否想看该内容。还可以预测例如在旅 途中或在较长的行走中的发射量，如果系统直接得知或者根据其行为推断 旅途的持续时间并且通过天气预测或通过位置或能够得知发射的预期等 级的任何其他类型的检测器而得知其发射的平均等级，则该设备或系统评 估发射的等级并且给个人推荐某行为或预期个人可以做什么。

如所指出的，发射信息可以被远程地存储在例如服务器400上。

系统可以通过能够知道个人的行为的任何方法来推断辐射暴露的行 为，例如，当以下条件满足时推断个人正在睡觉：例如，电话通过检测 WIFI而检测到其处于住处、以及时间与用户通常睡觉的时间相匹配、或 者例如，用户已设置闹钟并且已连接移动电话充电器、与就寝时间通常相 关的行为。系统还可以得知特定人类行为并且当系统不清楚某事情是否发 生时可以主动地问问题，例如，系统检测到位置的变化并且因为例如设备 处于口袋中所以其亮度检测器指示进入弱光。

因此，本发明是用于预防医学和公众健康的有效工具。此外，在给定 设备的特性的情况下，在一些实施方式中可以将所述设备连接至远程医疗 的服务器(例如服务器400)以远程地检测用户的视觉行为。

毒性测试

在本领域中目前还未描述过由于使用配备有该类型的显示器(LED) 的电子设备而造成的由不同光谱成分的LED光产生的短波长对视网膜色 素上皮细胞的毒性的程度。

毒性测试的特定目的和所提供的解决方案如下：

-在暴露于发射不同光谱成分的辐射的不同的LED之后，研究试管 中的视网膜组织的细胞生存力，如图4所示。

-在暴露于发射不同光谱成分的辐射的不同的LED之后，评估试管 内的视网膜组织的DNA损伤，如图5所示。

-在暴露于发射不同光谱成分的辐射的不同的LED之后，确定试管 中的视网膜组织的细胞凋亡，如图6所示。

评估和确定毒性之后，评估了在本发明中提出的解决方案。

表2

在表2中，示出了在研究中使用的试剂、设备和提供的材料的概要。 另一方面，照明设备被设计成包括通过白色材料的区分挡板彼此分开的五 个有区别的照明区域。所述区域中的每个区域包括产生辐照度为5 mW/cm²的光但是发射具有以下不同的光谱成分的光的LED：

-蓝色LED(468nm)

-绿色LED(525nm)

-红色LED(616nm)

-白色LED；色T°＝5400°K

图3示意性地表示所使用的照明设备以及每个LED的光谱发射曲线。 该设备被放置在培养板上，并且细胞在插入短波长的阻挡元件的情况下以 及在没有插入短波长的阻挡元件的情况下暴露于LED光仅3个亮-暗周期 (12小时/12小时)。如所示出的那样，存在未受LED照射的区域，在该 区域中放置了不暴露于光的细胞，该细胞被用作阴性控制。

在该非限定性特定实施方式中，阻挡元件被限定为对短波长的阻挡元 件，该阻挡元件包括黄色素均匀地分布在其表面的基板，并且，在所述色 素中具有光学密度，使得所述色素能够在1％至99％之间的范围内选择性 地吸收380nm至500nm之间的短波长。更具体地，阻挡元件是膜或多 层膜，其中膜或多层膜中的一层膜是着色的。

细胞培养和板设计

视网膜色素上皮细胞(RPE)遵从提供者的指令被解冻在补充有胎牛 血清(FBS)和生长因子的“上皮细胞培养基”中。在72小时处以及当 培养菌到达汇合处时，用胰蛋白酶-EDTA培养细胞，并在预先用多聚赖 氨酸处理过的96孔板中以5000细胞/孔的密度种植细胞。该培养保持24 小时，之后，用新鲜的培养基(300μl/孔)代替该培养基。该过程在实验 进行期间每日重复以避免由灯产生的热而引起蒸发。具有照明设备的板被 放置在培养箱中，该培养箱中处于37℃、5％CO₂的空气中。

在存在不同光谱特性的光的情况下培养细胞达3个暴露周期/休息周 期之后进行毒性试验，其中每个周期为12小时。

用PBS冲洗样品并且用4％的多聚甲醛固定15分钟，在固定之后， 用0.3％的氚核渗透细胞10分钟。当样品被渗透后，将样品用5％的BSA 阻挡，然后以1:400的浓度添加在2.5％PBS+BSA中溶解的酶原抗体和 抗-H2AX抗体，以分别测定细胞凋亡和DNA损伤。

在培养一个小时之后，用PBS冲洗样品，并且以与主抗体相同的浓 度添加二级抗体Alexa 594和Alexa 600，并且培养30分钟。在培养之后， 冲洗样品并且在BD Pathway 855荧光显微镜中读取信号。对于半胱氨酸 蛋白酶的活化，在发射的633nm处捕获图像以及在594nm处捕获H2AX。

统计分析

每个实验重复至少两次。值用均值±标准方差来给出。使用Centurion  XVI.I版本的统计软件Statgraphics(USA)来通过统计未配对学生的t- 测试来分析该数据。P-值小于0.05则被认为是显著的。

结果：细胞生存力

在3个12小时的光暴露周期与3个另一12小时的恢复周期交替的时 间段之后，主要的人类视网膜色素上皮细胞的细胞核被DAPI染色以对每 个孔的细胞的数量进行计数。

未受辐射的细胞在孔中生长得很好，但是受单色LED光辐射的细胞 被禁止生长。蓝光(468nm)引起细胞的数量非常显著地降低，虽然对 于绿光(525nm)也存在可观察到的光毒性效应。在白光(T°＝5400°K) 的情况下，在统计上没有观察到显著差异。

在存在短波长的阻挡元件的情况下，主要在暴露于白光(T°＝5400 °K)的细胞和暴露于蓝光(468nm)的细胞中观察到细胞生存力的提高， 如表3所示：

表3

在图4中，可以看到LED光对在人类视网膜色素上皮细胞中的细胞 生存力的影响以及选择性地吸收短波长的阻挡元件对在人类视网膜色素 上皮细胞中的细胞生存力的光保护效应。FU表示荧光单位。

结果：DNA损伤

为了检验辐射是否对细胞的DNA的完整性有某种影响，使用H2AX 抗体来标记细胞。

H2AX是在DNA修复中即当在细胞核的DNA中存在损伤时包含的 组蛋白H2A的变体。当双链DNA断裂发生时，H2AX组蛋白通过激酶 ATM使丝氨酸139被快速地磷酸化并且变成伽马-H2AFX。

该磷酸化步骤可以从双链断裂的位置扩展到几千个核小体，并且可以 在发损伤信号和DNA修复所需的蛋白质的招募中标记周围染色质。作为 翻译后修饰由严重的DNA损伤造成的细胞凋亡的部分，将磷酸化的 H2AFX的高表达看作细胞凋亡的准确指示符。

实验的结果示出了用LED光辐射之后的抗H2AX抗体识别指示DNA 修复机制的活化的磷酸化的组蛋白的位置。

通过插入短波长的阻挡元件，观察到指示较少DNA损伤的组蛋白 H2AX的活化的显著降低。如表4所示，对于白光(T°＝5400°K)、蓝光 (468nm)和绿光(525nm)LED等降低97％，而在暴露于红色LED 光的细胞中降低95％。

表4

在图5中，可以看到LED光对在人类视网膜色素上皮细胞中的H2AX 的活化的影响以及选择性地吸收短波长的阻挡元件对在人类视网膜色素 上皮细胞中的H2AX的活化的光保护效应。FU表示荧光单位。

结果：细胞凋亡

确定了胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶7的活化，这是因为在对细胞凋亡 的调节和执行中包括这些酶。使用抗胱天蛋白酶抗体来标记细胞。在细胞 中使用LED光的辐射造成了培养基中的凋亡细胞的百分比的增大。胱天 蛋白酶活化被观察为在蓝染的细胞核(DAPI)周围的粉红色。插入短波 长的阻挡元件引发胱天蛋白酶活化的显著降低，胱天蛋白酶活化指示暴露 于不同的LED光源的细胞中的细胞凋亡。如表5所示，对于白光(T°＝5400 °K)和蓝光(468nm)降低89％，对于绿光(525nm)降低54％，且对 于红光降低76％。

表5

在图6中，可以看到LED光对在人类视网膜色素上皮细胞中的胱天 蛋白酶3和胱天蛋白酶7的活化的影响以及选择性地吸收短波长的阻挡元 件对在人类视网膜色素上皮细胞中的胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶7的活化 的光保护效应。FU表示荧光单位。

按照对问题的分析和解决方案的示例，在12小时暴露与12小时恢复 交替的3个周期中的光尤其是较小波长的光会影响人类视网膜色素上皮 细胞的生长。发生表示组蛋白H2AX(DNA损伤)和胱天蛋白酶3和胱 天蛋白酶7(细胞凋亡)的细胞的数量的增加。

在所有情况下，选择性地吸收短波长的阻挡元件对于光对人类视网膜 色素上皮细胞的损伤影响起到保护作用。