梯度延迟体积的调节方法

技术领域

本发明处于液相色谱法尤其是高效液相色谱法(HPLC)领域。液相色谱法 (尤其是HPLC)用于借助色谱柱来分离样液的组成成分。此时，(分离)柱的分 离效率尤其取决于其长度和封隔材料的颗粒大小。为了尽量好的分离，需要 具有足够的长度和小颗粒尺寸的柱。这样的柱具有高的液阻并因此为了运行 而需要比传统柱高许多的压力。

另外，期望足够快速的分析以允许高的样品通过能力。这要求柱内的高 流速，由此也提高柱的背压。

背景技术

一种加速分离或者说提高分离效率的可能方式在于溶剂组成在分离的 持续时间内改变(以下称为梯度，即洗脱力或溶剂成分随时间变化的程度被称 为梯度或者溶剂梯度)。

由于对分离的不同要求，已实现了用于获得梯度的两种不同的技术实现 手段。即所谓的高压梯度形成(HPG)和抵压梯度形成(LPG)。高压梯度形成借 助两个独立泵来工作，它们在系统高压侧通过T管件相连。在两个泵处的流 速改变产生了梯度。低压梯度形成只需要一个带有前置比例阀单元的泵。在 泵的吸入周期内，通过在比例阀单元内的阀(例如螺线管阀)的启闭将各种溶 剂先后吸入该泵中。梯度是通过针对各种溶剂的打开时间的变化而形成的。 为了消除溶剂混合物中的成分波动(混合物波动)，按照标准在泵后面接设一 个混合器。

在不同的设计中出现了不同的所谓梯度延迟体积(GDV：Gradient Delay  Volume梯度延迟体积或者Dwell Volume滞留体积)。梯度延迟体积或者说 混合体积一方面通过从混合点到柱入口的所有暂时接通的组成部件的容积 来设定。在LPG中，GDV根据该控制阀和被接通的连接端口的结构例如由 以下组成部件(或其一部分)的体积来构成：泵头、混合器、连通毛细管、进 样环路(Sample Loop)、控制阀、计量装置(计量器)。在HPG中，GDV根据 该控制阀和被接通的连接端口的结构例如由以下组成部件(或其一部分)的体 积来构成：T管件、混合器、连通毛细管、进样环路(Sample Loop)、控制阀、 计量装置(Metering Device)。另一方面，还需考虑冲洗体积，其由这些组成 部件的流体学性能得到。

如果在某一种HPLC设备上研发出一种色谱法，该色谱法可能大多无法 被顺利套用到另一设备上。公开方法的再现也一样困难。其一个起因就是伴 随保留时间的延期和/或延长而出现的不同的GDV。

另外，混合物波动也取决于GDV。GDV越高，各种溶剂混合得越好， 混合物波动越小。

对GDV和残余混合物波动的要求也主要取决于应用和所采用的探测器 类型。非光学探测器如MS、ELSD或CAD通常对混合物波动不敏感，这是 因为它们不会因针对各溶剂成分的不同探测灵敏度而产生信号波动。因此， 在适度的混合器性能下具有小GDV的混合器在这种情况下也可能是可接受 的。而在采用UV探测器时就完全是不同的一种情况，尤其在短波长时。对 此，溶剂组成的最小波动造成基线的可见漂移。这使得从探测器信号中确定 材料浓度变得困难。在相应较高GDV下具有尽量高混合效率的混合器在此 情况下可能是有利的。

不必要的大GDV也是不利的，这是因为由此也将不必要地延长分析、 清洗和平衡阶段。

如果一种方法被转移到具有不同GDV的另一HPLC设备，则可以计算 偏移时间(tgdv＝Vgdv/流速)并且相应延迟或提前开始梯度形成。

但是，伴随这种波动的问题无法被彻底解决。对此，人们通常将该混合 器人工更换为另一混合器。当然也可以想到利用控制阀实现这种更换的自动 化。但这种解决方案可能因为混合器尺寸而使用不便，并且还是成本密集的。

发明内容

因此，本发明基于以下任务，提供一种方法和一种设备或者说用于执行 该方法的进样器，其以低成本且结构简单方式实现了GDV或者混合体积的 调节。

根据本发明，该任务将通过具有权利要求1的特征的方法以及通过具有 权利要求10的特征的液相色谱设备来完成。

根据本发明，在色谱设备内在混合点(梯度形成)和分离柱入口之间设置 体积调节装置，它允许简单而低成本的自动改变GDV或者说混合体积。这 样的体积调节装置例如通过控制装置提供最好是无级可调的体积，该体积在 色谱分析过程被成分改变的工作介质或溶剂(梯度)流过且相应属于GDV。

根据色谱设备的构造，以下组成部件在路径中(梯度在其中经过或穿过)， 例如：

在LPG的情况下，根据控制阀和被接通的连接端口的结构：泵头、混合 器、连通毛细管、进样环路(Sample Loop)、控制阀、计量装置(Metering Device) 或其部分；

在HPG的情况下，根据控制阀和被接通的连接端口的结构：T管件、混 合器、连通毛细管、进样环路(Sample Loop)、控制阀、计量装置(Metering  Device)或其部分。

因此，容积或者说各位于该路径中的组成部件的由梯度所流过的内部体 积得到了针对各设备的特定GDV。

通过本发明的方法以及通过本发明的液相色谱法，现在已经可以提供期 望的GDV，其不同于设备特定(固定)的GDV。因此，可以调节出另一设备的 预定的例如在方法改进中所确定或已知的GDV，不用为此在当前设备上替 换、添加、取代或更换组成部件(混合器等)。GDV的改变此时在体积调节装 置的最大可调体积和最小可调体积之间范围内进行，例如0-1000μL，尤其 是0-500μL，最好是0-120μL，最好借助电子控制装置。

在本发明的其它实施方式中，该期望值可以通过相应调节该体积调节装 置来无级调节。当然也可以想到在GDV的可变范围内设置多个独立分级。

在本发明的优选实施方式中，作为体积调节装置采用了在设备且尤其是 进样器内针对取样和/或注入已设有的计量装置。现有部件的附加使用允许 了结构性和降低成本的节约潜能。

在本发明的任何实施方式中，所期望的GDV可以在色谱分析过程(其中 经历梯度)之前例如在取样之前或者在注样之前被预调节出来，或者在注入或 色谱分析过程期间被调节出来。

在该计量装置或其容积属于GDV的配置形式(或者说带有进样器)中，可 通过这种方式通过预设定的容积(大于零，或者不同于设备特定的取样初始位 置)在取样前改变该GDV，因为这种预设定的不同于标准位置的体积在路径 切换(取样-注入)之后算作GDV。

但当然也可以想到在注样过程之中和/或之后调节或改变该GDV。此时 最好可以相应相反地控制(在色谱设备内也已有的)泵装置尤其是溶剂泵，从 而最终的体积流或者说流量和/或压力在至分离柱的路径中且尤其在分离柱 入口之前是基本保持恒定的(即现有流速或现有压力的偏差小于20％，例如 小于10％，尤其是小于5％，最好小于1％)，并且可以避免损坏该分离柱以 及保证分析的可再现性。

如果GDV的改变在朝向该柱的流向上看在所投入使用的样品或者说所 谓的样品段之后进行(即在混合点或梯度出现与注入位置之间的区域内)，则 该梯度的经过时间也与样品段位置有关地改变。相应地，在分析时例如在 GDV增大的情况下出现时间延长或者结果伸展(或者作为峰被探测的样品组 成关于时间)。如果GDV或ΔGDV的改变在至该柱的流向上看发生在所用的 样品或者说所谓的样品段(即在注入位置和分离柱入口之间的区域内)之前， 则相对于样品段的梯度进展时间保持不变(无延长)，但该结果(或者说随着时 间所探测的峰)按照系数ΔGDV/流速延迟地发生。

如果已有的计量装置被用作体积调节装置且该梯度经过该计量装置，则 GDV包括除了预定样品体积外还调节出或改变的体积。在本发明的这个实施 方式中可行的是，在从0或计量装置最小值到最大值减去预定样品体积的范 围内调节出期望的GDV。

在本发明的其它实施方式中，可以在色谱分析过程结束时或之后调节出 体积调节装置的最小体积，以将清洗用时间缩短至最短。

除了所述的优点(GDV的无级调节，无需人为干预，对此低成本利用现 有零部件，可以省掉混合器或者混合器支持)外，根据本发明也可以在设备中 通过简单改变GDV或混合体积来避免或消除不希望有的太大的GDV。根据 本发明，在任何情况下都与常见方法和设备不同地可以满足对GDV和混合 性能的所有应用特定的要求，而不用更换相应的组成部件。

虽然GDV或者说混合体积在色谱分析过程中在常见方法中是恒定的， 但根据本发明还可以想到的是，GDV随着分析时间而变。如果HPG中的一 个单元例如不同于另一单元地输送很少的溶剂，则需要更大的GDV以抑制 混合物波动。在这两个单元输送几乎一样的量的其它时刻，较小的GDV可 能就够了。

由从属权利要求得到了本发明的其它有利实施方式。

附图说明

以下将结合附图所示的实施例来详述本发明，其中：

图1通过两个曲线图示出了两个不同的GDV在色谱分析过程中对探测 结果的影响；

图2是包括根据本发明的进样器的HPLC系统的示意图，色谱柱与进样 器相连，其中，注射阀位于注入位置并且在所示状态下实现平衡阶段；

图3示出了图2的HPLC系统，其中，该注射阀从注入位置被切换到压 力平衡位置并且进样环路被切换离开分析路径；

图4示出了图3的HPLC系统，其中，该注射阀被切换至废液位置；

图5示出了图4的HPLC系统，其中，该样针为了取样被移入样品容器 且随后使注入器的活塞移入最终位置(位置C)以吸入样品体积；

图6示出了根据图5的HPLC设备，其中，该注射阀从进样位置被切换 到压力平衡位置并且随后为了进样环路中的压力平衡(压力增大)而使活塞移 入位置B；并且

图7示出了图6的HPLC系统，其中，该注射阀从压力平衡位置被切换 至注入位置。

具体实施方式

如图1所示的曲线图示出：在时刻0分钟的(样品)注入时，GDV的改变 如何关于时间影响分析。在曲线图中，溶剂组成关于时间以虚线表示。溶剂 组成(呈拐点状的若干过渡)从恒定(下方或者说前方水平部分)的下限(乙腈 40％)经过变化的(从40％到70％乙腈)组成或者说梯度(上升的线性中央区域) 改变至恒定(上方或者说后方水平部分)的上限(乙腈70％)。作为梯度，例如 采用了溶剂成分B增加例如乙腈CAN在16秒内从40％到70％的梯度(和溶 剂成分A的相应减少或者其余溶剂成分从60％到30％)。在上方的曲线图(情 况A)中，体积调节装置的预设的泵体积V_A＝25μL，即，GDV增加了25μL， 而在下方的曲线图(情况B)中，调节出的泵体积V_A＝100μL，即，GDV增加 了100μL。

因为通过体积调节装置(尤其是本实施例中的计量装置5)从情况A到 情况B的GDV增大(ΔGDV＝75μL＝100μL-25μL)，在指向(分离)柱41的 流向上看，是关于所加入的样品段的位置在其后面(即以下称为在样品段和工 作介质之间或者说在混合点和样针42尖之间的后界面)发生的，故就样品而 言在分离柱41入口的梯度或者说相应浓度的到达(以及进而作用)延期了， 但没有延迟样品本身的到达时刻。但是，因为在柱41入口到达相应浓度的 时间延迟或者说延后推迟或延缓了梯度对于样品的待洗脱成分的洗脱作用。 故此，出现了作为“峰”而被探测到的(样品)成分的时间性分布或延展，它 增大了难以洗脱的成分(时间轴方向上)。

如在图1(下方的曲线图)中作为分析结果的一部分(包含所示的峰2至峰 7，按照mAU＝millli absorption unit毫吸收单位)所示，相应的成分(因浓度 较高)被越晚洗脱，这些峰随着时间增加相对于其在上方曲线图中的出现而越 延迟出现。相应地，峰出现时刻如下所述地提高。

峰2从26.090s到26.450s，延迟Δt＝0.360s

峰3从45.150s到47.250s，延迟Δt＝2.100s

峰4从58.520s到62.780s，延迟Δt＝4.260s

峰5从68.390s到73.630s，延迟Δt＝5.240s

峰6从71.960s到77.560s，延迟Δt＝5.600s

峰7从79.430s到85.520s，延迟Δt＝6.090s

此时，在峰2处的最小延迟小于测量误差，因而其在情况A中的出现相 对于情况B可以被视为同时，即没有延时。其原因是工作介质的等强度部分 在峰2处已被洗脱出来，而在此刻已没有梯度在作用。而吸收的幅度或最大 值可以如图1所示保持不变或减小。

通过比较图1的上下曲线图，在时间轴上在31秒到36秒的从水平至 增高的过渡情况以及在47秒至52秒的从增高到水平的过渡情况，作为GDV 变化的结果ΔGDV，在水平线(等强度)和线性增高(梯度)之间的过渡或拐点 是朝右移动的。约5秒的延迟是由于增大了ΔGDV＝75μL的GDV(下方曲 线图)和0.95mL/min(＝15.83μL/s)的流速而出现的。

而如果GDV的增大在去往该柱41的流向上看在位置上是在样品段之前 (即在针座或注入端口45和分离柱41的入口之间，或者说在样品段和工作 介质之间的前界面之前)进行的，则样品成分的探测结果或者说峰没有按照延 长可变的经过时间的方式被延迟或者说在曲线图中朝右推移。

图2-图7以示意图示出了HPLC设备或者说HPLC系统，其包括按照分 段环路原理工作的进样器10，该进样器具有计量装置5、注射阀3和高压 泵40。另外，进样器10具有进样环路，其由第一连接件51、第二连接件 52、44和泵体积V(根据活塞位置，从最小、V_A、V_B或V_C直到例如120μL 的最大V_max)构成。在这里，它可以是直径较小的耐压管路，例如呈玻璃毛细 管或不锈钢毛细管形式。连接件51与注射阀3的第一进样环路端口16相 连并且与输样机构或者其泵体积V相连。由吸入件44和供应件52构成的 第二连接件是可分离地构成的。为此，供应件52通入注入端口45，注入端 口通过供应件52与注射阀3的第二进样环路端口13相连。以一端与计量 装置5的泵体积V相连的吸入件44在另一端具有样针42，吸入件44可借 助该样针与注入端口45相连。

但是，也可以使样针42移向样品容器43并且从样品容器中按照以下 所述的方式将规定的样品体积吸入该吸入件44。另外，也可以使样针42移 向用于冲洗流体的一个容器(未示出)，以从中取用冲洗液体用于冲洗过程， 借助于该冲洗液体，进样环路51、52、44、泵体积V以及或许有的注射阀 的端口和槽或者说通道可以得到清洗。但是，通过所示的分段环原理的特殊 形貌，通常不需要冲洗进样环路51、52、44以及输样机构5，这是因为它 们本来就在利用泵40所输入的工作介质的注入过程中被冲洗。但是，样针 42的外表面可以通过浸入装有清洗液或冲洗液的容器中而被清洗。或者， 也可以使针42移动至附图未示出的清洗端口和/或废液端口，以便清洗和/ 或排出多余的溶剂。

在所示的实施方式中，计量装置5包括注入器50，在该注入器50内， 活塞53压力密封且可移动地引导。活塞53借助驱动机构55如步进马达来 驱动。驱动机构55由控制单元60来控制。控制单元60也控制注射阀3的 转换过程，该注射阀具有未示出的可控驱动装置。

注射阀的废液端口12与废液管路47相连，流体可以从该废液管路流 出至未示出的废液容器。

高压泵40与注射阀的高压端口15相连。色谱柱41可以与其它高压端 口14相连。高压泵40能作为组成部分被集成到进样器中，但也可以设置 在其它单元或单独的泵单元内。

注射阀3由定子1和转子2构成。定子1具有两个高压端口14、15、 两个进样环路端口13、16和废液口12。当然，代替所示的注射阀也可以 想到具有多于5个端口的注射阀来实现本发明。通过这些端口，注射阀3借 助可以呈毛细管连接形式的前述连接管路与HPLC系统的其它功能元件相 连。为了概览起见，图1未示出为此所需要的高压螺纹连接机构。为了简单 缘故示出了在定子1和转子2之间界面处的注射阀，在这里，既示出了定子 1端面的设计结构，也示出了转子2端面的设计结构，以方便理解工作方式。 注射阀3内，所述端口以孔状构成，它们通向定子1的另一侧。转子2具有 多个弧形槽21、23和25，它们准确对准进出口的孔。

转子2以压紧力被压到定子1上，从而形成在转子2和定子1之间的 共同界面，这两个部件在该界面处相互密封。此时如此设定该压紧力，即该 布置结构在预期最高压力下还是密封的。

在该设备的如图2所示的所谓平衡阶段中，控制阀或者说注射阀处于注 入位置，从而进样环路主动从泵按照朝向柱的方式利用溶剂被冲洗。整个设 备或者说进样器10的所需GDV(在方法改进中被确定或已设定的)利用活 塞53的定位在平衡时被调节出来(整个设备的GDV和计量装置5的附加 ΔGDV)。

在所示的实施例中，对此采用位置B，在该位置上，该计量装置具有泵 体积V_B。该体积已经包含进样器10的GDV(或者说其常见的GDV)的期望变 化ΔGDV(＝V_A)以及(在一随后时刻)期望的递增样品量V_Probe(＝V_B-V_A)，在此， 当然也可以想到在此时刻不包含样品体积的变型方式。

在平衡时改变的活塞定位和体积调节装置的随之而变的泵体积V导致 了变化的压力和流动(可能方式1)，在这里，体积变化在本发明的优选实施 方式中可通过调节流速来补偿，从而所述压力和流动还保持稳定(可能方式 2)。这种流速调节此时通过由控制单元60与计量装置5相反地相应控制该 泵40来进行。

接着如图3所示，阀3切换至压力平衡位置；在该位置上，连接件51 和第二连接件或者说进样环路的供应件52没有连通至连接于注射阀3上的 其它组成部分，并且进样环路被切换离开分析路径。该进样环路此时也具有 系统压力(大于500巴或甚至大于1500巴的高压)。

计量装置5的驱动机构55可以在一个变型(只在以下所述的方法1中需 要)中短暂向前移动，直到活塞53运动。此时，作用于活塞53的力或者驱 动机构55的力矩被测量和存储。它是用于进样环路中的压力(系统压力)的尺 度。在另一个变型中，该压力借助传感器来确定或监测，或者检测活塞位置 并且并被存储用于后面的应用。

接着，计量装置5通过将活塞位置从位置B改变到位置C或者说将泵体 积从V_B增大至即将达到大气压的V_C来给该进样环路“减压”。在此情况下， 所需要的活塞53行程可以通过测量在吸收先前样品时作用于活塞53的力 或者驱动力矩来求出，或者通过进样环路中的压力传感器来确定。

如图4所示，控制阀3接着切换至废液位置；在该位置上，通过计量装 置5排出对应于要吸收的样品量V_Probe(＝V_C-V_A)的溶剂量。

在图5所示的状态中，随后使样针42移入样品容器43，从而可以吸入 样品体积。对此，活塞53最初在位置A上并且被控制单元60控制用于位 置C的吸入。在此情况下，所期望的规定的样品体积V_Probe(＝V_C-V_A)被吸进该 吸入件44，在这里，样品体积最好小于吸入件44的体积，以便在泵体积内 不会进行样品流体与高压泵所输送的流体的混合。图5示出了吸入过程结束 后的HPLC系统的状态。

在如图5所示的阀门3的第一进样位置，使所述槽21、23和25对准 端口12-16，从而所述槽23和25将两个高压端口14、15或废液口12和 进样环路端口13相连。因此，在所述进样位置上，高压泵40将流体输送 向色谱柱41。另外，进样环路端口16被压力密封地封闭。

在吸收时，作用于活塞53的力或者计量装置5的驱动力矩可被测量， 其中，该驱动力矩或者活塞力在这里是用于大气压的尺度并且可以按照以上 针对“减压”所述的方式被利用。当然也可以想到用压力传感器来确定、监 测和/或针对后面的应用来存储该(大气)压力。

接着，控制阀3切换至压力平衡位置；在该位置上，该连接件51和第 二连接件或者进样环路的供应件52没有连通至其它的接设在注射阀3上的 组成部分。为了在进样环路内容物的压缩所需要的体积的输送过程中，不中 断经过色谱柱41的流动，在阀的转子2内的槽25相应延长构成，从而在 压力平衡位置上这两个高压端口14和15也还是连通的。

进样环路此时在一个变型(方法1)中被一直压缩，直至达到作为系统压 力尺度的、所积蓄(如上所述)的驱动力矩或活塞力。该压力于是又对应于系 统压力(高压)。不同于工作介质或溶剂的样品可压缩性可以在此情况下造成 最终的活塞位置有可能不在准确对应于活塞53的初始位置B。由此一来， 在小而可忽略不计的GDV的期望值GDV_soll偏差情况下，将进样环路准确预 压缩至系统压力。

在另一个可想到的变型(方法2)中，活塞53如图6所示又移动到初始位 置B并且由此压缩该进样环路。此时，与溶剂可压缩性相比的样品可压缩性 的偏差产生了与系统压力相比的小到可忽略不计的偏差。为此，所获得的 GDV准确对应于GDV的期望值GDV_soll。

为了能注入位于吸入件44内的样品体积，使样针42移入注样口45。 注样口耐高压地密封针尖。随后，控制阀或者说注射阀3切换至注入位置； 在该注入位置，被吸入的样品体积通过泵40所泵送的工作介质完全从吸入 件44被输送至柱41(注入)。如果对于色谱分析过程针对溶剂或工作介质经 历了梯度(随时间控制的工作介质混合比)，则有利地没有出现不希望有的延 迟。

在本发明的优选实施方式中，由预压缩引起的GDV偏差可以在注射之 后被再调整，在这里，活塞的正确运动(至位置B)通过相应调节流速来补偿。 由此一来，可以在精确预压缩情况下还获得准确的(设定或期望的)GDV_soll。 另外，也可行的是(尤其是如果压缩后的样品体积大于期望的GDV_soll)，在色 谱分析过程中再次调节期望的GDV_soll。

虽然在本实施例中并非显示如此，但当然也可以想到该GDV(不同于设 备特定GDV_ist)不仅在色谱分析过程之前而且在该过程中调节到或改变到期 望值GDV_soll。为此，可以通过控制装置60与计量装置5的变化相反地相应 控制该泵40，以将至该柱41的流速或者说体积流保持恒定。

可选地，可以在色谱分析过程结束时通过将活塞53调至位置0而将偏 差ΔGDV(＝GDV_soll-GDV_ist)和进而GDV或者说混合体积设定到最小值(最小泵 体积)，以缩短系统的且尤其是进样环路的冲洗时间。

附图标记列表

1       定子

2       转子

3       注射阀

5       计量装置

10      进样器或者说色谱设备

12      废液端口

13      第二进样环路端口

14      其它高压端口

15      高压端口

16      第一进样环路端口

21，23，25  槽

40      高压泵

41      分离柱

42      样针

43      储样容器

44      吸入件

45      注射端口

47      废液管路

50      注入器

51      第一连接件

52      供应件

53      活塞

55      驱动装置

60      控制单元

V       泵体积

V_A      在位置A处的泵体积

V_B      在位置B处的泵体积

V_C      在最终位置C处的泵体积

V_Probe   样品量

V_max    计量装置的最大体积

P_os.O   活塞最低位置

P_os.A   活塞的位置A

P_os.B   活塞的位置B

P_os.C   活塞的最终位置

GDV    整个设备的梯度延迟体积

GDV_ist  GDV的设备特定值

GDV_soll GDV的期望值

ΔGDV  由相应活塞位置引起的GDV偏差