一种玉米花粉减数分裂后发育调控基因Ms30的DNA序列及其编码蛋白

技术领域

本发明涉及一种玉米花粉发育调控基因Ms30及其编码蛋白序列，属于基因工程领域。

背景技术

配子体发育是植物生殖生长中的重要阶段。植物雄配子体的非正常发育会导致无法形成花粉或花粉生育力丧失，这一现象称为雄性不育（Male Sterile）。因此对雄性不育的研究有助于理解复杂的植物生殖生长过程。

玉米（Zea mays L.）是我国重要的禾本科粮食作物，因为其雌雄异花的特点而被视作植物生殖生长的理想研究对象。此外，具有雄性不育性的玉米自交系在杂交育种和商业化种子生产中具有不需要人工去雄、种子纯度高的优点，能够大幅降低育种科研和商业化种子生产的成本，提高育种效率。

本发明提供了一种控制玉米花粉发育基因的DNA序列及其编码的蛋白质序列的基因，该基因的功能缺失会造成玉米的雄花败育，由此可以产生新的雄性不育材料，在科研和农业生产中具有重要的应用价值。

发明内容

本发明提供一种新的调控玉米花粉发育基因Ms30的DNA序列、cDNA序列和该基因所编码功能蛋白的氨基酸序列，所述基因是一种植物雄穗特异性表达基因，所述基因功能的缺失会特异性导致玉米雄花不育。

  本发明的第一个发明目的是：提供一种调控玉米花粉发育的新基因Ms30，其特征在于，是选自如下1）或2）或3）或4）或5）的DNA分子：

1）SEQ ID NO. 1所示DNA分子（克隆自玉米自交系B73的基因组DNA）：该DNA分子由2370个核苷酸组成，-105至 -1为核苷酸为5’端非翻译区（5’-UTR），第+1至+648位核苷酸为第一外显子，+649至 +727位核苷酸为第一内含子，+728至+991位核苷酸为第二外显子，+992至+1723位核苷酸为第二内含子，+1724至+2001位核苷酸为第三外显子，+2002至+2265位核苷酸为3’端非翻译区（3’-UTR）；

2）SEQ ID NO. 2所示的DNA分子（克隆自玉米自交系B73的cDNA）：该DNA分子由1558个核苷酸组成，-105至-1位核苷酸为5’端非翻译区，第+1至+1227位核苷酸为编码区序列（Coding DNA sequence，CDS），+1228至+1453位核苷酸为3’端非翻译区；

3）在SEQ ID NO. 1基础之上经过一至数个碱基替换和\或一至数个碱基的插入和\或缺失以及大片段的核苷酸序列插入\缺失\移位\倒位所形成能够影响植物花粉生育能力的DNA分子；

4）在0.1×SSPE（或 0.1×SSC）、0.1％（w/v）SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜，能够与SEQ ID NO. 2的DNA分子杂交且编码植物花粉发育相关蛋白的DNA分子；

5）与SEQ ID NO. 2的DNA分子具有85%以上的同源性且编码植物花粉发育相关蛋白的DNA分子。

本发明的第二个发明目的是：提供上述基因所编码的调控植物花粉发育的相关蛋白质Ms30。

在一个实施方案中，所述基因编码如下1）或2）所述的蛋白质：

1）序列表的SEQ ID NO. 3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2）将序列表的SEQ ID NO. 3经过一个或数个氨基酸残基的取代、和/或缺失、和/或添加且具有影响植物花粉发育功能相关活性的蛋白质。

本发明的第三个发明目的是：提供含有所述基因和/或启动子的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

本发明的第四个发明目的是：提供上述基因用于转基因改良作物的用途。

在一个具体实施方案中，所述基因用于诱导作物植株雄性不育，以便导入外源基因以获得优质的转基因作物。

在一个具体实施方案中，所述改良包括产量提高、品质提高、抗病虫害、抗逆、抗倒伏等生长性状的改良。

在另一具体实施方案中，所述作物是自花授粉或异花授粉作物。

在一个更加具体的实施方案中，所述作物包括但不限于玉米、小麦、高粱、水稻。

本发明的第五个发明目的是：提供了一种在其它植物中获取Ms30基因的直系同源基因的方法，以及利用该方法获高粱（Sorghum bicolor）、小米（Setaria italica） 、短柄草（Brachypodium distachyon）、水稻（Oryza sativa） 的氨基酸序列（图12）。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：本发明提供的玉米花粉发育调控基因Ms30直接参与小孢子时期的花粉发育调控，该基因的表达受到抑制后，小孢子细胞壁发育受到抑制，同时花粉囊绒毡层组织细胞发生降解，并最终导致在小孢子发育末期的细胞凋亡和花器官的雄性不育现象。通过植物生物技术途径，本发明在农作物的杂种优势利用和不育化杂交种制种生产中都将发挥重要作用。

术语定义

术语“调控植物花粉发育的基因”指一段具有编码蛋白能力的核苷酸序列，该序列特异编码具有调控植物花粉发育功能的蛋白活性多肽，如SEQ ID NO. 2的第106-1332位核苷酸序列及其简并序列。

术语“简并序列”是指，位于SEQ ID NO. 2的编码框第106-1332位核苷酸序列中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO. 2的第106-1332位核苷酸序列同源性低至约70%的简并序列也能编码出SEQ ID NO. 2所编码的氨基酸序列。

所述“调控植物花粉发育的基因”，还包括在中度严格条件下，更佳的在高度严格条件下可以与SEQ ID NO. 2的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。其中，中度严格条件可以是0.1×SSPE（或0.1×SSC）、0.1％SDS（w/v）的溶液中，65°C条件下杂交并洗膜的条件。

所述“调控植物花粉发育的基因”，还包括与SEQ ID NO. 2中从第106-1332位核苷酸序列的同源性至少70%，较佳地具有至少80%、82%、85%、86%、88%、89%同源性，更佳地具有至少90%、91%、92%、93%、94%同源性，最佳地具有至少95%、96%、97%、98%、99%同源性的核苷酸序列。

所述“调控植物花粉发育的基因”，还包括能编码具有与天然的调控玉米花粉发育基因Ms30基因相同功能蛋白的、SEQ ID NO. 2开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括（但并不限于）：1个或几个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’-UTR或3’-UTR端添加1至数个核苷酸。

所述“调控植物花粉发育的基因”，还包括能够翻译一类具备调控玉米花粉发育功能的氨基酸序列，如SEQ ID NO. 3的氨基酸序列。该类氨基酸序列还包括具有与天然调控玉米花粉发育蛋白相同功能的SEQ ID NO. 3的变异形式。这些变异形式包括（但并不限于）：1个或几个氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或几个氨基酸。在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能；在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。

另外，所述的“调控植物花粉发育的基因”的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本实施例公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员己知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增得到有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，可以用重组法来大批量地获得有关序列。通常是将其克隆入载体，然后细胞转化等常规方法从增殖的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可通过化学合成将突变引入实施例蛋白序列中。除了用重组法产生之外，实施例蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成多肽而加以生产。在体外合成蛋白质可以用人工或自动进行，可以分别化学合成实施例蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的蛋白质分子。

附图说明

图1为正常发育的玉米B73和Ms30基因突变体ms30-6028的配子体在小孢子发育早期的观察（黑色标尺代表30微米）：A，野生型B73雄配子体在早期大液泡小孢子期的形态；B，Ms30基因突变体ms30-6028雄配子体在早期大液泡小孢子期的形态；C，Ms30基因突变体ms30-6028雄配子体在中晚期大液泡小孢子期的形态；D，Ms30基因突变体ms30-6028雄配子体在晚期大液泡小孢子期的形态。

图2为Ms30基因的遗传定位结果：基因被定位在4号染色体（标记idp1991和tidp9194之间）。

图3为Ms30基因的物理定位结果：基因被精细定位在41.2Kb的物理区间内（标记ep462和tidp3747之间），矩形所示为区间内的功能基因，箭头代表基因翻译方向，黑色框代表候选基因GRMZM2G174782。

图4为野生型B73中Ms30的基因结构示意图：A，Ms30基因在野生型B73中的基因结构，由2370个核苷酸组成，-105至 -1位核苷酸为5’端非翻译区（5’-UTR），第+1至+648位核苷酸为第一外显子，+649至 +728位核苷酸为第一内含子，+729至+991位核苷酸为第二外显子，+992至+1723位核苷酸为第二内含子，+1724至+2001位核苷酸为第三外显子，+2002至+2265位核苷酸为3’端非翻译区（3’-UTR）；B，Ms30基因在野生型B73中cDNA的结构示意图，-105至-1位核苷酸为5’端非翻译区，第+1至+1227位核苷酸为编码区序列，+1228至+1453位核苷酸为3’端非翻译区。

图5为Ms30基因的DNA编码序列在野生型B73和突变体ms30-6028中的比较结果：矩形标注处为核苷酸插入或缺失发生的位置，突变基因在1、2、4处分别插入了1、3、9个碱基，在第3处突变缺失了4个碱基。

图6为Ms30基因预测编码的蛋白质氨基酸序列在野生型B73和突变体ms30-6028的比较结果，矩形框注为GDSL-Lipase结构域；

图7为利用引物5和引物6在基因组DNA中扩增的PCR产物，经浓度2%琼脂糖凝胶电泳鉴定不育突变特异的分子量条带（黑色箭头标注为可育基因型和不育基因型的特异扩增条带）：M，DNA Ladder ；1，B73；2，昌7-2；3，纯合不育株（基因型ms30-6028/ms30-6028）；4，杂合可育株（基因型Ms30/ms30-6028）。

图8为野生型B73和突变体ms30-6028在雄配子体发育处于晚期大液泡小孢子期的花粉囊石蜡切片（黑色标尺代表30微米）：A，B73的花粉囊切片；B，突变体ms30-6028的花粉囊石蜡切片。

图9为Ms30基因在B73中的半定量反转录PCR的表达谱分析：EV，早期大液泡小孢子时期雄穗；LV，后期大液泡小孢子时期雄穗；H，抽雄期雄穗；Leaf，叶片； Ear，幼嫩雌穗；Root，根；Tassel标注的三个泳道代表检测样品来自不同时期雄穗总RNA转录的cDNA。

图10为Ms30基因在B73不同发育时期雄穗的表达检测：IMT，未成熟雄穗；Q，小孢子母细胞减数分裂四分体时期雄穗；EV，早期大液泡小孢子时期雄穗；MV，中期大液泡小孢子时期雄穗；LV，后期大液泡小孢子时期雄穗；Heading，抽雄期雄穗。

图11为利用实时荧光定量PCR对Ms30基因在纯合不育突变体ms30-6028/ms30-6028和杂合可育Ms30/ms30-6028植株的不同发育时期雄穗中表达量差异的分析结果：白色柱子为杂合可育植株（Ms30/ms30-6028），灰色柱子为纯合不育突变体（ms30-6028/ms30-6028）；Q，小孢子母细胞减数分裂四分体时期雄穗；EV，早期大液泡小孢子时期雄穗；MV，中期大液泡小孢子时期雄穗；LV，后期大液泡小孢子时期雄穗；VP，大液泡花粉粒期。

图12为玉米Ms30基因翻译的氨基酸序列与其在高粱、 小米、水稻、短柄草中直系同源基因翻译产物的比较结果，框注内为GDSL-Lipase结构域。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明的应用范围。下述实施例中的所有技术和科学术语，如无特殊说明，均为本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同含义。除非有相反指明，本发明所使用或提及的技术均为本领域普通技术人员公认的标准技术。所述试验材料，如无特别注明，均为本发明领域通用的试验材料。下述实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。材料、方法和实施例谨作阐述用，而非加以限制。

本发明所述的雄性不育，特指由植物细胞核基因发生功能变化导致植物雄花发育出现异常（无法产生雄花、花药或者正常的雄性配子体）并出现育性的丧失，即通常所说的雄性核不育（Genic male sterility）而非细胞质核不育（Cytoplasmic male sterility）。雄花育性的异常和恢复均由细胞核内的基因加以控制。

因此，本发明也包括利用序列表所述序列调控植株的雄配子生育能力，即利用本发明提供的基因序列在基因组、和/或转录组、和/或蛋白质组水平影响其它植物中相同或同源基因的功能来达到控制雄花育性的目的。例如，下述方法但不限于下述方法：通过天然序列的变异导致基因表达抑制或蛋白质功能的丧失、通过向植物中转入所述基因的反义序列或引入发卡结构、或将所述基因与其它序列（DNA或RNA）相结合产生新的具有功能活性的DNA或RNA链，来影响或改变植物基因的功能。或其它本领域技术人员已知的可用于影响植物雄花育性的技术方法中的任何一种技术方法。

本发明包括玉米Ms30基因，其显性等位基因对植物雄花育性具有关键作用，功能缺失性的隐性等位基因会导致雄性不育。该基因位于玉米4号染色体，其基因具体位置如图2、图3所示。

该基因序列及其同源序列可从任何显花植物中获得，包括但不限于玉米（Zea mays）、普通小麦（Triticum aestivum）、高粱（Sorghum bicolor）、水稻（Oryza sativa）、短柄草（Brachypodium distachyon）、小米（Setaria italica）、大麦（Hordeum vulgare）、黑麦（Secale cereale）、粗山羊草（Aegilops tauschii）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）、甘蓝（Brassica oleracea）、大豆（Glycine max）、番茄（Lycopersicon esculintum）等。获得方法包括但不限于：通过玉米Ms30基因序列利用blastx、blastn或通过氨基酸序列利用blastp从其它植物的基因组序列数据库、和/或cDNA序列数据库、和/或蛋白质序列数据库中调取；以Ms30基因的DNA或cDNA或RNA序列为参考序列设计引物，直接从其它植物的基因组DNA或cDNA或RNA中利用PCR的方法直接获得；以玉米Ms30的基因序列设计探针，利用核酸杂交的方法从基因组文库中分离含有同源基因序列的DNA或cDNA或RNA片段。

“Ms30基因同源序列”指在与SEQ ID NO. 3的氨基酸进行blastx比较分析后，Identities大于或等于35%、Positives大于或等于50%，且识别区域位于SEQ ID NO. 3的200至300位氨基酸即GDSL结构域内的植物基因的DNA序列。进行blastx时，所有参数均遵照http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/所示的默认设置进行。

下文通过说明和阐述提供了更为详细的描述，但这并非意欲对本发明的范围加以限制。

实施例1. Ms30基因突变体的鉴定和基因精细定位

雄性不育是由于控制雄花发育的基因发生变异导致雄花败育，通常表现为没有雄花或雄花花药干瘪、花药中没有花粉或只有有少量非正常发育的花粉。与育性正常的植株的小孢子时期的雄配子体（图1.A）相比，ms30突变植株的小孢子细胞壁在早期液泡小孢子期发育缓慢，并且能够观察到萌发孔出现异常（图1.B），之后小孢子内形成大液泡并伴随细胞质的降解（图1.C），最终在花药中只能够观察到空憋的小孢子细胞壁，其细胞核、细胞质等内容物已经完全降解（图1.D），从而导致突变体育性的丧失。

以昌7-2为父本、Ms30基因隐性不育突变体ms30-6028（天然突变体，选自专利权人单位北京首佳利华科技有限公司收集的玉米育种材料）为母本，构建了F₂分离群体。2013年夏季种植于北京育种基地。按上述性状特征对其进行育性调查，选取了118株表现雄性不育表型的单株构建不育基因池，采用集团分离分析法（Bulk-segregant analysis，BSA）对突变位点进行遗传分析。

已有研究发现，ms30位点位于4号染色体长臂（参考文献1-4）。基于maizeGDB（http://www.maizegdb.org/）中标记数据库信息，选取5个多态性SSR分子标记（表1），通过对118株不育单株进行PCR扩增和凝胶电泳分析，检测不育基因与标记的遗传关系。结果显示这5个分子标记在不育基因池中超过70%的单株表现出与不育基因供体ms30-6028一致的基因型（表1），表明这5个分子标记与ms30位点紧密连锁。

表1. 

2013年冬季在海南南繁基地种植了F₂群体（284株），对其进行育性调查，可育表型和不育表型单株比例为215:69，符合3:1的单基因分离比（χ²=0.784， df=1，χ²_0.05=3.84）。基于表1信息从maizeGDB中调取了umc1808至umc2046之间的9对多态标记（含umc1808和umc2046）对该F₂群体单株进行了基因型鉴定，构建了ms30区间的连锁图谱，并根据单株的育性数据将ms30定位于idp1991至tidp9194之间2.9cM的区间内（图2）。进一步调取B73基因组序列设计了多态标记ep462（表2），最终将ms30定位在ep462和tidp3747（标记来自maizeGDB）之间41.2Kb的区间内。

表2. 

从Maize GDB调取B73的基因组序列，在去除假基因和转座子序列后，在该41.2Kb区间共有6个功能基因（图3），其中一个预测为GDSL脂肪酶家族基因GRMZM2G174782具有与花器官发育相关的功能。基于玉米B73基因组序列信息，该基因全长2370bp（SEQ ID NO. 1），与玉米B73基因组序列进行blastn分析，表明其在玉米基因组内为单拷贝基因。对野生型B73中的基因组序列（SEQ ID NO. 1）、cDNA序列（SEQ ID NO. 2）的比对分析（图4），发现该基因的基因组序列结构特征如下（图4.A）：含有3个外显子（Exon）和2个内含子（Intron），-105至 -1位核苷酸为5’端非翻译区（5’-UTR），第+1至+648位核苷酸为第一外显子，+649至 +728位核苷酸为第一内含子，+729至+991位核苷酸为第二外显子，+992至+1723位核苷酸为第二内含子，+1724至+2001位核苷酸为第三外显子，+2002至+2265位核苷酸为3’端非翻译区（3’-UTR）。该基因的蛋白质编码区序列长1227bp（图4.B）。

通过基因cDNA序列（SEQ ID NO. 2）进行模拟翻译，该基因编码一个408个氨基酸的蛋白，将该蛋白序列与GenBank SwissProt蛋白质数据库进行blastx分析，显示该蛋白含有一个GDSL-lipase保守结构域。文献报道GDSL脂肪酶家族广泛参与了花器官的发育和形态建成，因此选取该基因作为Ms30的候选基因进行后续分析。

实施例2. Ms30基因在突变体中的克隆

引物1（5’-CCGCCAACATTCAATCCATTCCG-3’）和引物2（5’-TCTCTTAACGCACCGCCCGTA-3’） 可用于在B73和Ms30位点的隐性突变体ms30-6028中特异克隆GRMZM2G174782基因。同时，用引物3（5’-TTCCCGGGATGGCGCTCCTCCTCCTCCTC-3’）和引物4（5’-AGGGATCCCTAAATAAGAGTGGTCTCC-3’）在突变体和B73的花器官cDNA中扩增全长编码区，对上述基因组中的扩增片段进行验证。所有PCR扩增均使用KOD FX DNA Polymerase（TOYOBO CO.，LTD. Life Science Department， Osaka，Japan），并按照产品说明的反应体系和条件，在Bio-radMyCycler PCR仪进行PCR扩增。PCR产物送往上海生工生物工程公司进行测序。

测序获得了ms30-6028的突变基因序列与B73的野生型Ms30基因序列，二者进行比较可发现，它们的蛋白质编码序列存在4处核苷酸的插入或缺失（图5） ： 突变基因在1、2、4处分别插入1、3、9个碱基，在第3处突变缺失了4个碱基。

实施例3. Ms30基因在玉米野生型B73和突变体ms30-6028中编码蛋白的序列差异

如图6所示：Ms30基因在野生型B73中编码408个氨基酸的蛋白，其中209-295位氨基酸构成了GDSL-Lipase结构域；Ms30基因在突变体ms30-6028中编码蛋白为319个氨基酸，在序列148位核苷酸的变异（图5黑色剪头标注处）导致了第50位氨基酸发生改变（图6），而突变体序列发生的4处核苷酸的插入或缺失（图5）则造成60位之后的氨基酸变异并且使突变体编码的蛋白不再具有任何功能结构域（图6）。这表明Ms30基因在突变体中的序列变异直接导致了翻译氨基酸的序列变化和翻译的提前终止，特别是基因的GDSL-Lipase结构域被破坏。

Ms30基因的功能缺失型突变体ms30-6028表现雄配子的败育，这证明了具有SEQ ID NO. 1所述DNA序列的Ms30基因具有控制玉米雄性生育力的功能，当SEQ ID NO. 1、2所示序列发生一至数个碱基替换和\或一至数个碱基的插入和\或缺失以及大片段的核苷酸序列插入\缺失\移位\倒位导致SEQ ID NO. 1的序列结构和功能发生变化时，将导致玉米雄性生育力的丧失。

实施例4. Ms30基因突变体花粉囊发育观察

基于突变基因的测序结果，使用引物5（5’-AGGCGAACGAGCTGATCCAA-3’）、引物6（5’-GCCTCCCTCGTCTCCTCGAAC-3’）的组合能够在基因组DNA中特异鉴定携带ms30-6028突变位点的植株，如图7所示：经2%琼脂糖凝胶电泳，在携带Ms30纯合可育位点的B73和昌7-2中能够检测到991bp左右的条带，携带ms30-6028纯合不育位点的植株则特异检测到410bp的条带，能够同时检测到上述2种条带的为杂合可育植株。

使用上述引物组合在苗期鉴定ms30-6028/ms30-6028基因型的纯合隐性突变植株。在抽雄之前的10天提取这些植株雄穗的小花，在卡诺固定液（酒精：冰乙酸＝3:1）中固定48小时，再经1%醋酸洋红（1g洋红溶于100ml 45%醋酸）染色进行细胞遗传学观察，确定准确的发育时期。选取小孢子细胞发育处于大液泡晚期小花制备石蜡切片进行观察。可以发现，野生型B73植株在此时期仍然能够观察到明显的绒毡层细胞（图8. A 白色箭头所示），而携带纯合ms30-6028/ms30-6028位点的突变体植株的绒毡层细胞已经完全分解（图8. B白色箭头标注）。

实施例5. Ms30基因在B73及突变体中的转录水平分析

分别采集B73各个发育时期雄穗，每个完整雄穗取一半经液氮速冻保存，用于提取雄穗小花的总RNA，剩余雄穗的小花在卡诺固定液（酒精：冰乙酸＝3:1）中固定48小时，再经1%醋酸洋红（1g洋红溶于100ml 45%醋酸）染色进行细胞遗传学观察，确定准确的发育时期。选取处于未成熟雄穗期（Immature tassels，IMT）、减数分裂四分体时期（Quartets，Q）、早期大液泡小孢子期（Early-vacuolate microspore，EV）、中期大液泡小孢子期（Mid-vacuolate microspore，MV）、晚期大液泡小孢子期（Late-vacuolate microsoire，LV）、抽雄期（Heading）六个雄穗发育时期的B73雄穗的小花总RNA，用于Ms30基因的表达谱分析，另外提取B73减数分裂期植株的叶片、根以及抽雄期的幼嫩雌穗总RNA，用于分析基因在不同组织中的表达水平。

使用实施例所述诊断标记在苗期鉴定纯合隐性ms30-6028位点的不育单株和相同遗传背景下携带杂合Ms30/ms30-6028位点的可育植株，用相同方法分别提取不育株和可育植株的未成熟雄穗期、减数分裂四分体时期、早期大液泡小孢子期、中期大液泡小孢子期、大液泡花粉粒期（Vacuolate pollen，VP）五个雄穗发育时期的雄穗小花总RNA（所有雄穗均提前经细胞遗传学观察，确定准确的发育时期）。

每一个样本均采取半定量反转录PCR（Semi-quantitative Reverse Transcription PCR，qRT-PCR）和实时定量PCR（Real-time PCR，RT-PCR）两种方法进行Ms30基因的表达量检测。qRT-PCR和RT-PCR均以ZmActin基因作为内参报告基因，引物5和引物6（序列同上）用于特异检测Ms30基因和ms30-6028突变基因的表达水平，引物OGF49（5’-GGCCACAAGCTGCTCAACCT-3’）、OGF50（5’-ATGTGGTTGCCCAGGGACTT-3’）用于检测ZmActin基因的表达。RT-PCR中每个样品的Ms30基因和ZmActin基因的PCR反应均设置3个独立重复实验。

一、Ms30基因在B73中的表达谱分析

 Ms30基因是一个雄穗特异表达基因，且仅在特定的生理时期（发育期雄穗）行使功能。qRT-PCR结果显示，除雄穗外，在其它组织中均未检测到Ms30基因的表达（图9）；此外，RT-PCR结果显示在雄穗中，Ms30基因从减数分裂四分体时期的雄穗中始观察到微弱表达，至早期大液泡小孢子时期其表达量明显增强，之后其表达量开始降低，在抽雄期成熟花粉中几乎很难检测到明显的表达（图9）。

二、Ms30基因在突变体中的差异表达检测

 Ms30基因在ms30-6028突变体中的表达明显被抑制，RT-PCR的结果如图10所示：Ms30基因在纯合不育的ms30-6028植株中的表达均显著低于同时期携带杂合Ms30/ms30-6028位点的可育植株，尤其在早期大液泡小孢子时期，ms30-6028突变体中Ms30基因的表达量非常微弱。

在早期大液泡小孢子期，不育突变体ms30-6028的小孢子细胞壁表现如图1. B所示的发育抑制现象。此时期Ms30基因在不育突变体ms30-6028的表达与携带正常的Ms30基因的Ms30/ms30-6028植株相比，表达明显降低，即如图10所示。表明Ms30基因在发生如图5中所示变异后，除编码氨基酸发生如图6所示变化外，基因在早期大液泡小孢子期的表达也将发生改变，进而影响Ms30基因的功能，并最终导致小孢子细胞发育异常。

实施例6. Ms30基因在玉米、高粱、小米、水稻、短柄草中的同源性分析

如前文所述，Ms30基因在玉米中特异调控雄穗的配子体发育。当其功能被抑制时将导致玉米雄配子体育性丧失即雄性不育。利用Ms30基因的cDNA序列，通过blastx在genebank获得了该基因在高粱、小米、水稻、短柄草中的直系同源基因（编号分别为：SORBIDRAFT_05g001770、Os12g03280、XP_004980114.1、XP_003577108.1）。

如图12所示，Ms30基因在玉米、高粱、小米、水稻、短柄草的200-300位氨基酸表现出高度保守性，而这一区域正是GDSL-Liplase结构域的位置，在310位后的氨基酸变异较大。据此可以判断，Ms30在其它植物中同样存在，并且在关键结构域上保持保守性的特点。即该基因对植物保持正常的雄配子生育力具有关键作用，是必不可少的，当基因发生序列变异时会极大地影响植物的雄配子育性。

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<170>  PatentIn version 3.5

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<211>  2370

<212>  DNA

<213> Zeamays

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Met Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Leu Leu Arg Ser Ala Ala Ser Ala

1               5                   10                  15     

Gly Ala Gly Ala Glu Pro His Arg Ser Pro Ala Thr Ala Leu Phe Val

            20                  25                  30          

Leu Gly Asp Ser Thr Val Gly Cys Ala Ala Ala Thr Ala Ser Ser Ile

        35                  40                  45             

Leu Ser Leu Asn Leu Thr Thr Thr Thr Thr Thr Leu Pro Ser Ser Leu

    50                  55                  60                  

Ser Gly Glu Pro Cys Leu Phe Phe His Glu Ala Arg Leu Arg Val Pro

65                  70                  75                  80 

Asp Leu Leu Ala Ala Lys Met Gly Leu Pro Ser Pro Pro Pro Ile Ser

                85                  90                  95     

Ala Leu Asn Gly Thr Ala Ser Ala Ala Ala Arg Gly Val Asn Phe Gly

            100                 105                 110        

Gly Gly Gly Gly Gln Leu Leu Phe Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Val Arg

        115                 120                 125            

Gly Pro Ala Ser Val Phe Leu Thr Gly Ala Val Gly Gln Gln Val Arg

    130                 135                 140                

Leu Ala Ser Glu Thr Leu Gln Leu Leu Arg Leu Glu Ala Ala Ala Pro

145                 150                 155                 160

Gly Glu Pro Ser Ser Ser Pro Ala Ala Val Phe Val Leu Ser Phe Gly

                165                 170                 175    

Ala Asp Ala Tyr Ala Arg Leu Leu Ala Arg Gly Pro Ala Glu Ala Ala

            180                 185                 190        

Ala Ala Ala Pro Lys His Gly Arg Arg Gly Leu Ala Arg Leu Leu Ala

        195                 200                 205            

Asp Arg Val Ala Arg Ala Val Ser Glu Leu Tyr Glu Ala Gly Ala Arg

    210                 215                 220                

Arg Val Ala Val Met Gly Val Pro Pro Leu Gly Cys Ala Pro Arg Val

225                 230                 235                 240

Val Trp Glu Arg Ser Ser Pro Val Arg Asp Gly Gly Ala Gly Cys Val

                245                 250                 255    

Glu Glu Ala Asn Glu Leu Ile Gln Gly Tyr Asn Gly Arg Leu Ala Ala

            260                 265                 270        

Arg Leu Asp Glu Leu Arg Leu Ala Leu Ala Gly Ala Asp Val Val Phe

        275                 280                 285            

Cys Asp Val Tyr Lys Gly Met Met Glu Ile Ile Ser Asn Pro Thr Thr

    290                 295                 300                

Val Arg Gly Asp Glu Gly Gly Met Leu Arg Ala Gly Ala His Glu Gly

305                 310                 315                 320

His Gly Gly Leu Arg Gln Gln Gly Asp Gly Val Arg Arg Ala Gly Ala

                325                 330                 335    

Pro Arg Val Val Gly His Leu Gln Pro His Gly Gly Arg Gly Cys Pro

            340                 345                 350        

Arg Asp Gln Leu Val Leu Val Val Gly Arg Leu Arg Arg His Gln His

        355                 360                 365            

Leu Arg Pro His Leu Ser Ala Ala Ala Gly Cys Ser Val Ala Val Ala

    370                 375                 380                

Ala Gly Gly Val Gly Thr Asn His Ser Leu Tyr Leu Val His Ser Tyr

385                 390                 395                 400

Tyr Pro Pro Glu Thr Thr Leu Ile

                405