牡丹营养器官内生细菌的分离纯化方法、培养基及其制备方法

技术领域

本发明涉及植物内生菌分离培养技术，具体涉及牡丹营养器官内生细菌的分离纯化方法，以及分离纯化操作中使用的培养基及其制备方法。

背景技术

植物内生菌一般是指生活史的某一阶段生活在植物组织内，对植物生长发育没有引起明显病害症状的一类微生物，如真菌、细菌、放线菌等。植物内生菌往往是植物在特定生境中不同类型微生物经过长期的协同进化形成的一种稳定的共生或寄生关系，内生菌一些生理活性特征与土著微生物类群往往存在差异，是筛选特定菌株、产功能酶菌株或农业生防菌株的良好材料来源。近年来，关于植物内生菌的文献报道逐渐增多。

目前，细菌分离培养基最为经典和通用的是牛肉膏蛋白胨培养基，其配方如下：牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl5g/L，琼脂粉15～20g/L，蒸馏水定容至1000mL，自然pH7.0～7.2，121℃高压蒸汽灭菌20min。该培养基应用极为广泛，为各种材料细菌的分离培养做出了重要贡献。但随着微生物科学研究领域的不断拓展和深入，传统的细菌培养基配方及其制备方法也面临一些窘境，突出的问题主要表现在以下几个方面：(1)培养基配方缺乏持续创新，单一配方经过长期反复使用，使得细菌筛选时菌株的多样性受到严重制约；(2)在使用特殊材料筛选细菌时，传统的细菌培养基配方并没有很好的针对性，往往达不到理想的试验效果，如昆虫内生细菌、植物内生细菌等；因为缺乏培养基创新，因重复筛选造成的试验耗材及试验时间的浪费也成为一个不可小觑的问题。

在一些文献报道中，细菌培养基配方有时也会做一些调整，但根本性的调整并不多，所以，微生物研究中常见菌的重复筛选已经成为制约相关试验研究的瓶颈问题。资料显示，微生物资源的多样性，远没有得到充分的开发和利用，人们所能分离培养的微生物种类仅占总量的1～2％，足见不断创新和改良培养基的必要性和重要的现实意义。

牡丹Paeoniasuffruticosa隶属于毛茛科Ranunculaceae芍药属，牡丹花雍容华贵，气势奔放，被誉为“花中之王”。牡丹产业发展迅速，在栽培、观赏、药用、瓷艺、精油、化妆品、膳食等方面均已得到长足发展，形势喜人。但关于牡丹内生菌方面的研究鲜见报道，营养器官内生细菌方面的研究更是空白，因此创新牡丹内生细菌分离的培养基配方，明确牡丹内生细菌分离培养基配方及其制备技术，不仅能拓展微生物资源筛选途径，为下游研究提供技术支撑，还能提高牡丹内生细菌筛出菌株的多样性，丰富牡丹内生菌开发利用理论，尽量减少不必要的重复筛选，为稀有种类的筛出提供更多可能，意义重大。

发明内容

本发明的目的是提供一种专门针对牡丹营养器官内生细菌的分离纯化培养基。

同时，本发明还提供一种上述分离纯化培养基的制备方法。

最后，本发明还提供一种牡丹营养器官内生细菌的分离纯化方法。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：

牡丹营养器官内生细菌的分离纯化培养基，每1000mL培养基的组成为：金蝉干粉1.5～2.5g，酵母粉4～6g，吉兰糖胶1.5～2.5g，海藻糖0.2～1g，菊糖0.1～1g，NaCl8～10g，牡丹根际土壤浸提液150～250mL，琼脂粉14～18g，余量为蒸馏水。

金蝉干粉为金蝉老熟若虫经灭菌、干燥、破碎处理后得到的粉末。其中灭菌、干燥、破碎处理均可采用本领域常规操作，比如干燥可焙干、烘干或冻干。具体的，金蝉干粉可参照下述步骤制备：取金蝉老熟若虫若干，121℃条件下高压蒸汽灭菌20min，再置于恒温干燥箱中90℃条件下过夜烘干，取出剪去前足后，用研钵研碎至无明显颗粒，过160～180目筛，即得金蝉干粉。

牡丹根际土壤浸提液即牡丹根际土壤加水浸提后得到的提取液，比如每500mL水中加入200～400g牡丹根际细土，浸提操作为本领域常规技术。具体的，牡丹根际土壤浸提液可参照下述步骤制备：取牡丹根际土壤若干，(手工)去杂后过40～60目筛得根际细土，取300g根际细土置于1000mL三角瓶中，加入500mL蒸馏水，于室温、220r/min下摇床振荡2h，之后静置30min，将上清倒入砂芯过滤器过滤，滤液即为牡丹根基土壤浸提液。

优选的，牡丹营养器官内生细菌的分离纯化培养基，每1000mL培养基的组成为：金蝉干粉2g，酵母粉5g，吉兰糖胶2g，海藻糖0.5g，菊糖0.3g，NaCl9g，牡丹根际土壤浸提液200mL，琼脂粉16g，余量为蒸馏水。

牡丹营养器官内生细菌分离纯化培养基的制备方法，包括以下步骤：

1)将海藻糖0.2～1g、菊糖0.1～1g加入蒸馏水中，于98～105℃条件下高压蒸汽灭菌20～30min，静置，再于98～105℃条件下高压蒸汽灭菌20～30min，得溶液A备用；

2)将金蝉干粉1.5～2.5g、酵母粉4～6g、吉兰糖胶1.5～2.5g、NaCl8～10g、琼脂粉14～18g和牡丹根际土壤浸提液150～250mL加入蒸馏水中，灭菌，得溶液B备用；

3)将溶液A、溶液B混合后定容至1000mL，即得。

步骤1)中静置可采用37℃恒温静置，静置时间为18～30h(优选24h)，其是为了给经过第一次灭菌后未被杀死的耐高温芽孢菌复苏生长的时间，芽孢抗高温能力强，经过第一次热刺激后，会复苏生长，处于生长状态的菌体经过第二次灭菌处理则很容易被杀死。

步骤1)、2)中蒸馏水均可适当取用，两次用量之和不超过1000mL即可。

步骤2)中金蝉干粉、牡丹根际土壤浸提液的制备同上。

步骤2)中灭菌前可调节混合液pH值至中性。

步骤2)中灭菌为常规灭菌操作，即121℃条件下高压蒸汽灭菌20～30min。

步骤3)中混合、定容操作均要求在无菌条件下进行，定容用蒸馏水要求无菌。

牡丹营养器官内生细菌的分离纯化方法，包括以下步骤：

1)取牡丹当年生健康营养器官(如根、茎、叶，根茎可剪成小段)，冲洗净，将非正常裸露的部位用融化的石蜡封口(如根、茎的两端及叶的叶柄切口处)，再用无菌水冲洗；

2)转入浓度65～75％乙醇溶液中进行表面消毒处理(3～10min)，再用0.05～0.15mol/L升汞消毒(3～5min)，(无菌操作条件下)将封口的石蜡剪去，剩余部分破碎处理后，静置沉淀，取上清液接种到牡丹营养器官内生细菌的分离纯化培养基中，30～35℃条件下恒温培养(2～3天)；

3)挑取单菌落(要求差异明显、特征典型)，分别进行划线纯化(每个单菌落连续划线纯化3次以上)，得到不同单菌落的活体纯培养物。

步骤2)中采用浓度70％乙醇溶液和0.1mol/L升汞。

步骤3)后可采用菌落特征、常规生理生化指标测定和16SrDNA序列分析相结合的方法，对得到的典型菌株进行初步鉴定。

本发明的有益效果：

不同的培养基配方适合不同的微生物种类生长，用料成分的差异，甚至是微量成分的调整，都会使筛出菌株的数量和类型有所不同，没有任何一种培养基能够同时满足所有微生物的生长需求，对于特殊生境的微生物种群来说，要想达到理想的分离和培养效果，创新和完善筛选培养基配方，是一项无法规避的重要工作。本发明通过不断的探索、优化，摸索出一种专门针对牡丹营养器官内生菌分离培养的培养基配方，经试验证明对内生细菌具有良好的分离和培养效果。

在本发明中，将金蝉老熟若虫干粉引入培养基，是基于金蝉若虫在地下一般经历2～3年，甚至长达12～13的生长发育时间，期间以吸食植物根部汁液为食，经过长时间的营养积累，最终作为一个能量的储存体成为一个老熟若虫。有资料显示，每100g金蝉若虫富含蛋白质72g、脂肪15g、灰分1.8g，还含有钙、磷、铁和多种维生素、氨基酸等，因此金蝉是制备细菌微生物培养基的良好用料。在培养基中金蝉干粉营养物质与配方中的酵母粉互为补充，旨在满足内生细菌对营养的需求。

菊糖是果糖通过β-(2→1)键连接而成的寡糖或多糖存在形式，且终端含有一个葡萄糖分子。从分子结构上来说，添加菊糖更加有利于具有不同糖源(或碳源)利用能力的微生物的生长，其广谱性要高于单一使用其他形式的单糖、寡糖和多糖。在微生物培养基中添加菊糖有利于保持试验样品本底微生物的多样性。除结构上的特殊性外，菊糖还具有良好的保湿性和热稳定性，这都对提高培养基的品质具有直接的影响，因此菊糖是良好的细菌培养基用料。

培养基配方中添加的吉兰糖胶和海藻糖均既有提供能源、刺激细胞生长的作用，还有非特异性保护作用，其主要作用原理是二者具有防治菌体细胞干燥脱水、稳定新陈代谢的独特作用。所以吉兰糖胶和海藻糖对保护弱势菌株、降低菌体死亡率和增强适应性方面具有积极的意义，尤其是对植物内生菌的筛选具有更加明显的作用。

培养基中配合使用牡丹根际土壤浸提液是基于平衡营养的考虑，尤其是对微量元素的平衡。牡丹根际土壤浸提液是一种更加接近于牡丹内生菌生长的天然营养液，它的添加对保存和提高牡丹内生细菌代谢的生理活性和存活几率也起着辅助作用。

在牡丹营养器官内生细菌的分离和培养过程中，内生细菌生境渗透压的改变是难以避免的，为了缓冲渗透压剧烈改变对菌体生长的影响，特意将培养基中氯化钠成分控制在生理盐水的离子浓度9％左右，以利于保护更多内生细菌的生长。

本发明中培养基整体上用料搭配精当，在核心成分的选择上有独到之处，既适合细菌的分离培养，也可用于划线纯化，实际使用效果良好。与传统培养基相比，可鉴定出的菌株种类丰富，多样性优势明显。另外，对其他类型植物内生细菌的分离培养也有很好的借鉴意义。

本发明中培养基的制备方法简单，便于操作，具有良好的推广应用价值。在培养基制备过程中，海藻糖和菊糖在98～105℃条件下高压蒸汽灭菌2次，是因为糖类在121℃常规灭菌温度下结构往往受到破坏，而98～105℃条件下高压蒸汽灭菌2次后，绝大部分微生物即可杀死。能形成芽孢的菌体，当受到98～105℃热胁迫后就会复苏生长，解除芽孢状态，在第二次灭菌时即可杀死，以上处理方法在实践操作中已取得良好的效果。

具体实施方式

下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。

实施例1

本实施例中牡丹营养器官内生细菌的分离纯化培养基，每1000mL培养基的组成为：金蝉干粉2g，酵母粉5g，吉兰糖胶2g，海藻糖0.5g，菊糖0.3g，NaCl9g，牡丹根际土壤浸提液200mL，琼脂粉16g，余量为蒸馏水，pH7.0。

牡丹营养器官内生细菌分离纯化培养基的制备方法，包括以下步骤：

1)金蝉干粉的制备：

称取金蝉老熟若虫适量，121℃条件下高压蒸汽灭菌20min后，置于恒温干燥箱90℃条件下过夜烘干，剪去前足后，用研钵研碎至无明显颗粒，过160目筛，即得金蝉干粉；

2)牡丹根际土壤浸提液的制备：

取牡丹根际土壤若干，手工去杂后，再过40目筛，制得根际细土300g，将细土置于1000mL三角瓶，加蒸馏水500mL，室温、220r/min摇床震荡2h，之后静置30min，将上清倒入砂芯过滤器过滤，滤液即为牡丹根际土壤浸提液；

3)称取海藻糖0.5g、菊糖0.3g，依次缓慢加入装有500mL蒸馏水的烧杯中进行溶解，搅拌均匀后转入三角瓶，105℃条件下高压蒸汽灭菌20min后，于恒温箱37℃放置48h，再在105℃条件下高压蒸汽灭菌30min，最后置于65℃恒温箱中，备用；

4)分别称取吉兰糖胶2g、金蝉干粉2g、酵母粉5g、NaCl9g和琼脂粉16g，依次加入200mL蒸馏水和200mL牡丹根际土壤浸提液的混合液中，将pH值调至7.0，蒸馏水定容至500mL，转入三角瓶中，121℃条件下高压蒸汽灭菌20min，冷却至65℃(左右均可)，无菌操作条件下与步骤3)的备用液混合，摇匀后倒板，所得平板即为牡丹营养器官内生细菌分离平板。

本实施例中牡丹营养器官内生细菌的分离纯化方法，包括以下步骤：

1)分别取牡丹Paeoniasuffruticosa的当年生健康营养器官根、茎、叶，先用自来水冲洗，将根、茎剪成5cm的小段，两端用融化的石蜡封口，叶的叶柄切口处也用石蜡封口，之后分别用无菌水冲洗三次；

2)转入70％乙醇溶液表面消毒5min，再用0.1mol/L升汞消毒3min，无菌操作条件下将封口石蜡剪去，将剩余的部分放入研钵充分研磨和混匀，静置沉淀后取适量上清液涂布于固体分离培养基，于30℃条件下恒温培养48h；

同时以传统的牛肉膏蛋白胨细菌培养基(配方：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂粉20g，蒸馏水1000mL)作为对照，各涂15个平板；

3)用接种环挑取差异明显、特征典型的不同单菌落，分别进行划线纯化，每个单菌落连续划线3次，获取不同单菌落的活体纯培养物。

采用菌落特征、常规生理生化指标测定和16SrDNA序列分析相结合的方法，对获得的典型菌株进行初步鉴定。结果显示，菌株在本发明的分离培养基上生长良好，数量多，重复性好，菌落特征多样，鉴定出的种类丰富，主要种属名录见下表1，与传统配方分离获得的牡丹内生细菌种类相比，在多样性上具有明显优势。

表1采用不同培养基分离、纯化和鉴定的牡丹内生细菌种类

实施例2

本实施例中牡丹营养器官内生细菌的分离纯化培养基，每1000mL培养基的组成为：金蝉干粉1.5g，酵母粉6g，吉兰糖胶2.5g，海藻糖1g，菊糖0.1g，NaCl8g，牡丹根际土壤浸提液250mL，琼脂粉18g，余量为蒸馏水，pH7.0。

牡丹营养器官内生细菌分离纯化培养基的制备方法，包括以下步骤：

1)金蝉干粉的制备：

称取金蝉老熟若虫适量，121℃条件下高压蒸汽灭菌20min后，置于恒温干燥箱90℃条件下过夜烘干，剪去前足后，用研钵研碎至无明显颗粒，过160目筛，即得金蝉干粉；

2)牡丹根际土壤浸提液的制备：

取牡丹根际土壤若干，手工去杂后，再过40目筛，制得根际细土200g，将细土置于1000mL三角瓶，加蒸馏水500mL，室温、220r/min摇床震荡2h，之后静置30min，将上清倒入砂芯过滤器过滤，滤液即为牡丹根际土壤浸提液；

3)称取海藻糖1g、菊糖0.1g，依次缓慢加入装有300mL蒸馏水的烧杯中进行溶解，搅拌均匀后转入三角瓶，98℃条件下高压蒸汽灭菌30min后，于恒温箱37℃放置48h，再在98℃条件下高压蒸汽灭菌25min，最后置于65℃恒温箱中，备用；

4)分别称取吉兰糖胶2.5g、金蝉干粉1.5g、酵母粉6g、NaCl8g和琼脂粉18g，依次加入300mL蒸馏水和250mL牡丹根际土壤浸提液的混合液中，将pH值调至7.0，转入三角瓶中，121℃条件下高压蒸汽灭菌20min，冷却至65℃(左右均可)，无菌操作条件下与步骤3)的备用液混合，定容至1000mL，摇匀后倒板，所得平板即为牡丹营养器官内生细菌分离平板。

本实施例中牡丹营养器官内生细菌的分离纯化方法，包括以下步骤：

1)分别取牡丹Paeoniasuffruticosa的当年生健康营养器官根、茎、叶，先用自来水冲洗，将根、茎剪成5cm的小段，两端用融化的石蜡封口，叶的叶柄切口处也用石蜡封口，之后分别用无菌水冲洗三次；

2)转入65％乙醇溶液表面消毒8min，再用0.05mol/L升汞消毒5min，无菌操作条件下将封口石蜡剪去，将剩余的部分放入研钵充分研磨和混匀，静置沉淀后取适量上清液涂布于固体分离培养基，于33℃条件下恒温培养54h；

3)用接种环挑取差异明显、特征典型的不同单菌落，分别进行划线纯化，每个单菌落连续划线3次，获取不同单菌落的活体纯培养物。

实施例3

本实施例中牡丹营养器官内生细菌的分离纯化培养基，每1000mL培养基的组成为：金蝉干粉2.5g，酵母粉4g，吉兰糖胶1.5g，海藻糖0.2g，菊糖1g，NaCl10g，牡丹根际土壤浸提液150mL，琼脂粉14g，余量为蒸馏水，pH7.0。

牡丹营养器官内生细菌分离纯化培养基的制备方法，包括以下步骤：

1)金蝉干粉的制备：

称取金蝉老熟若虫适量，121℃条件下高压蒸汽灭菌20min后，置于恒温干燥箱90℃条件下过夜烘干，剪去前足后，用研钵研碎至无明显颗粒，过180目筛，即得金蝉干粉；

2)牡丹根际土壤浸提液的制备：

取牡丹根际土壤若干，手工去杂后，再过60目筛，制得根际细土400g，将细土置于1000mL三角瓶，加蒸馏水500mL，室温、220r/min摇床震荡2h，之后静置30min，将上清倒入砂芯过滤器过滤，滤液即为牡丹根际土壤浸提液；

3)称取海藻糖0.2g、菊糖1g，依次缓慢加入装有500mL蒸馏水的烧杯中进行溶解，搅拌均匀后转入三角瓶，101℃条件下蒸汽灭菌25min后，于恒温箱37℃放置48h，再在101℃条件下蒸汽灭菌30min，最后置于65℃恒温箱中，备用；

4)分别称取吉兰糖胶1.5g、金蝉干粉2.5g、酵母粉4g、NaCl10g和琼脂粉14g，依次加入300mL蒸馏水和150mL牡丹根际土壤浸提液的混合液中，将pH值调至7.0，蒸馏水定容至500mL，转入三角瓶中，121℃条件下高压蒸汽灭菌20min，冷却至65℃(左右均可)，无菌操作条件下与步骤3)的备用液混合，摇匀后倒板，所得平板即为牡丹营养器官内生细菌分离平板。

本实施例中牡丹营养器官内生细菌的分离纯化方法，包括以下步骤：

1)分别取牡丹Paeoniasuffruticosa的当年生健康营养器官根、茎、叶，先用自来水冲洗，将根、茎剪成5cm的小段，两端用融化的石蜡封口，叶的叶柄切口处也用石蜡封口，之后分别用无菌水冲洗三次；

2)转入75％乙醇溶液表面消毒3min，再用0.15mol/L升汞消毒3min，无菌操作条件下将封口石蜡剪去，将剩余的部分放入研钵充分研磨和混匀，静置沉淀后取适量上清液涂布于固体分离培养基，于35℃条件下恒温培养48h；

3)用接种环挑取差异明显、特征典型的不同单菌落，分别进行划线纯化，每个单菌落连续划线3次，获取不同单菌落的活体纯培养物。