包含水溶性游离胺壳聚糖作为活性成分的抗藻华组合物和使用该组合物消除藻华的方法

技术领域

本发明涉及抗绿藻组合物和使用该组合物消除绿藻的方法，所述抗 绿藻组合物包含水溶性游离胺壳聚糖(freeaminechitosan)作为活性成 分，所述游离胺壳聚糖对于形成水华的藻类具有抗藻活性。

背景技术

水华是水流缓慢的富营养化湖泊或河流的水面中的浮游藻类(浮游 植物)大量繁殖和聚集的结果，水的颜色转变成显著的绿色。在五月至 十月之间观察到的此类有害的水华造成的环境损失达到数千亿韩元，是 显著的环境灾难。在水坑或水流非常缓慢的地方，例如在固化坝、水库、 湖泊、高尔夫球场水障、池塘、淡水养鱼场和渔场等中，当连续至少3 天的顶部水温为至少23℃时，容易发生水华。在韩国发现的大多数绿藻 属于蓝绿藻，且已鉴定的藻种类为至少167种藻类。

一旦水华发生，藻类以算术级数生长，从而使水中的大部分氧气被 藻类消耗，当变得更糟时，导致富营养化(缺氧)并伴随难闻的气味。 水中的鱼类遭受缺氧，且由于藻类附着在鳃上而呼吸困难。因此，鱼类 浮在水面上，并且不能适应水温的急剧变化，从而导致死亡。最近，在 夏季时经常在Nakdong河和Daecheong水库中观察到蓝绿色藻的大量繁 殖，同时水颜色发生变化。

一旦水华发生，水系统在用作饮用水或工业用途方面受到限制。因 此，这不仅是成本的巨大浪费，而且是在其它地方例如社会、经济以及 环境中引起其它问题的显著的生态问题。海外的韩国企业经受来自水华 的直接或间接的损害，且案例逐年增长。Azzurri、Argentina的情况就是 实例。确切地说，在Argentina的水处理厂中，该公司遭到起诉要求赔偿 由水华造成的损害总计5.5亿美元(由于2007年7月的水华，在中国太 湖区域的两个韩国公司遭到关闭)。

形成水华的藻类的生长引起的另一问题是由它们产生的称为微囊藻 素的有毒环肽，该有毒环肽可能会导致在绿藻繁殖的湖泊或池塘中游泳 或饮用来自其中的水的人发生疾病。传统的藻类控制方法旨在破坏藻类， 该方法最终反而加速水华密集发生的地方中的微囊藻素的分泌。微囊藻 素的大量分泌不仅对水生生物体的生长有害，而且也对人类有害。

水华的发展不仅是淡水、而且还是海滨中的显著的环境问题。海洋 中的水华通过海滨线处的异常增殖的浒苔的沉积而发展。海洋中的水华 在世界各地均有报道，例如众所周知的关于美国的Chesapeake湾、法国 的Bretagne和中国的Chentao的案例。在日本，自1990年以来在东京湾、 濑户内海和九州的许多海滨地区已报告了海洋水华。海洋中的水华造成 海滨风景的劣化、海藻腐烂带来的难闻气味、鱼类和贝类(包括蛤仔) 的灭绝。因此，日本地方政府通过每年投入数十万日元尝试消除和清除 绿藻。然而，仍然没有有效的控制方法以消除沿海地区每年生长的绿藻。

已寻求减小由绿藻造成的损失的解决方案或对策。然而，目前建立 的传统方法或对策可能在第2生态系统或第3生态系统中引发问题，此 外需要花费长的时间以奏效。下面是消除绿藻的传统方法的实例。

首先，消除淡水中的绿藻的最传统的方法之一是播撒黄土(红色粘 土)。黄土是具有高比重的矿物质，以便使粒子的电双层显著聚合且易于 沉降，由此能够使绿藻凝结并向下沉降至淡水或海水。该方法在韩国广 泛应用，以预防和消除绿藻。然而。该方法能够引起二次环境污染，使 得该方法并未在其它国家广泛应用。即，当喷洒黄土时，该处的水固化 或水流缓慢，微小的黄土颗粒沉降并毁灭其它水生生物。另外，根据最 近的报道，沉降的藻类甚至在休眠期后能够再次生长，可能导致二次损 害。

其次，绿藻的物理控制方法是疏浚或更换沉积层以防止绿藻。当聚 集在陆地或养鱼场的沉积层中的所有废弃物和污染物分解时，它们消耗 溶解氧并产生引起水华的多种有毒物质。因此，如上所述，该方法是疏 浚或更换沉积层。然而，在实际上经常观察到绿藻的大的湖泊或巨大的 坝中，这种方法并不那么有效。

控制绿藻的另一方法是构建人工岛或安装遮光网。然而，该方法在 宽阔区域中也不是那么有效(非专利文献1)。能够提供氧气的深曝气系 统是可用的，但只在约5m深的浅水中有效(非专利文献2)。此外，目 前市场上有最近开发的通过使用超声波来破坏有害藻类的膜的设备(专 利文献1)。然而，该设备也有缺点，即超声波强度可能影响到其它水生 生物。此类物理方法为了控制绿藻而花费较多，说明其可用性是非常受 限的。

考虑到传统方法的上述缺点，本发明人尝试对形成水华的藻类使用 壳聚糖，所述壳聚糖对人类和生态系统而言环境友好且无毒。作为结果， 本发明人证实了所处理的壳聚糖对此类形成水华的藻类显示出抗藻效 果，但对水生生物而言无毒，从而完成本发明。

现有技术文献

专利文献

(专利文献1)韩国专利No.10-1235053

非专利文献

(非专利文献1)K-water，Algaeresearchstudyreportgeneration mechanismandabatementtechniquesintheriverreservoirsystem，2007；

(非-专利文献2)K-water，Multipurposewateraeratorinstallation feasibilitystudyreport，1990。

发明内容

技术问题

本发明的目的是提供含有水溶性游离胺壳聚糖作为活性成分的抗绿 藻组合物，所述游离胺壳聚糖对形成水华的藻类具有抗藻活性。

本发明的另一目的是提供消除绿藻的方法，通过在显示出水华的淡 水中喷洒抗绿藻组合物来消除绿藻，所述抗绿藻组合物包含水溶性游离 胺壳聚糖作为活性成分。

另外，本发明的又一目的是提供抗绿藻组合物的用途，所述抗绿藻 组合物含有分子量为20kDa-100kDa的水溶性游离胺壳聚糖作为活性成 分，所述游离胺壳聚糖对形成水华的藻类显示出抗藻活性。

技术方案

为实现上述目标，本发明提供了含有水溶性游离胺壳聚糖作为活性 成分的抗绿藻组合物，所述游离胺壳聚糖对形成水华的藻类具有抗藻活 性。

本发明还提供了消除绿藻的方法，通过在显示出水华的淡水中喷洒 抗绿藻组合物来消除绿藻，所述抗绿藻组合物含有水溶性游离胺壳聚糖 作为活性成分。

有益效果

本发明的水溶性游离胺壳聚糖能够直接杀死形成水华的藻类，表明 该组合物具有抑制水华的优异的抗绿藻活性，而且对淡水生物体细胞而 言无毒。因此，包含所述水溶性游离胺壳聚糖作为活性成分的抗绿藻组 合物能够有效地用作安全的抗绿藻组合物，所述抗绿藻组合物可适用于 包括如下的淡水生态系统：固化坝、水库、湖泊、高尔夫球场水障、池 塘、淡水养鱼场和渔场。

附图说明

图1为示出在光学显微镜和荧光显微镜下观察到的、制备例2中制 备的水溶性游离胺壳聚糖对铜绿微囊藻(Microcystisaeruginosa)的抗藻 活性的照片。

图2为示出在光学显微镜和荧光显微镜下观察到的、制备例2中制 备的水溶性游离胺壳聚糖对斜生栅藻(Scenedesmusobliquus)的抗藻活 性的照片。

图3为示出制备例1、制备例2和对比例1-4中制备的水溶性游离胺 壳聚糖对鲤鱼(淡水生物的一种)的红细胞溶血率的效果的图表。

图4为示出如下的照片：在用制备例2中制备的水溶性游离胺壳聚 糖对培养基处理4小时和36小时后所观察到的(制备例2-1示出了经水 溶性游离胺壳聚糖处理4小时后的培养基；制备例2-2示出了经水溶性 游离胺壳聚糖处理36小时后的培养基)、该水溶性游离胺壳聚糖对铜绿 微囊藻的抗藻活性。

图5为示出在用制备例2中制备的水溶性游离胺壳聚糖对培养基处 理36小时后所观察到的、该水溶性游离胺壳聚糖对斜生栅藻的抗藻活性 的照片。

图6为示出在用制备例2中制备的水溶性游离胺壳聚糖处理1小时 后观察到的显示出水华的池塘的变化的照片。

图7为示出在用制备例2中制备的水溶性游离胺壳聚糖处理12小时 后观察到的显示出水华的池塘的变化的照片。

具体实施方式

下面，对本发明进行详细说明。

本发明提供了含有分子量为20kDa-100kDa的水溶性游离胺壳聚糖 作为活性成分的抗绿藻组合物，所述游离胺壳聚糖对形成水华的藻类显 示出抗藻活性。

本发明的抗绿藻组合物对形成水华的藻类(以铜绿微囊藻、斜生栅 藻和普通小球藻(Chlorellavulgaris)为例)显示出抗藻活性。

本发明的抗绿藻组合物中所包含的作为活性成分的水溶性游离胺壳 聚糖可通过包括如下步骤的方法制备，但并不总限于此：

使用有机酸和无机酸诱导不溶性壳聚糖中的盐形成，随后，通过酶 分解制备壳聚糖多糖(步骤1)；

用三烷基胺处理步骤1中制备的壳聚糖多糖的有机酸盐溶液或无机 酸盐溶液(步骤2)；

向步骤2的混合溶液中加入有机溶剂以消除附着至壳聚糖多糖的有 机或无机酸，从而制备无酸的壳聚糖多糖(步骤3)；以及

将步骤3中制备的无酸的壳聚糖多糖溶液用无机酸进行处理，随后 用活性炭/离子交换树脂柱进行纯化，以制备纯的水溶性游离胺壳聚糖 (步骤4)。

依照本发明的方法，所制备的水溶性游离胺壳聚糖具有高的水溶性 和生物活性，并且具有1kDa-100kDa的分子量。

本发明的抗藻组合物优选包含20kDa-100kDa的水溶性游离胺壳 聚糖，所述游离胺壳聚糖对形成水华的藻类具有抗藻活性。

如果本发明的水溶性游离胺壳聚糖的分子量小于20kDa，壳聚糖仍 然对形成水华的藻类显示出抗藻活性，但活性过低而不能防止或消除水 华。如果壳聚糖的分子量大于100kDa，壳聚糖显示出优异的抗藻活性， 但同时对于其它水生生物显示出毒性。

对包含在本发明的抗绿藻组合物中作为活性成分而抗形成水华的藻 类的水溶性游离胺壳聚糖的抗藻活性进行评价。结果确认了，本发明的 水溶性游离胺壳聚糖能够在0.024g/L的浓度下抑制铜绿微囊藻、斜生栅 藻和普通小球藻的生长达50％，表明所述游离胺壳聚糖能够在低浓度下 对于引起水华的淡水藻类显示出优异的抗藻活性(参见实验例1)。另外， 确认本发明的水溶性游离胺壳聚糖不具有毒性。确切而言，当用该水溶 性游离胺壳聚糖对生长有鲤鱼的淡水进行处理时，并不会引起鲤鱼中的 红细胞溶血，表明该水溶性游离胺壳聚糖不具有细胞毒性(参见实验例 3)。此外，在引起水华的藻类数量增加的实验中，所述水溶性游离胺壳 聚糖显示出优异的水华抑制和消除效果。当用本发明的水溶性游离胺壳 聚糖对水华实际生长的池塘进行处理时，水溶性游离胺壳聚糖在其中显 示出优异的抗水华活性(参见实验例4和5)。

因此，由于本发明的分子量为20kDa-100kDa的水溶性游离胺壳聚 糖对形成水华的藻类具有优异的抗藻活性，同时在淡水生物体中不会造 成细胞毒性，表明水溶性游离胺壳聚糖对生态系统没有危害。包含所述 水溶性游离胺壳聚糖作为活性成分的抗绿藻组合物能够有效地用作安全 的抗绿藻组合物，所述抗绿藻组合物可适用于包括如下的淡水生态系统： 固化坝、水库、湖泊、高尔夫球场水障、池塘、淡水养鱼场和渔场。

本发明还提供了消除绿藻的方法，通过在显示出水华的淡水中喷洒 抗绿藻组合物来消除绿藻，所述抗绿藻组合物包含分子量为20kDa-100 kDa的水溶性游离胺壳聚糖作为活性成分，该游离胺壳聚糖对形成水华 的藻类显示出抗藻活性。

另外，本发明提供了抗绿藻组合物的用途，所述抗绿藻组合物包含 分子量为20kDa-100kDa的水溶性游离胺壳聚糖作为活性成分，该游离 胺壳聚糖对形成水华的藻类显示出抗藻活性。

实施例

如以下实施例中所示，对本发明的实际且当前优选的实施方式进行 说明。

然而，鉴于本公开内容，应明了的是本领域技术人员可在本发明的 精神和范围内进行修改和改进。

制备例1：水溶性游离胺壳聚糖1的制备

步骤1：制备壳聚糖多糖

通过使用乳酸作为溶剂制备5％的壳聚糖溶液。向100mL的所述5％ 的壳聚糖溶液(pH5.0-5.5)中加入5单位的来源于短小芽孢杆菌(Bacilllus pumilus)BN-262的壳聚糖酶，随后，在40℃下进行酶反应36小时。在 反应完成后，将混合物使用1μm预过滤器进行过滤，随后使用中空过滤 器再次过滤(分子量：20kDa)。将得到的滤液使用纳米过滤系统进行浓 缩，随后灭菌并用空气喷雾干燥器进行干燥。作为结果，得到壳聚糖多 糖。

步骤2：制备无酸的壳聚糖多糖

将得到的壳聚糖多糖溶于1L的PBS(pH7.0)中，向其中缓慢滴加 0.52L的三乙胺。此时，1当量的壳聚糖寡糖的胺基与2当量的三乙胺反 应。反应混合物在室温下反应2小时，向其中加入丙酮，随后搅拌。然 后，进行离心。上述程序重复2-3次，然后通过空气干燥和冷冻干燥， 以得到无酸的壳聚糖多糖。此时，使用Supra30K在4℃下以15,000rpm 离心20分钟。

步骤3：制备水溶性游离胺壳聚糖

向在步骤2中制备的壳聚糖多糖中加入30mL-50mL的0.001NHCl， 随后反应2小时。向反应混合物中加入丙酮，在与如上所述的相同条件 下进行搅拌和离心。所述程序重复2-3次，然后进行空气干燥和冷冻干 燥。将干燥的产物溶于蒸馏水中，随后，通过活性炭/离子交换树脂柱进 行纯化。将得到的水溶液冷冻干燥。然后，将产物溶于水中，接着用醋 酸纤维素膜(可透过的分子量：20kDa)进行过滤。作为结果，得到分子 量为20kDa的水溶性游离胺壳聚糖。

制备例2：水溶性游离胺壳聚糖2的制备

除使用100kDa的醋酸纤维素膜代替制备例1的步骤3中的20kDa 的醋酸纤维素膜之外，以与制备例1中所述的相同方式制备分子量为100 kDa的水溶性游离胺壳聚糖。

对比例1：水溶性游离胺壳聚糖3的制备

除使用1kDa的醋酸纤维素膜代替制备例1的步骤3中的20kDa的 醋酸纤维素膜之外，以与制备例1中所述的相同方式制备分子量为1kDa 的水溶性游离胺壳聚糖。

对比例2：水溶性游离胺壳聚糖4的制备

除使用3kDa的醋酸纤维素膜代替制备例1的步骤3中的20kDa的 醋酸纤维素膜之外，以与制备例1中所述的相同方式制备分子量为3kDa 的水溶性游离胺壳聚糖。

对比例3：水溶性游离胺壳聚糖5的制备

除使用5kDa的醋酸纤维素膜代替制备例1的步骤3中的20kDa的 醋酸纤维素膜之外，以与制备例1中所述的相同方式制备分子量为5kDa 的水溶性游离胺壳聚糖。

对比例4：水溶性游离胺壳聚糖6的制备

除使用10kDa的醋酸纤维素膜代替制备例1的步骤3中的20kDa 的醋酸纤维素膜之外，以与制备例1中所述的相同方式制备分子量为10 kDa的水溶性游离胺壳聚糖。

对比例5：水溶性游离胺壳聚糖7的制备

除不进行制备例1的步骤1中的酶反应和步骤3中的用20kDa的醋 酸纤维素膜进行的过滤之外，以与制备例1中所述的相同方式制备分子 量为150kDa的水溶性游离胺壳聚糖。

实验例1：水溶性游离胺壳聚糖1的抗绿藻活性的评价

进行以下实验，从而对本发明的水溶性游离胺壳聚糖的抗绿藻活性 进行评价。

将分布于韩国海洋微藻培养物中心(KoreaMarineMicroalgaeCulture Center)的铜绿微囊藻、斜生栅藻和普通小球藻用作形成水华的藻类，以 用于抗绿藻活性的评价。在22℃和3,000Lux下以14h/10h的光照和黑暗 周期将藻类培养于BG-11培养基中，所述培养基补充有以下组分：NaNO₃(15mg)、K₂HPO₄(40mg)、MgSO₄·7H₂O(75mg)、CaCl₂·2H₂O(36 mg)、柠檬酸(6mg)、柠檬酸铁铵(6mg)、EDTA(1mg)、NaCO₃(20 mg)、H₃BO₃(2.86mg)、MnCl₂·4H₂O(1.81mg)、ZnSO₄·7H₂O(0.222mg)、 CuSO₄·5H₂O(0.079mg)和Co(NO₃)₂·6H₂O(0.0494mg/1L)。将预培养 的藻细胞稀释至密度为2×10⁵个细胞/mL或5×10⁵个细胞/mL，随后接种 于24孔微滴定板中。从6.25(mg/mL)/孔的浓度开始，每次将分别在制备 例1、制备例2和对比例1-5中制备的水溶性游离胺壳聚糖稀释1/2，并 加入到接种有所述菌株的板中。对于未处理对照，向其中加入不含水溶 性游离胺壳聚糖的BG-11培养基。在以上述培养条件进行培养的2天内， 为确定50％的抑制浓度(下文称为IC₅₀)，用血细胞计数器每6小时对藻 的数量进行计数。结果示于表1。

表1

如表1中所示，本发明的分子量为20kDa-100kDa的水溶性游离胺 壳聚糖对形成水华的藻类显示出优异的抗藻活性。具体而言，取决于分 子量，本发明的分子量为20kDa-100kDa的水溶性游离胺壳聚糖对形成 水华的藻类(例如，铜绿微囊藻、斜生栅藻和普通小球藻)显示出优异 的抗藻活性。即，分子量为100kDa的水溶性游离胺壳聚糖的抗藻活性 显示出具有0.024g/L以下的IC₅₀，而分子量为20kDa的水溶性游离胺壳 聚糖对形成水华的藻类的抗藻活性、尤其是对于普通小球藻，具有0.049 g/L的优异的IC₅₀。与此同时，相比于分子量为20kDa-100kDa的壳聚糖， 尽管对比例5中的分子量大于100kDa的壳聚糖显示出优异的抗藻活性， 但是对比例1-4中制备的分子量小于20kDa的水溶性游离胺壳聚糖至少 在以双倍浓度的壳聚糖处理藻类(除普通小球藻外)时才显示出抗藻活 性。因此确认了，本发明的分子量为20kDa-100kDa的水溶性游离胺壳 聚糖对形成水华的藻类具有优异的抗藻活性。

确认了本发明的分子量为20kDa-100kDa的水溶性游离胺壳聚糖对 形成水华的藻类具有优异的抗藻活性，表明该游离胺壳聚糖在减少水华 和抑制形成水华的藻类的繁殖方面是有效的，因此，包含该水溶性游离 胺壳聚糖作为活性成分的抗绿藻组合物能够有效地用作安全的抗绿藻组 合物，该抗绿藻组合物可适用于包括如下的淡水生态系统，：固化坝、水 库、湖泊、高尔夫球场水障、池塘、淡水养鱼场和渔场。

实验例2：水溶性游离胺壳聚糖2的抗绿藻活性的评价

进行以下实验，从而对本发明的水溶性游离胺壳聚糖的抗绿藻活性 进行评价。

将实验例1中使用的形成水华的藻类在BG-11培养基中培养，所述 BG-11培养基补充有以下组分：NaNO₃(15mg)、K₂HPO₄(40mg)、 MgSO₄·7H₂O(75mg)、CaCl₂·2H₂O(36mg)、柠檬酸(6mg)、柠檬酸 铁铵(6mg)、EDTA(1mg)、NaCO₃(20mg)、H₃BO₃(2.86mg)、 MnCl₂·4H₂O(1.81mg)、ZnSO₄·7H₂O(0.222mg)、CuSO₄·5H₂O(0.079mg) 和Co(NO₃)₂·6H₂O(0.0494mg/1L)。将培养的藻类以10⁵个细胞/mL的密 度接种于24孔微滴定板中，以每孔12mg/mL的浓度向其中加入制备例 2中制备的水溶性游离胺壳聚糖，随后在22℃下培养2小时。对于未处 理的对照，向其中加入不含水溶性游离胺壳聚糖的BG-11培养基。在培 养完成后，将培养基在用于可视化的光学显微镜和荧光显微镜下观察。 结果示于图1和图2中。

如图1和图2中所示，本发明的水溶性游离胺壳聚糖对形成水华的 藻类显示出抗藻活性。当绿藻存活时，绿藻自身发出荧光，但当绿藻死 亡时，不能发出荧光。基于该事实，在荧光显微镜下进行观察。由对未 处理对照组进行的观察确认了，生物体的数量得以维持且它们的形态没 有改变。然而，相比于未处理的对照组，当用制备例2中制备的水溶性 游离胺壳聚糖处理藻类时，藻类的数量显著减少，并且未观察到任何数 量的增加。因此确认了，本发明的水溶性游离胺壳聚糖能够引起形成水 华的藻类的死亡。

确认了本发明的分子量为20kDa-100kDa的水溶性游离胺壳聚糖对 形成水华的藻类具有优异的抗藻活性，表明该游离胺壳聚糖在减少水华 和抑制形成水华的藻类的繁殖方面是有效的，因此，包含该水溶性游离 胺壳聚糖作为活性成分的抗绿藻组合物能够有效地用作安全的抗绿藻组 合物，该抗绿藻组合物可适用于包括如下的淡水生态系统：固化坝、水 库、湖泊、高尔夫球场水障、池塘、淡水养鱼场和渔场。

实验例3：对淡水生物体的细胞毒性的评价

进行以下实验，从而评价本发明的分子量为20kDa-100kDa的水溶 性游离胺壳聚糖针对淡水生物体的细胞毒性。

首先，从淡水鲤鱼中采集血液。将血液用肝素处理以防止凝结，然 后将红细胞分离。将分离出的红细胞的密度调节为8％，用分别在制备例 1和2以及对比例1-5中制备的水溶性游离胺壳聚糖对红细胞进行处理， 将所述游离胺壳聚糖从10mg/mL的浓度每次稀释两倍。两小时后，将上 清液分离，并用酶标仪测定游离的血红蛋白以计算红细胞溶血率。结果 示于图3中。

如图3中所示，确认了本发明的分子量为20kDa-100kDa的水溶性 游离胺壳聚糖对淡水生物体不具有细胞毒性。更确切而言，在制备例1 和2中制备的水溶性游离胺壳聚糖不论何种浓度显示出的溶血率均低于 5％。与此同时，对比例5中制备的分子量大于100kDa的水溶性游离胺 壳聚糖甚至在低浓度下也显示出高的溶血率。因此确认了，本发明的水 溶性游离胺壳聚糖对于淡水生物体而言是安全且无细胞毒性的。

确认了本发明的分子量为20kDa-100kDa的水溶性游离胺壳聚糖不 仅对形成水华的藻类具有优异的抗藻活性，而且在淡水生物体中是安全 的且不会引起细胞毒性，表明该水溶性游离胺壳聚糖不会在生态系统中 引起任何次级问题，因此，包含水溶性游离胺壳聚糖作为活性成分的抗 绿藻组合物能够有效地用作安全的抗绿藻组合物，该抗绿藻组合物可适 用于包括如下的淡水生态系统：固化坝、水库、湖泊、高尔夫球场水障、 池塘、淡水养鱼场和渔场。

实验例4：对水溶性游离胺壳聚糖1消除绿藻的效果的评价

进行以下实验，从而对本发明的水溶性游离胺壳聚糖的消除绿藻的 效果进行评价。

将在与实验例1所述的相同的培养条件下预培养的铜绿微囊藻和斜 生栅藻以至少10⁶个细胞/mL的密度装入T形烧瓶中，用制备例2中制 备的24mg/L的水溶性游离胺壳聚糖对其进行处理。使用血细胞计数器 每6小时对形成水华的藻类的数量进行计数，并在24小时后观察水的浑 浊度。此时，将不含水溶性游离胺壳聚糖的培养基用作未处理的对照。 结果示于图4和图5中。

如图4和图5中所示，确认了本发明的水溶性游离胺壳聚糖对形成 水华的藻类(如铜绿微囊藻和斜生栅藻)具有抗藻活性。更确切而言， 未经水溶性游离胺壳聚糖处理的未处理组在水中显示出高的浑浊度(如 同悬浮液)，其中，引起水华的藻类(如铜绿微囊和斜生栅藻)的数量增 加。与此同时，当使用本发明的水溶性游离胺壳聚糖进行处理时，水的 浑浊度降低且水变得更清澈，其中，死亡的藻类沉积在烧瓶的底部。因 此确认了，本发明的水溶性游离胺壳聚糖对于引起水华的藻类具有抗藻 活性。

确认了本发明的分子量为20kDa-100kDa的水溶性游离胺壳聚糖对 形成水华的藻类具有优异的抗藻活性，表明该游离胺壳聚糖在减少水华 和抑制形成水华的藻类的繁殖方面是有效的，因此，包含该水溶性游离 胺壳聚糖作为活性成分的抗绿藻组合物能够有效地用作安全的抗绿藻组 合物，该抗绿藻组合物可适用于包括如下的淡水生态系统：固化坝、水 库、湖泊、高尔夫球场水障、池塘、淡水养鱼场和渔场。

实验例5：对水溶性游离胺壳聚糖2消除绿藻的效果的评价

进行以下实验，从而在已有水华实际生长的淡水中对本发明的水溶 性游离胺壳聚糖的消除绿藻的效果进行评价。

首先，从池塘中取出700L水华显著的水，将该水转移入水浴槽中。 然后，对其用60mg/mL的本发明制备例2中制备的水溶性游离胺壳聚糖 进行处理。在1小时-12小时后，观察并对水浴槽中的水进行拍照。结果 示于图6和图7中。

如图6和图7中所示，本发明的水溶性游离胺壳聚糖对引起水华的 藻类显示出优异的抗藻活性，所述藻类实际上在池塘中处于繁殖进程中。 更确切而言，如图6所示，当用制备例2中制备的水溶性游离胺壳聚糖 处理池塘水时，引起池塘中的水华的藻类死亡并在处理一小时后沉积。 如图7所示，在用水溶性游离胺壳聚糖处理池塘水12小时后，引起水华 的所有藻类均死亡且沉积，并且作为结果，水变得更清澈同时确认了浑 浊度更低。因此确认了，在水华生长的淡水中，本发明的水溶性胺壳聚 糖在消除绿藻方面很出色。

确认了本发明的分子量为20kDa-100kDa的水溶性游离胺壳聚糖对 形成水华的藻类具有优异的抗藻活性，表明该游离胺壳聚糖在减少水华 和抑制形成水华的藻类的繁殖方面是有效的，而且在水华实际生长的淡 水中，在消除绿藻方面也很出色。因此，包含水溶性游离胺壳聚糖作为 活性成分的抗绿藻组合物能够有效地用作安全的抗绿藻组合物，该抗绿 藻组合物可适用于包括如下的淡水生态系统：固化坝、水库、湖泊、高 尔夫球场水障、池塘、淡水养鱼场和渔场。