使用特异性报告物和通用报告物的多重数字分析

优先权申请的交叉引用

本申请基于下列专利申请并根据美国法典第35篇第119条e款要求下 列专利申请的利益：2013年2月1日提交的美国临时专利申请序列号 61/759,772、2013年2月1日提交的美国临时专利申请序列号61/759,930 和2013年2月1日提交的美国临时专利申请序列号61/759,931。这些优先 权申请中的每个为了所有目的通过引用被全部并入本文。

其它材料的交叉引用

本申请为了所有目的通过引用全部合并下列材料：2006年5月9日颁 布的美国专利号7,041,481、2010年7月8日公布的美国专利申请公布号 2010/0173394A1、2011年9月8日公布的美国专利申请公布号 2011/0217712A1、2012年6月21日公布的美国专利申请公布号 2012/0152369A1、2013年2月14日公布的美国专利申请公布号 2013/0040841A1、2013年12月6日提交的美国专利申请序列号14/099,750 以及JosephR.Lakowicz的“PrinciplesofFluorescenceSpectroscopy”(1999 年第二版)。

介绍

数字分析通常依赖于检测在样本中的分析物的单独拷贝的存在或活 动的能力。在示例性数字分析中，样本分成通常具有相等体积的一组分块， 每个分块平均包含分析物的少于大约一个拷贝。如果分析物的拷贝随机地 分布在分块当中，则一些分块应不包含拷贝，其它分块只包含一个拷贝， 以及如果分块的数量足够大，又一些其它分块应包含两个拷贝、三个拷贝 和甚至更高数量的拷贝。通过泊松分布描述了基于在分块中的分析物的给 定平均浓度来找到在分块中的确切地0、1、2、3或更多拷贝的概率。相 反，可从找到在分块中的给定数量的拷贝的概率估计在分块中(和因而在 样本中)的分析物的浓度。

可在数字分析中测量找不到拷贝和找到一个或多个拷贝的概率的估 计。每个分块可被测试以确定分块是包含分析物的至少一个拷贝的阳性分 块还是不包含分析物的拷贝的阴性分块。找不到分块中的拷贝的概率可由 阴性的被测试的分块的分数(“阴性分数”)近似，以及找到至少一个拷贝 的概率由阳性的被测试的分块的分数(“阳性分数”)近似。阳性分数或阴 性分数于是可用于例如使用泊松统计来确定分块中的分析物的浓度。

数字分析频繁地依赖于分块中的核酸靶的扩增以使分析物的单个拷 贝的检测变得可能。可经由聚合酶链反应(PCR)进行扩增以实现数字PCR 分析。所扩增的靶可以是分析物本身或在分块的形成之前或之后产生的分 析物的替代物。可以可选地从包括在反应中的荧光探针检测靶的扩增。特 别是，探针可包括提供指示靶是否被扩增的荧光信号的荧光团。

数字PCR分析可以是多重的以允许在每个分块内的两个或多个不同 的靶的检测。可通过利用靶特定探针来区分靶的扩增。然而，这样的探针 可能是昂贵的且需要被定制合成，如果不是已经在市场上可买到，进一步 增加来成本。

需要用于使用较少的靶特定探针来执行更多靶的多重数字分析的新 方法。

概述

本公开提供了用于执行分块中的靶分析的数字分析系统，包括方法、 装置和成分，每个分块包含用于靶扩增的通用报告物和特异性报告物。

附图的简要说明

图1是根据本公开的方面的在包含通用报告物的分块中的靶上执行多 重数字分析的示例方法的流程图，可选地，至少一个靶是至少部分地掩蔽 在包含模糊靶和被掩蔽靶的分块中的另一靶的存在的模糊靶。

图2是根据本公开的方面的用于执行图1的多重数字分析的示例性系 统的示意图。

图3是根据本公开的方面的可在单个检测通道中从共同包含与较高振 幅信号相关的模糊靶(H)和与较低振幅信号相关的被掩蔽靶(L)的分块 例如液滴收集的多重分析数据的示意性图表。

图3A是根据本公开的方面的可如在图3中的被收集的多重分析数据 的示意性图表，但双-阳性分块(HL、HLL等)的群体展示在只包含靶H 的分块的群体上的信号振幅的小的可检测到的增加，信号振幅的增加不足 以分辨来自彼此的两个较高振幅群体，使得靶L仍然至少部分地由靶H的 存在掩蔽。

图4是根据本公开的方面的通常可如在图3中的被收集的多重分析数 据的示意性图表，但模糊靶(L)就具有比被掩蔽靶(H)低的振幅信号。

图5是根据本公开的方面的可在单个检测通道中从共同包含根据掩蔽 等级结构连续地掩蔽彼此的K个靶的分块例如液滴收集的多重分析数据的 示意性图表。

图6是根据本公开的方面的来自能够产生图3的数据的示例性多重数 字分析的分块的示意图，分块包含掩蔽靶(H)的拷贝和具有不同的长度 的被掩蔽靶(L)的拷贝，每个在不同的效率下可以用同一对正向(F)和 反向(R)引物扩增且可经由同一探针(P)检测。

图7是根据本公开的方面的来自能够产生图4的数据的示例性多重数 字分析的分块的示意图，分块包含掩蔽靶(H)的拷贝和具有不同的长度 的被掩蔽靶(L)的拷贝，每个在不同的效率下可用同一对正向(F)和反 向(R)引物扩增且可经由扩增子(例如嵌入染料)的相同的通用报告物 检测。

图8是根据本公开的方面的来自能够产生图3的数据的另一示例性多 重数字分析的分块的示意图，分块包含掩蔽靶(H)的拷贝和具有相同的 长度的被掩蔽靶(L)的拷贝，每个在不同的效率下可用同一对正向(F) 和反向(R)引物扩增且可经由同一探针(P)检测。

图9是根据本公开的方面的来自能够产生图3的数据的又一示例性多 重数字分析的分块的示意图，分块包含掩蔽靶(H)的拷贝和具有相同的 长度的被掩蔽靶(L)的拷贝，每个在相同的效率下可用同一对正向(F) 和反向(R)引物扩增且可在不同的效率下经由同一探针(P)检测。

图10是根据本公开的方面的来自能够产生图3的数据的再一示例性 多重数字分析的分块的示意图，分块包含模糊靶的拷贝和被掩蔽靶的拷 贝，每个在不同的效率下可用不同对的正向和反向引物(F_H和R_H或F_L和 R_L)扩增且可经由不同的探针(P_H和P_L)检测。

图11是根据本公开的方面的来自使用单个检测通道执行的示例性多 重数字分析的分块的示意图，分块包含靶A和靶B的拷贝，每个可用不同 对的正向和反向引物(F_A和R_A或F_B和R_B)扩增且可经由通用报告物(例 如嵌入染料)检测。

图11A是根据本公开的方面的可为图11的多重数字分析在单个检测 通道中从五组分块(线道1-5)收集的荧光振幅数据的示意性图表，每组 包含相同浓度的靶A和B、正向引物A和反向引物A和B以及靶B的可 变浓度的正向引物B。

图12是根据本公开的方面的来自使用两个检测通道执行的示例性多 重数字分析的分块的示意图，分块包含被掩蔽靶A的拷贝和掩蔽靶B的拷 贝，每个在不同的效率下可用不同对的正向和反向引物(F_A和R_A或F_B和 R_B)扩增且可经由具有不同荧光团标签的不同的探针(P_A和P_B)检测。

图12A是根据本公开的方面的可从图12的多重数字分析收集的扩增 数据的示意性散布图，分块的三个不同的簇被顺序地编号并根据靶内容被 识别。

图13是根据本公开的方面的来自使用两个检测通道执行的另一示例 性多重数字分析的分块的示意图，分块包含被掩蔽靶(A)的拷贝和掩蔽 靶(B)的拷贝，每个可用不同对的正向和反向引物(F_A和R_A或F_B和R_B) 扩增且可经由通用报告物(例如嵌入染料)和特异性探针(P_B)检测。

图14是根据本公开的方面的可从图13的多重数字分析收集的扩增数 据的示意性散布图，分块的三个不同的簇被顺序地编号并根据靶内容被识 别。

图14A是根据本公开的方面的来自使用单个检测通道执行的示例性 多重数字分析的分块的示意图，分块包含被掩蔽靶(A)的拷贝和掩蔽靶 (B)的拷贝，每个可用不同对的正向和反向引物(F_A和R_A或F_B和R_B) 扩增且可经由通用报告物(例如嵌入染料)和特异性探针(P_B)检测。

图14B是根据本公开的方面的可为图14A的多重数字分析在单个检测 通道中从五组分块(线道1-5)收集的荧光强度数据的示意性图表，每组 包含相同浓度的靶A和B和两对引物以及靶B的可变浓度的探针(P_B)。

图15是根据本公开的方面的来自使用两个检测通道执行的另一示例 性多重数字分析的分块的示意图，分块包含被掩蔽靶(A)、第二靶(B) 和掩蔽靶(C)的拷贝，每个可用不同对的正向和反向引物(F_A和R_A、F_B和R_B或F_C和R_C)扩增且可经由通用报告物(例如嵌入染料)和特异性探 针(P_B和P_C)检测。

图16是根据本公开的方面的可在检测靶A和C的扩增的第一通道中 和在检测靶B的扩增的第二通道中从图15的多重数字分析收集的扩增数 据的示意性散布图，靶阳性分块的五个不同的簇被顺序地编号并根据靶内 容被识别。

图17是可从图15的多重数字分析收集的并如在图16中绘制的扩增 数据的另一示意性散布图，除了图16的两个簇((A)和(AB))不再被 分辨并形成具有异质靶内容的异质簇以外。

图18是根据本公开的方面的可从图15的多重数字分析收集的扩增数 据的另一示意性散布图，但具有检测靶A和C的扩增的第一通道和检测靶 A和B的扩增的第二通道，靶阳性分块的四个不同的簇被顺序地编号并根 据靶内容被识别。

图19是根据本公开的方面的来自确定库的质量的示例性多重数字分 析的分块的示意图，分块包含空库成员(没有插入物的适应物-适应物反向 重复)的拷贝和包含插入物的库成员的拷贝，每个库成员可用同一引物(F) 的两个拷贝扩增且可使用适应物特异性探针(P)探测。

图20是从在液滴中执行的图19的多重分析收集的扩增数据的图表。

图21是根据本公开的方面的来自量化样本中的拼接和未拼接物种的 示例性多重数字分析的分块的示意图，分块包含未拼接物种(外显子-内含 子-外显子)和拼接物种(外显子-外显子)，每个物种可用同一对正向和反 向引物(F和R)扩增并可经由通用报告物检测。

图22是从在液滴中执行的图21的多重分析收集的扩增数据的图表。

图23是根据本公开的方面的来自量化样本中的拼接和未拼接物种的 另一示例性多重数字分析的分块的示意图，分块包含未拼接物种(外显子 -内含子-X-内含子-外显子)和两个不同的拼接物种(外显子-X-外显子和外 显子-外显子)，每个物种可用同一对正向和反向引物(F和R)扩增并可 经由通用报告物检测。

图24是从图23的多重分析收集的扩增数据的图表。

图25是根据本公开的方面的来自量化分块中的一对靶(靶A和B) 的示例性多重数字分析的分块的示意图，所描绘的分块包含每个靶的拷贝 和结合到靶中的仅仅一个(靶A)的仅仅单个报告物。

图26是根据本公开的方面的可在一对光学通道中从图25的多重数字 分析收集的扩增数据的示意性图表，只有一个通道检测单个报告物，且图 表具有顺序地编号(0、1和2)并根据靶内容识别的分块的三个不同的簇。

详细描述

本公开提供了用于执行分块中的靶分析的数字分析系统，包括方法、 装置和成分，每个分块包含用于靶扩增的通用报告物和特异性报告物。

提供了执行多重数字分析的示例性方法。在该方法中，可提供分块， 每个分块包括同一混合物的一部分。混合物可包含第一靶和第二靶且也可 包含对任一靶的扩增敏感的通用报告物和对第二靶的扩增特异地敏感的 特异性报告物。只有分块的第一子集每个可包含第一靶的至少一个拷贝， 且分块的仅仅不同的第二子集每个可包含第二靶的至少一个拷贝。在分块 中可扩增第一靶和第二靶。可从存在于多个分块中的通用报告物和特异性 报告物收集扩增数据。可基于扩增数据计算每个靶的水平。

提供了执行多重数字分析的另一方法。在该方法中，可提供分块，每 个分块包括同一混合物的一部分，混合物包含第一靶和第二靶且也包含通 用报告物和特异性报告物。只有分块的子集每个可包含第一靶的至少一个 拷贝，且分块的仅仅另一子集每个可包含第二靶的至少一个拷贝。可扩增 在分块中的靶以产生相应于第一靶的第一扩增子和相应于第二靶的第二 扩增子。通用报告物可结合到第一扩增子和第二扩增子。特异性报告物可 结合到第二扩增子而不结合到第一扩增子。可通过检测由通用报告物和特 异性报告物的至少一个发光团发射的光从多个分块收集扩增数据。可基于 扩增数据计算每个靶的水平。

提供了用于执行多重数字分析的成分。该成分可包括布置在同一连续 相中的多个液滴。液滴每个可包括同一混合物的一部分。混合物可包含第 一靶、第二靶、对任一靶的扩增敏感的通用报告物和对第二靶的扩增特异 地敏感的特异性报告物。多个液滴的仅仅第一子集每个包含第一靶的至少 一个拷贝，以及多个液滴的仅仅不同的第二子集每个包含第二靶的至少一 个拷贝。混合物可包括用于每个靶的扩增的完整的一组试剂。

本公开的数字分析可具有很多优点，例如较高水平的多重性、单独地 或结合至少一个特异性报告物使用通用报告物的多重性、对在数据中不可 区别的和/或未很好地分辨的分块群体的靶水平(例如浓度)的确定、使用 在分块内的竞争性分析的靶水平的确定或其任何组合等。

在下面的章节中介绍本公开的另外的方面：(I)使用通用报告物的多 重数字分析的概述，(II)被掩蔽靶的浓度的确定，(III)具有靶掩蔽的示 例性分析配置，(IV)使用特异性报告物和通用报告物的多重分析，以及 (V)实例。

I.使用通用报告物的多重数字分析的概述

本章提供了使用通用报告物执行的多重数字分析的概述，其中分块中 的靶的存在至少部分地被同一分块中的不同靶的存在掩蔽；见图1和2。 数字分析可利用如在第II章和本文的其它地方描述的数据排除来计算一个 或多个靶的水平。

图1示出使用通用报告物、可选地使用靶掩蔽来执行多重数字分析的 示例性方法50的流程图。可以按任何适当的顺序和在任何适当的组合中 执行对方法50提出的步骤。此外，步骤可与本公开的任何其它适当的步 骤、方面和/或特征——包括在通过引用并入本文的交叉引用下在上面列出 的专利文档中描述的那些——组合，和/或由这些步骤、方面和/或特征修 改。

样本制备。样本可被制备用于分析，在52指示。样本的制备可包括 样本的任何适当的操纵，例如收集、稀释、集中、纯化、冻干、冰冻、提 取、与一个或多个分析试剂组合以形成混合物(也被称为含样本混合物、 体相或反应混合物)、至少一个预备反应的执行以为在分析中的一个或多 个反应制备样本或其任何组合等。制备可隔离分析物，例如包括一个或多 个核酸靶的拷贝的核酸，和/或可改性和/或分解分析物。样本的制备可包 括使样本变得能胜任一个或多个反应例如一个或多个酶催化反应和/或结 合反应的随后执行。

在一些实施方式中，样本的制备可包括组合样本与试剂以产生含样本 混合物用于执行对每个靶的反应(例如扩增反应)和用于报告每个反应的 程度(例如是否反应出现在阈值水平之上或在一范围内)。用于扩增的试 剂可包括靶的引物、dNTP和/或NTP、至少一种酶(例如多聚酶、连接酶、 逆转录酶、限制酶或其组合等，其中每个可以或可以不是热稳定的)和/ 或类似物的任何组合。相应地，混合物可具有用于(即能胜任)在适当的 环境条件(例如在升高的温度下的培养或温度的调节(例如通过热循环)) 下每个靶的扩增的一组完整的试剂。混合物可能能够扩增一个或多个靶中 的每个，如果存在于样本(或其分块)中。用于报告的试剂可包括至少一 种通用报告物和/或至少一种特异性报告物。通用报告物可对每个靶的扩增 敏感，且特异性报告物可对靶的仅仅子集例如仅仅一个靶的扩增特别敏 感。混合物可以或可以不包括待分析的每个靶的不同报告物。混合物的制 备可使得样本能够在逐个靶的基础上，对诸如扩增的反应是否出现和可选 地任何这样的反应的程度进行报告或被分析。

提供分块。可提供用于分析的分块，在54处指示。每个分块可包括 同一混合物的一部分。在一些情况下，该部分可构成整个分块。混合物可 包含每个靶(例如由同一样本提供)、每个报告物和/或一个或多个扩增试 剂(例如用于每个靶的扩增的完整的一组试剂)。相应地，分块可共同包 含多个靶，且每个分块可包含相同的通用报告物和可选地同一特异性报告 物。靶可包括至少一个可掩蔽靶(可互换地被称为被掩蔽靶)和至少一个 模糊靶(可互换地被称为掩蔽靶或优势靶)。当每个靶的拷贝存在于同一 分块中时，模糊靶能够至少部分地掩蔽一个或多个可掩蔽靶的存在。

分块在被提供(例如当形成)时可包含在“不全占位”下的每个靶， 这意味着分块的仅仅子集的每个分块包含待分析的每个靶(和/或模板)的 至少一个拷贝。例如，在第一靶和第二靶上执行多重分析时，只有分块的 第一子集包含第一靶，且只有分块的第二子集包含第二靶。分块的第一子 集和第二子集可以是同一子集，如果当分块形成时第一靶和第二靶完全与 彼此相关和/或链接到彼此。可选地，如果当分块形成时第一靶和第二靶不 完全与彼此相关和/或链接到彼此，则分块的第一子集和第二子集可以是不 同的。在一些情况下，如果靶不完全相关和/或链接，则分块的不同的第三 子集的每个分块可包含每个靶的至少一个拷贝。相应地，在不全占位的情 况下，一个或数个(例如多个)分块不包含第一靶的拷贝，一个或数个(例 如多个)分块可包含第一靶的单个拷贝(仅仅一个拷贝)，且可选地，又 一个或数个分块(例如分块的其余部分)可包含第一靶的两个或两个以上 拷贝。类似地，在不全占位的情况下，一个或数个(例如多个)分块不包 含第二靶的拷贝，一个或数个(例如多个)分块可包含第二靶的单个拷贝 (仅仅一个拷贝)，且可选地，又一个或数个分块(例如分块的其余部分) 可包含第二靶的两个或两个以上拷贝。

术语“不全占位”并不限于在任何分块中有感兴趣的特定模板/靶的不 多于一个拷贝的情况。在不全占位下包含模板和/或靶的分块在分块被提供 或形成时可例如每分块包含模板/靶的多于或少于、大约一个拷贝、两个拷 贝或三个拷贝等的平均。模板(和/或靶)的拷贝可具有在分块当中的随机 分布，其可被描述为泊松分布。在一些情况下，相当大数量的分块(例如 分块的至少大约1％、2％、5％、10％或20％等)可包含至少两个靶中的每 个的拷贝，和/或多个分块每个可包含所有靶的至少一个拷贝。

当分块形成时，靶可以是未链接的、部分链接的或完全链接的。链接 的靶可共价地或通过碱基配对附着到彼此。

每个靶可以是感兴趣的分析物(例如感兴趣的核苷酸序列)或对此的 替代物(例如结合到和/或相应于感兴趣的核苷酸序列的核酸)。靶可以是 包括核苷酸序列的核酸。靶如果是核酸则可以是单链的或双链的等。核酸 靶可由模板提供，靶形成模板的至少一部分或全部。靶可相应于通过扩增 产生的扩增子。扩增子可以是单链的或双链的等。在一些情况下，靶可以 是或相应于不是核酸的分析物，例如小分子、多肽、脂质、氨基酸、离子 等。

可通过将含样本体相的部分分配或分离成分块来提供分块。包括多达 所有体相的任何适当的分数可被分配到分块。每个分块可以是和/或包括与 其它分块的流体体积隔离的流体体积。分块可通过流体相例如乳剂的连续 相、通过固体相例如容器的至少一个壁或其组合等与彼此隔离。在一些实 施方式中，分块可以是布置在连续相中的液滴，使得液滴和连续相共同形 成乳剂。

分块可通过任何适当的程序以任何适当的方式形成且具有任何适当 的特性。例如，分块可用流体分配器例如吸液管形成、用至少一个液滴发 生器、通过样本的搅动(例如摇动、搅拌、超声处理等)而形成和/或类似 地形成。相应地，分块可连续地、并行地或批量地形成。分块可具有任何 适当的一个或多个体积。分块可具有实质上均匀的体积或可具有不同的体 积。具有实质上相同的体积的示例性分块是单分散液滴。分块的示例性体 积包括小于大约100、10或1μL、小于大约100、10或1nL或小于大约 100、10或1pL等的平均体积。

分块当最初形成时可胜任在分块中的一个或多个反应的执行。可选 地，一个或多个试剂可被添加到分块——在它们形成之后，以提供能胜任 反应的分块。可通过任何适当的机制例如流体分配器、分块/液滴的融合等 添加试剂。

反应的执行。可在分块中执行相应于每个靶的反应，在56处指示。 反应可以是酶催化反应。反应可产生可在反应期间线性地或指数地等增加 的产物。

每个靶的反应可以是扩增存在于单独的分块中的靶的拷贝的扩增反 应。每个靶的扩增可选择性地出现在包含靶的至少一个拷贝(例如包含包 括靶的模板的至少一个拷贝)的分块中。扩增可以是线性地或指数地等。

扩增可以或可以不等温地执行。在一些情况下可通过在一个或多个周 期期间加热分块和/或在高于室温的温度下例如在变性温度、退火温度和/ 或延展温度下培养分块来激励在分块中的扩增。在一些例子中，分块可热 循环以促进聚合酶链反应和/或连接酶链反应。可以是适当的示例性等温扩 增方法包括基于核酸序列的扩增、转录介导扩增、多重置换扩增、链置换 扩增、滚环扩增、DNA的环介导扩增、赖解旋酶扩增和单引物扩增等。

数据收集。可从分块中的报告物收集数据，在58处指示。分块可以 包含仅仅一个报告物或具有任何适当的结构和特征的多个不同的报告物。 每个报告物可以是特异性报告物(例如探针)或通用报告物(例如嵌入染 料)。在一些情况下，至少一个特异性报告物可就仅仅一个特定的反应和 因而在多重分析中的仅仅一个靶的出现提出报告。在其它情况下，特异性 报告物可就两个或两个以上反应和因而两个或两个以上靶的出现提出报 告。每个报告物可互换地可被称为反应报告物和/或扩增报告物。

特异性报告物基于产物的同一性以相当大的特异性结合到反应的产 物(例如扩增子)，实质上排除与产物同一类别的其它结构上不同的物质。 例如，每个特异性报告物可结合到特定序列或部位，实质上排除其它序列 或部位。特异性报告物可包括或可以是包括至少一个核酸(例如至少一个 寡核苷酸)的探针，其特别结合到存在于靶和/或相应于靶的扩增子中的互 补核苷酸序列。探针可包括与寡核苷酸(例如共价地附着或非共价地结合 等)相关的标签。标签可以是直接或间接地光学地可检测的。因此，标签 可以是发光基团(例如光致发光部分(例如荧光团或磷光粉)、酶(例如 过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、磷酸二酯酶等)、特定的结合对 的成员(例如生物素或抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白)或表位标签等。 包括发光基团的探针可以或可以不也包括发光基团的能量转移伙伴，例如 淬熄剂或另一发光基团(例如以产生发光共振能量转移(例如FRET))。 探针可以或可以不也起在分析中扩展的引物的作用。示例性标记的探针包 括探针、探针/引物、探针、探针、 分子信标探针、引物、当相邻于彼此结合在扩增子上时展示FRET的 杂化探针的接近相关对、引物等。

特异性报告物可具有不同的形式或状态。特异性报告物可具有初始/ 完整的形式或状态和一个或多个降解/改性的形式或状态。可在第二靶的扩 增期间从初始/完整的形式或状态产生一个或多个降解/改性的形式或状 态。形式或状态可以是光学地可区分的。例如，降解/改性的形式可以是比 初始/完整的形式更光致发光的或更不光致发光的。

通用报告物(可互换地被称为非特异性报告物)在没有相当大的特异 性的情况下结合到反应的产物(例如扩增子)，使得与该产物相同类别的 其它结构上不同的物质(例如不相关的序列的其它扩增子)也可由报告物 结合。非特定结合可以不取决于报告物和产物(例如靶和/或扩增子)中的 一个或两个的原子的布置的唯一特征。通用报告物的多个拷贝可能能够结 合到反应产物的单个拷贝，例如所结合的拷贝的数量与反应产物的数量或 长度直接相关例如成比例。例如，通用报告物可以是相对非特异地结合到 核酸的光致发光染料。染料可以不附着到赋予相当大的序列结合特异性的 寡核苷酸。染料可以是大沟结合剂、小沟结合剂、嵌入剂或外部结合剂等。 相对于单链核酸，染料可以优先结合到双链和/或相对于单链核酸，可在结 合到双链时展示在光致发光特性(即发射强度)中的较大变化。可以是适 当的示例性染料包括发光花青、菲啶、吖啶、吲哚、咪唑等，例如DAPI、 33258染料、吖啶橙等。可以是适当的示例性嵌入染料包括菲啶 溴红、碘化吡啶、染料、绿染料、金染料和7- 氨基放线菌素D(7-AAD)等。

可在多重分析中分析R个靶，且可在少于R个光学通道中(例如在不 同的波带中)收集数据。换句话说，被分析的靶的数量(R)可以大于用 于检测靶特定反应的光学通道的数量。在一些情况下，可以在仅仅一个或 两个光学通道中或在至少两个、三个或三个以上光学通道中等收集数据。 在一些情况下，可从与在分析中的靶相同数量的光学通道收集数据。光学 通道可互换地可被称为检测通道。

光学通道可代表特定的检测体系，发射光使用该检测体系被产生和检 测。该检测体系可以以用于发射光的检测的频谱内容(即波长体系)为特 征。如果脉冲激发光在检测体系中用于引起光发射，则检测体系可以以用 于使用激发光照亮的频谱内容(波长或波段)和/或时间间隔(在其期间， 光发射关于每个光脉冲被检测到)为特征。相应地，彼此不同的光学通道 可关于激发光的频谱内容(波长/波段)、关于被检测到的发射光的频谱内 容(波长/波段)和/或关于时间间隔(在其期间，发射光相对于激发光的 每个脉冲被检测)等不同。

数据收集可包括产生代表检测到的光的一个或多个信号。信号可代表 在来自两个或两个以上不同的靶的一个或多个报告物的相同光学通道中 检测的光的方面，例如光的强度。信号可选地可包括在两个或两个以上不 同的光学通道中(例如在不同的波长和/或不同的波长范围(波段)和/或 颜色体系下)从相同和/或不同的靶的报告物收集的数据。从每个报告物检 测的光可以是从发光基团(例如荧光团)发射的光。在给定通道中检测的 光可被检测，使得来自不同的报告物的光被合计或累积而没有对特异性报 告物的贡献。因此，给定通道的信号可以是代表两个、三个、四个或更多 个报告物和/或分析以及两个、三个、四个或更多个靶的复合信号。

可基于由通用报告物发射的检测到的光和可选地从分块中的一个或 多个其它报告物来创建信号。一个或多个其它报告物可报告由信号表示的 两个或两个以上特定的扩增反应中的至少一个是否出现在分块中，以及因 此相应于两个或两个以上特定扩增反应的两个或两个以上特定靶中的至 少一个的至少一个拷贝是否存在于分块中。相应于报告物的信号的水平或 振幅可被分析以确定是否至少一个特定反应出现以及一个特定靶的至少 一个拷贝存在。信号的水平或振幅可根据是否至少一个特定反应出现以及 至少一个特定靶在每个分块中存在或缺乏而在分块当中改变。例如，对特 定靶为阳性的分块可产生在给定阈值之上和/或在给定范围之内的信号水 平或振幅。分块被分析，并且可在任何适当的时间创建信号。示例性时间 包括分析的末尾(端点分析)，当反应运行到完成且数据不再改变时或在 某个更早的时间，只要数据被足够和可靠地分离。

可在任何适当的条件下从多个分块(即分块的仅仅子集或全部)收集 数据。可在大约相同的温度下从多个分块、在低于每个扩增子的熔化温度 的温度下和/或在大约50摄氏度之下等收集所有数据。可在对每个靶到达 扩增的端点之后收集扩增数据。

可识别每个对零、一或多个靶的至少一个不同的组合是阳性的分块 簇。通常，如果掩蔽出现，则所有可能的组合的仅仅子集可被识别，且一 些簇可包含具有不同的靶成分的两个或两个以上群体。可由数据处理器使 用算法(例如识别数据中的模式(例如分块簇)的算法)、由用户或其组 合执行识别。在一些情况下，数据处理器可产生并输出(例如显示)所收 集的数据的图表(例如2D散布图或柱状图，或使用用于检测的三个或三 个以上光学通道、具有不同对的轴的两个或两个以上2D散布图或柱状图)。 用户可接着基于图表来界定每个簇的边界，例如通过图形用户界面来界定 群体边界和/或通过输入值(例如代表强度范围)来界定每个簇的边界。每 个簇边界可由值的一个或多个范围、围绕簇的几何形状(例如多边形、椭 圆形等)等界定。下面在第II-V章中提出簇识别的另外的方面。

本文公开的任何多重分析的反应成分和/或条件可被调节以提高在数 据中的不同分块群体的分辨率。通过在多重分析内改变特定分析物的浓 度，特定靶的反应效率可被影响，这可导致在允许使用相同的报告物和/ 或不同的报告物检测的群体彼此区分开的信号水平中的差异。通过改变反 应成分/条件，额外的靶可在同一多重反应中被检测到。在一些情况下，可 通过改变靶的一个或两个引物的浓度来调节靶的信号振幅。改变引物浓度 而不改变报告物浓度可能在分析中是有用的，其中相同的报告物(例如探 针或通用报告物)用于检测两个或两个以上靶，但这两个靶中的每个使用 至少一个不同的引物被扩增。在一些情况下，可通过改变用于热循环的退 火温度、dNTP的总浓度、单独的dNTP相对于彼此的数量(例如，如果 这两个靶具有实质上不同的基本成分)等来调节一个或多个靶的信号振 幅。

可得到每个分块簇的分块计数。分块计数可以是代表构成特定分块簇 的分块的数量的值。

可从所收集的数据确定对每个靶为阳性(或阴性)的分块的数量。从 每个分块检测的信号和分块本身可被分类为对促成信号的每个反应/靶是 阳性的或阴性的。分类可基于信号的强度(和/或其它适当的方面)。例如， 分类可基于在信号光学通道中或在两个或两个以上光学通道中从分块检 测的光的强度。如果信号/分块对于给定靶被分类为(测试)阳性的(+)， 则相应于那个靶的反应被认为出现且靶的至少一个拷贝被认为存在于分 块中。相反，如果信号/分块对于给定靶被分类为阴性的(-)，则相应于那 个靶的反应被认为没有出现且靶没有拷贝被认为存在于分块中(即靶被认 为从分块缺乏)。

包括靶的所有组合(即每个靶的存在或缺乏的所有组合)的数据将通 常代表2^R个群体，每个具有不同的靶内容，其中R是不同靶的数量。例 如，在三个靶(A-C,R＝3)的情况下，有八个群体：()、(A)、(B)、(C)、 (AB)、(AC)、(BC)和(ABC)，每个具有不同的靶内容。如果靶掩蔽出现， 则一些群体将重叠和/或将彼此不区分开为很好地分辨的簇。替代地，一些 群体可彼此重叠以形成具有一个或多个靶的异质靶内容的至少一个异质 群体。相应地，使用靶掩蔽和/或使用如在本公开的其它地方描述的其它分 析配置可产生少于2^R个很好地分辨的簇。

靶浓度的确定。可确定每个靶的浓度，在60处指示。可从所收集的 数据的子集确定至少一个靶的浓度。例如，可从数据的仅仅子集确定至少 一个被掩蔽靶的浓度。数据的子集可以选择性地排除对至少部分地使在包 含两个靶的拷贝的分块中的被掩蔽靶的存在模糊的模糊靶为阳性的分块。

可排除分块的任何适当子集，用于计算给定靶的浓度，而不使所确定 的浓度偏移，如果排除的基础独立于靶的存在/缺乏。例如，在靶A和B 的分析中，可从靶A的浓度的计算中排除所有B阳性分块(或其任何适当 的子集)，如果对B为阳性独立于A的存在或缺乏。(例如，当分块形成时 没有在靶A和B之间的相当大的关联或联系)。相应地，如果所有B阳性 分块存在于同一簇(两个或两个以上簇)中，则可从靶A的浓度的计算排 除整个簇(或两个或两个以上簇)，而不使结果偏移。作为另一例子，在 未链接的靶A、B和C的分析中，可确定靶A的浓度，所有B阳性和所有 C阳性被排除，只有B阳性或只有C阳性被排除，或独立于A的存在/缺 乏的B阳性和C阳性的任何组合被排除(例如所有BC阳性，而不考虑A 阴性或A阳性)。在同一分析中，可从所有数据确定靶B(或靶C)的浓 度，如果从缺乏靶B(靶C)的拷贝的所有其它群体分辨所有B阳性(或 所有C阳性)。可选地，可从排除独立于B(或C)的存在/缺乏的分块的 数据的仅仅子集确定靶B(或靶C)的浓度。

靶浓度的确定可以(或可以不)基于具有在分块当中的泊松分布的每 个靶。每个浓度可以例如是代表每分块靶的拷贝的平均数量的值。分块数 据还可以用于使用任何适当的算法来(例如直接地和/或作为浓度数据)估 计拷贝数(CN)和拷贝数变化(CNV)。

可使用泊松统计来确定每个靶的水平例如浓度。可通过假设靶的拷贝 (在扩增之前)在分块当中具有泊松分布来从对靶为阳性的分块的分数 (或同样地，对靶为阴性的分块的分数)计算在分块中的靶的浓度。使用 这个假设，具有靶的k个拷贝的分块的分数f(k)由下面的等式给出：

$f\left(k\right)=\frac{{\lambda }^k}{k!}{e}^{-\lambda }---\left(1\right)$

在这里，λ是在分块中的靶的浓度，其被表示为每分块靶拷贝的平均数量 (在扩增之前)。简化的泊松等式可从上面的更一般的等式得到并可用于 从阳性分块的分数确定靶浓度。可被使用的示例性泊松等式如下：

$\lambda =-ln(1-\frac{N_{+}}{N_{tot}})---\left(2\right)$

其中N₊是对给定靶为阳性的分块的数量(即分块计数)，且其中N_tot是对 靶为阳性或阴性的分块的总数。N_tot等于(a)靶的N₊和(b)对靶为阴性 的分块的数量或N_–的和。N₊/N_tot(或N₊/(N₊+N_–)等于f₊，其是对靶为阳 性的分块的分数(即f₊＝f(1)+f(2)+f(3)+…)(见等式1)，且其是分块具有 靶的至少一个拷贝的概率的所测量的估计。可被使用的另一示例性泊松等 式如下：

$\lambda =-\ln \left(\frac{N_{-}}{N_{tot}}\right)---\left(3\right)$

其中N_–和N_tot如上定义。N_–/N_tot等于f₀，其是阴性分块的分数(或1–f₊)， 是分块没有靶的拷贝的概率的所测量的估计，且λ是如上所述的靶浓度。

上面的等式2和3可重新布置以产生下式：

λ＝ln(N_tot)-ln(N_tot-N₊)(4)

上面的等式2和3可重新布置以产生下式：

λ＝ln(N_tot)-ln(N_-)(5)

可例如对每个靶使用对N_tot和N_–或N₊得到的值(即分块计数)使用 等式2-5中的任一个来在多重分析中确定每个靶的浓度。在一些情况下， 用于N_tot(总分块计数)的值对于每个靶可以是相同的。在其它情况下， 用于N_tot的值可改变，例如，如果一些群体由于群体重叠(靶掩蔽)而从 总计数排除。在一些实施方式中，N_tot可以等于所有群体的组合，即对所 识别的所有群体的分块计数的和。

用于N_–或N₊的值通常对于每个靶是不同的，且可从合计来自多个分 块群体的计数产生，每个分块群体包含在多重分析中测试的靶的不同组 合。例如，在多重分析中的三个靶(A、B和C)的情况下，对靶A为阳 性的分块的数量N_+A可被计算为来自单(仅仅A)、双(AB和AC)和三 (ABC)阳性群体的计数的和，用于在等式2或4中使用。同样，可计算 对靶A为阴性的分块的数量N_–A，用于在等式3或5中使用，作为在N_tot和N_+A之间的差异。可选地，对A为阴性的分块的数量可被计算为来自对 靶A为阴性的每个分块的计数的和，即在这个例子中的三阴性(“空”)群 体、两个单阳性群体(B和C)和一个双阳性群体(BC)。可使用来自群 体的适当子集的分块计数对每个其它靶重复相同的过程。

在一些实施方式中，可直接从阳性分数得到靶的水平的估计，而不使 用泊松统计。特别是，当浓度降低时，阳性分数和浓度(每分块拷贝)收 敛。例如，在0.1的阳性分数的情况下，浓度使用等式2被确定为大约0.105， 只有5％的差异；在0.01的阳性分数的情况下，浓度被确定为大约0.01005， 只有0.5％的更小10倍的差异。然而，泊松统计的使用可提供浓度的更准 确的估计，特别是使用相对更高的阳性分数，因为该等式解释每分块多个 靶拷贝的出现。

图2示出用于执行图1的数字分析的示例性系统70。系统70可包括 分配组件，例如液滴发生器72(“DG”)、热培养组件例如热循环器74 (“TC”)、检测组件(检测器)76(“DET”)和数据处理组件(数据处理 器)78(“PROC”)或其任何组合等。数据处理组件可以是或可包括在控 制器中，控制器可与组件的任何适当组合通信并控制组件的任何适当组合 的操作。在组件之间的箭头指示材料例如流体(例如乳剂的连续相)和/ 或分块(例如液滴)或信号/数据在组件之间的运动或传送。组件的任何适 当组合可操作地连接到彼此，和/或一个或多个组件可以不连接到其它组 件，使得例如材料/数据被手动地传送。

检测器76可提供多个光学通道，其中数据可被收集。检测器对每个 光学通道可具有不同的传感器或检测单元。

系统70可如下操作。液滴发生器72可形成布置在连续相中的液滴。 液滴可用热循环器74热循环以促进在液滴中的靶的扩增。可使用检测器 76从液滴检测信号。信号可由处理器78处理以确定液滴的数量和/或靶浓 度等。系统可包括可选地存在于计算机可读存储介质上并包括用于使数据 处理器和/或控制器执行和/或控制在本文例如在图1中公开的步骤的任何 适当组合的指令的程序。

在第II-V章中和在上面在通过引用并入本文的交叉引用下识别的参 考资料中描述了可适合于本公开的系统的样本制备、分块形成(例如液滴 产生)、数据收集、群体识别和/或簇分配、得到分块计数和靶水平确定等 的另外的方面。

II.被掩蔽靶和掩蔽靶的浓度的确定

本章描述确定当靶掩蔽出现时和/或当分块群体在所收集的数据中彼 此重叠时的靶浓度的示例性方法；见图3-5。

在使用用于检测的两个或两个以上光学通道执行的一般双重(两靶) 分析中，在相同的分块中的不同靶的存在导致在不同通道中的信号。然而 在一些情况下，只有一个检测通道可由双重分析利用，这可使一个靶掩蔽 另一靶的可检测性。例如，当明显不同的扩增效率的两个扩增子在同一液 滴中产生并可经由同一通用报告物例如从得到的染料检测时，掩 蔽可出现。更慢地累积的扩增子的存在可由更快地累积的扩增子掩蔽(例 如见实例2)。可在下一代序列(NGS)库形成中找到另一实例。只包含一 对适应物而没有插入物的产物可在竞争中胜过完全形成的物种且因此在 单通道分析中掩蔽它们(例如见实例1)。本公开使产生靶掩蔽的一对竞争 的靶的浓度的鲁棒计算变得可能。

在单通道分析中，可能准确地测量所提供的多个竞争物种的浓度：(1) 物种产生不同的信号水平，(2)物种的等级次序掩蔽或抑制存在，以及(3) 信号分离成条带模式，允许在带中的分块的计数。在实践中这样的情况的 例子包括可变尺寸扩增子，例如mRNA相对于前体RNA、具有小插入或 删除的基因座、NGS库定量等。

图3示出可在单个检测通道中收集的扩增数据的示意性图表。该图表 绘制作为检测到的事件数的函数的信号振幅(例如光致发光强度，例如荧 光强度)。每个事件代表由检测到的分块90(例如流经检测区的液滴92) 引起的在信号强度中的尖峰信号或波。对每个分块/事件绘制的振幅可以是 相应的尖峰信号或波的最大信号值、平均信号值或积分信号值等。图3的 x轴可选地可被标记为时间或分块数等。

由图3的数据表示的分块共同包含产生相应的典型的更高和更低振幅 信号的掩蔽靶94(“H”)和被掩蔽靶96(“L”)。当靶H的至少一个拷贝 存在于分块中时，更高振幅信号占优势，如在98由一组H阳性分块例示 的。从每个H阳性分块检测更高振幅信号，而不管靶L的拷贝是否也存在 于分块中。换句话说，通过靶H的扩增产生的信号掩蔽来自靶L的扩增 的信号，因为相比于只通过靶H的扩增产生的信号，靶L不明显增加(或 降低)信号振幅。相反，当只有靶L的一个或多个拷贝存在于分块中时(即 在缺乏靶H的任何拷贝的情况下)，从分块检测较低振幅信号，如在100 由一组L阳性、H阴性分块例示的。单独的分块例如不包含任一靶(“空” 或“阴性”；缩写的“E”)的拷贝的分块102产生甚至更低的基线信号。 相应地，分块的三个带104、106、108在图表中是可见的。(带可互换地 被称为簇。)带104代表H阳性分块(±L)，带106代表是H阴性的L阳 性分块，以及带108代表H和L阴性分块。

可确定在每个带中的分块的数量(可互换地被称为计数)，且例如使 用第I章的等式5来计算每个靶的浓度。然而，使用这种方法将低估被掩 蔽靶L的浓度，如果在计算中包括所有分块。相应地，只有数据的子集可 用来确定靶L的浓度。

用于计算特定因子(例如单个物种或靶、物种或靶的组合等)的浓度 值(每分块拷贝(cpp))的通用公式如下：

λ_因子＝ln(N_tot)-ln(N_非因子)(6)

其中λ_因子是因子的以cpp单位的浓度，N_tot是所观察的分块的总数，以及 N_非因子是不展示因子的分块的数量(其在等式3和5中被写为N_-)。

因为所有H阳性分块是可检测的，下面的等式成立：

λ_H＝ln(N_E+N_L+N_H)-ln(N_E+N_L)(7)

其中λ_H是掩蔽靶H的浓度，N_E是空分块的数量，N_H是更高振幅分块的数 量，以及N_L是更低振幅分块的数量。

被掩蔽靶L的存在独立于在分块中的掩蔽靶H的存在。相应地，H阳 性分块相对于靶L是不偏的。换句话说，可从被掩蔽靶L的浓度计算排除 H阳性分块。换句话说，从较低带106、108计算的靶L的浓度应是与从 所有三个带计算的浓度相同的缺乏统计变化(如果L靶未被掩蔽)。解释 这种方法的另一方式是，如果由于某个原因更高振幅分块变得不可见，且 只有更低振幅和空(阴性)带是可见的，则靶L的浓度仍可被准确地计算 如下：

λ_L＝ln(N_E+N_L)-ln(N_E)(8)

总靶浓度(即L或H的浓度)可以用两种不同的方式被计算。第一种 方法如下：

λ_L或H＝ln(N_E+N_L+N_H)-ln(N_E)(9)

可选地，可将被单独地计算的靶L和H的两个浓度求和：

λ_L或H＝λ_H+λ_L(10)

用来自等式7和8的项代入产生下式：

λ_L或H＝[ln(N_E+N_L+N_H)-ln(N_E+N_L)]+

[ln(N_E+N_L)-ln(N_E)](11)

等式11简化到下式：

λ_L或H＝ln(N_E+N_L+N_H)-ln(N_E)(12)

因此，这两种方法给出相同的答案。在任何情况下，更一般地，可从 分块的仅仅子集计算每个被掩蔽靶的浓度，该子集选择性地排除对至少部 分地使被掩蔽靶的存在模糊的模糊靶为阳性的分块的每个群体。

图3A示出可如在图3中的收集的数据的另一示意性图表。在这里， 双阳性分块(H+L)的群体112展示在只包含靶H的单阳性分块的群体114 之上的信号振幅中的小的可检测到的增加。然而，在由群体112中的L靶 的拷贝产生的信号振幅中的增加不足以完全分辨来自彼此的两个更高振 幅群体。换句话说，每种类型的分块H+L和仅H不能可靠地区分开彼此； 在分块中的靶H的存在至少部分地掩蔽靶L的存在。相应地，可通过从用 于计算的分块的集合排除群体112和114来更准确地确定靶L的浓度，如 在上面的等式8中的。

图4示出可通常如在图3中的收集的数据的另一示意性图表。然而在 这里，掩蔽靶是靶L，其具有更低振幅信号，且被掩蔽靶是靶H，其具有 更高振幅信号。作为结果，在分块的同一带或簇中，可检测的H阳性分块 120不包含靶L的拷贝，而L阳性分块122可不包含拷贝或包含靶H的一 个或多个拷贝。

可以通过从在计算中使用的分块计数中排除L阳性分块用类似于上面 的等式8的方式计算在图4中的被掩蔽靶H的浓度：

λ_H＝ln(N_E+N_H)-ln(N_E)(13)

可以用类似于上面的等式7的方式计算在图4中的靶L的浓度，因为 靶L未被掩蔽且所有L阳性分块是可检测到的：

λ_L＝ln(N_E+N_L+N_H)-ln(N_E+N_H)(14)

图5示出可在单个检测通道中从分块例如液滴收集的数据的示意性图 表，分块共同包含根据掩蔽等级结构顺序地掩蔽彼此的k个靶。更具体地， k个靶可以从1到k按等级排序，使得在分块中的等级i的靶的存在掩蔽具 有更低等级(即i-1,i-2,…,1)的每个靶的存在。在这里，来自等级i的靶 的信号比来自更低等级的每个靶的更强，但信号振幅的任何可分配的顺序 可以是适当的。例如在一些情况下，更高等级的每个连续靶的信号振幅可 相对于更低等级的每个靶降低(使得靶k具有最接近空分块的信号振幅)， 或信号振幅可以不根据等级顺序单调地增加或降低。

分块的数据分布在k个靶阳性带(B₁,B₂,…,B_k)当中加上最低振幅 (B₀)的空/阴性分块的带。对于等级i的每个靶阳性带，只有包含具有等 级i或更低，即i-1,i-2,…的靶的分块存在于带中(否则，这样的分块将移 动到更高等级的带)。

可使用归纳法来计算所有靶的正确浓度。每个靶的浓度可以使用下面 的表达式被“脱掉”，其中N_i是在带B_i中的分块的数量：

λ₁＝ln(N₀+N₁)-ln(N₀)(15)

λ₂＝ln(N₀+N₁+N₂)-ln(N₀+N₁)(16)

且对于第i种情况：

λ_i＝ln(N₀+N₁+…+N_i)-ln(N₀+N₁+…+N_i-1)(17)

这种方法可如在上面的等式9到12中的被证实：

λ₁+λ₂+…+λ_k＝ln(N₀+N₁+…N_k)-ln(N₀)(18)

λ_tot＝ln(N_tot)-ln(N₀)(19)

这里介绍的单通道实例可扩展到在两个或两个以上检测通道中收集 的数据(例如通过在通道中的发射光的两个或两个以上不同的波带的检 测；见第III和IV章)。在一些情况下，如果从通道特异性报告物收集数 据，数据可“收缩”到两个或两个以上靶的单个通道内，这些靶在那个通 道中通过忽略由在其它检测通道中的振幅差异产生的可区别的群体而被 多重化。

III.使用靶掩蔽的示例性分析配置

本章描述示例性的其中靶掩蔽可出现的多重分析配置和/或在数据中 的不同靶内容的分块群体；见图6-17。可使用数据排除如在第II章中所述 的来处理来自任何多重分析的数据用于计算靶的至少一个水平。

靶掩蔽可通过任何适当的机制出现。在一些情况下，掩蔽可从在同一 分块中的两个(或多个)不同的靶的扩增的不同效率产生，更有效地扩增 的靶(优势靶)掩蔽更不有效地扩增的靶(可掩蔽靶)。在同一分块中的 优势和可掩蔽靶的分析之间的竞争可减弱或消除在优势靶缺乏的情况下、 通常为在分块中的可掩蔽靶的分析而检测的信号变化。换句话说，竞争可 防止可掩蔽靶分析到达它的一般端点。通过在竞争中胜过可掩蔽靶，优势 靶可耗尽或垄断这两个靶的分析所需的限制试剂。限制试剂可以是用于这 两个靶的扩增的引物、结合到这两个靶的扩增子的报告物、一个或多个 dNTP(和/或NTP)、在分析期间失去相当大的活动的扩增酶等。可选地或 此外，通过在竞争中胜过可掩蔽靶，优势靶可在足够的浓度下产生抑制产 物例如核酸(例如扩增子)以抑制扩增，以防止可掩蔽靶分析到达它的一 般端点。在一些情况下，掩蔽可出现而没有在靶之间的相当大的竞争。

图6示出来自能够产生图3的数据的示例性多重数字分析的分块140。 多重分析配置成执行对两个靶，即优势靶H和被掩蔽靶L的单独分析。分 块140包含每个靶的拷贝，每个拷贝由可以是单链的或双链的相应的模板 142、144提供。(在分析中的其它分块将包含仅仅靶H、仅仅靶L或不包 含这两个靶。)模板具有与彼此相同的序列，如由具有相同的线粗的区指 示的，这允许这两个模板特别由同一对正向和反向引物(F和R)和由同 一探针(P)结合。相应地，来自两个靶分析的信号可在同一检测通道中 被检测。在这里，探针包括用发光基团148(或荧光团)标记的核酸146 (或寡核苷酸)以产生发光信号。探针也可包括熄灭来自发光基团的光致 发光的淬熄剂，直到淬熄剂和发光基团更远地间隔开(例如通过探针的降 解和/或探针到扩增子的杂化等)。

由于位于引物结合部位之间且不存在于模板142中的额外序列150的 存在，模板144比模板142更长。(序列150由更粗的线段表示。)作为结 果，靶H相对于靶L的扩增产生更短的扩增子，这使靶H的扩增比靶L 的扩增更有效地继续进行。在分块中掩蔽靶L的存在。来自分析的数据可 如在第II章中所述的被处理。

图7示出来自能够产生图4的数据的示例性多重数字分析的分块160。 多重分析配置成执行对两个靶，即优势或掩蔽靶L和被掩蔽靶H的单独分 析。分块160类似于图6的分块140，除了探针(P)用当结合到双链核酸 (例如扩增子)时更强地光致发光的通用报告物162例如嵌入染料代替以 外。(报告物162可互换地可被称为染料。)可在单个光学通道或两个或两 个以上光学通道中检测来自染料162的光发射。

染料162的拷贝/分子可以用长度相关方式结合到扩增子，使得报告物 的更多拷贝相对于从模板142产生的更短扩增子的拷贝结合到从模板144 产生的更长扩增子的拷贝。作为结果，来自模板144的靶的扩增在模板142 缺乏的情况下产生比来自模板142的扩增更高强度的荧光信号(即模板144 现在相应于靶H且模板142相应于靶L(与图6比较))。然而，更短的靶 掩蔽更长的靶，如对图6描述的，所以靶H是在这个分析配置中的被掩蔽 靶。(也见第V章的实例2。)

图8示出来自能够产生图3的数据的另一示例性多重数字分析的分块 180。分块包含优势靶H的模板182的拷贝和可掩蔽靶L的模板184的拷 贝。模板182和184具有相同的序列，除了在反向引物(R)的相应引物 结合部位中的序列变化186例如单核苷酸差异以外。更具体地，反向引物 与模板182形成完美双螺旋和与模板184形成失配双螺旋。作为结果，靶 H比靶L更有效地被扩增，这在这两个靶存在于同一分块中时掩蔽了靶L 的存在。由失配反向引物引起的扩增低效在缺乏靶H的情况下也引起靶L 的更低检测到的信号。

图9示出来自能够产生图3的数据的又一示例性多重数字分析的分块 200。分块包含优势靶H的模板202的拷贝和可掩蔽靶L的模板204的拷 贝。模板202和204具有相同的序列，除了在探针(P)的相应探针结合 部位中的序列变化206例如单核苷酸多态以外。更具体地，探针与靶H的 扩增子形成完美双螺旋和与靶L的扩增子形成失配双螺旋。作为结果，靶 H和L以相同的效率被扩增，但探针相对于靶L的扩增子更有效地结合到 靶H的扩增子，这在这两者都存在于同一分块中时掩蔽了靶L的存在。由 失配探针引起的扩增低效在缺乏靶H的情况下也引起靶L的更低信号。

图10示出来自能够产生图3的数据的示例性多重数字分析的分块 220。分块220包含靶H的模板222的拷贝和靶L的模板224的拷贝。靶 H和L由如更厚的模板222和更薄的模板224代表的不同序列组成。相应 地，靶H和L由不同对的引物(F_H和R_H或F_L和R_L)扩增，扩增由不同 的探针(P_H和P_L)报告。靶H比靶L短，并实质上更有效地被扩增，这 给予靶H更高端点信号并可使靶H对靶L是优势的。

图11示出来自使用单个检测通道执行的示例性多重数字分析的分块 230。根据反应条件(例如反应引物浓度和/或引物杂化的退火温度等)，分 块包含可以是可掩蔽的靶A的拷贝和可至少部分地掩蔽靶A的存在的靶B 的拷贝，反之亦然。靶由如靶的更厚模板232和更薄模板234所代表的不 同的序列组成。靶被以不同的相应对的正向和反向引物(F_A和R_A或F_B和 R_B)扩增。扩增由同一通用报告物162(例如嵌入染料)对这两个靶报告。

图11A示出可为图11的多重数字分析在单个检测通道中从五组分块 (线道1-5)收集的荧光强度数据的示意性图表。每组包含相同浓度的靶A 和B、正向引物A和反向引物A和B以及靶B的可变浓度的正向引物B。

线道1代表从只结合到靶A的扩增子的通用报告物162检测的信号； 由于正向引物B的缺乏，靶B展示在线道1中没有扩增。只包含靶A的 分块群体(在这里，带(A))具有增加的信号振幅且与阴性分块充分分离， 由()指示。

线道2和3代表使用较低浓度的正向引物B检测的信号。三个靶阳性 带(A、B和AB)形成单个簇，组成群体不彼此分辨开。由于与靶B的竞 争，靶A的带的位置可以(或可以不)改变(例如在振幅上降低)。然而， 靶A的带在这里被显示在所有线道中有相同的位置，以简化演示。

线道4和5示出与靶A的带分辨开的B阳性带。在线道4中，两个B 阳性群体重叠。来自线道4的数据可用来确定如上面对图3描述的两个靶 的浓度。特别是，线道4的所有数据可用于计算靶B的浓度，且只有最低 的两个带用于计算靶A的浓度。在线道5中，所有四个群体被分辨，这允 许靶5的所有数据用于计算每个靶的浓度。在其它情况下，至少一对引物 (例如靶B的F_B和R_B)的浓度、退火温度和/或类似物可被调节以提供来 自至少一个其它靶阳性群体的仅仅A群体的足够分辨率。

图12示出来自使用两个检测通道执行的示例性多重数字分析的分块 240。分块包含被掩蔽靶A的拷贝和掩蔽靶B的拷贝。靶由如靶的更厚模 板232和更薄模板234所代表的不同的序列组成。靶用不同对的正向和反 向引物(F_A和R_A或F_B和R_B)扩增。扩增由使用不同的荧光团148、242 标记的不同探针(P_A和P_B)报告。来自每个荧光团的荧光在不同的检测通 道中可检测为发射光的不同波带。

图12A示出从图12的多重分析收集的扩增数据的示意性散布图。关 于每个通道轴绘制在每个分块的每个通道中检测的荧光强度值。分别在通 道1和2中实质上排他地检测荧光团148和242。分块的荧光强度数据创 建三个不同的簇，其被顺序地编号(为0、1和2)并邻近每个簇根据靶内 容进行标识。簇“0”代表空分块，即对这两个靶为阴性的分块，指示为 ()。簇“1”代表只对靶A为阳性的分块，指示为(A)。是A阳性的分 块的信号强度相对接近于对这两个靶为阴性的那些靶，但准确的分块计数 可从簇1得到。簇“2”代表对靶B为阳性的分块，即只包含靶B的分块 的群体250，指示为(B)，以及包含靶A和B的分块的另一群体252，指 示为(AB)。然而，群体250、252没有被很好地分辨且因此不能提供单独 地对(AB)和(B)的准确分块计数。相应地，可以只使用计数N₀和N₁分别从簇0和1，即从排除所有B阳性分块(即排除来自簇2(N₂)的所 有计数)的数据的仅仅一部分计算靶A的浓度。

λ_A＝ln(N₀+N₁)-ln(N₀)(20)

另一方面可使用所有分块计数来计算靶B的浓度：

λ_B＝ln(N₀+N₁+N₂)-ln(N₀+N₁)(21)

在其它情况下，具有特定靶内容的分块的每个群体可与具有不同的靶 内容的其它群体分辨开。例如，图12A的AB和B群体可形成一对分辨的 簇，其允许使用来自四个分块群体/簇中的每个的数据来计算每个靶A和B 的浓度。更具体地，分块的总计数可基于来自所有群体/簇的分块。

IV.使用特异性报告物和通用报告物的多重分析

本章描述使用至少一个特异性报告物和通用报告物执行的两个或两 个以上靶的示例性多重分析；见图13-18。在两个光学通道中检测在这里 所示的分析。然而，检测可以在仅仅一个光学通道或三个或三个以上光学 通道中。这里公开的任何多重分析——不管是否只使用一个或多个特异性 报告物、只使用一个或多个通用报告物或特异性和通用报告物的组合被执 行——都可受益于数据排除，如果具有不同的靶内容的分块群体不在数据 中彼此分辨开。

嵌入染料例如绿染料和染料通常在PCR中用于检 测扩增子的产生。基于作为报告物的嵌入染料的分析是普遍的，因为它们 比基于探针的分析(例如使用探针、分子信标探针、引物等)更不昂贵。然而，由于至少两个原因，不普遍使用利用嵌入染料 的分析。首先，这些分析完全依赖于引物的特异性来确保只有感兴趣的靶 的扩增。对于某些基因座，只使用一对引物并不提供足够的特异性，且另 外的特异性通过带标签的探针来实现。探针增加了靶检测的特异性，因为 非特异性地由引物扩增的不想要的产物将不有助于检测到的信号，如果探 针不结合到这些产物。其次，可能难以在使用嵌入染料作为两个靶的报告 物时量化在同一井中的样本的这两个靶。然而，将感兴趣的靶的数据标准 化到样本中的至少一个参考靶(例如持家基因)通常是合乎需要的。在没 有在同一井中多重化的能力的情况下，样本必须分成用于单独的分析的多 个井以量化感兴趣的靶和参考靶。这种方法可引入误差，例如在井之间的 移液可变性。本公开使用嵌入染料作为报告物使多重分析变得可能。

可如下所述在数字分析中结合一个特异性报告物(例如至少一个带标 签的探针)来使用通用报告物，用于准确的单井量化。这种方法是有吸引 力的，因为它允许研究者实现相当大的成本节约，同时也减小实验误差， 因为两个或两个以上靶可在单个井中被同时量化。

在本章中公开的多重分析允许执行基因表达分析的研究员为他们的 参考基因购买基于探针的分析物，并为他们的感兴趣基因(GOI)使用利 用通用报告物的基于引物的分析。如果研究员正研究很多基因，则可能有 相当大的成本节约，因为只有一个或几个探针需要被购买且其它分析使用 通用报告物被检测。可实现感兴趣的靶和参考模板的单井量化，从而消除 当前阻碍嵌入染料用于基因表达或其它研究的移液可变性。通常，在同一 多重分析中测量多于一个靶允许所装载的DNA的数量的自动标准化，如 在拷贝数变化或其它应用中使用的。

图13示出来自使用两个检测通道执行的另一示例性多重数字分析的 分块260。多重分析如图11中所示的被配置，除了靶A的特异性报告物用 通用报告物162代替以外，通用报告物162能够结合到靶A和靶B的扩增 子。分析具有特异性报告物——靶B的探针B(P_B)。靶A至少部分地被 靶B的存在掩蔽。然而，可如下面所示的确定这两个靶的浓度。

图14示出可从图13的多重数字分析收集的扩增数据的示意性散布 图。对每个分块在每个通道中检测的荧光强度值相对于每个通道轴被绘 制。报告模板A和B的扩增的染料162和只报告靶B的扩增的荧光团242 实质上排他地分别在通道1和2中被检测。换句话说，在基于探针的化验 物和嵌入染料之间有足够的频谱分离以区分单独的簇。分块的荧光强度数 据创建三个不同的簇，其被顺序地编号(为0、1和2)并邻近每个簇根据 靶内容进行标识，如在图12A中的。簇“2”代表对靶B为阳性的分块， 即只包含靶B的分块的群体270和包含靶A和B的分块的另一群体272。 然而，群体270、272没有被很好地分辨，且因而不能提供单独地对(AB) 和(B)的准确分块计数。相应地，可分别使用等式20和21来计算靶A 和B的浓度。在示例性实施方式中，靶A是RPP30，而靶B是MRG。

在其它情况下，具有特定的靶内容的分块的每个群体可与具有不同靶 内容的其它分块分辨开。例如，图14(或下面的图14A)的AB和B群体 可形成一对分辨开的簇，这将允许使用来自四个分块群体/簇中的每个的数 据来计算每个靶A和B的浓度。更具体地，用于计算每个浓度的分块的 相同总计数可基于来自所有群体/簇的分块。

图14A示出来自使用单个检测通道执行的示例性多重数字分析的分 块274的示意图。如图13所示的配置多重分析，除了靶B的探针B(P_B) 用荧光团148标记以外，这允许来自通用报告物162的荧光和探针B的荧 光团148在同一通道中被检测。分块274包含靶A和靶B的拷贝，每个可 用不同对的正向和反向引物(F_A和R_A或F_B和R_B)扩增。

图14B示出为图14A的多重数字分析在单个检测通道中从五组分块 (线道1-5)收集的荧光强度数据的示意性图表。分块组1-5包含相同浓度 的靶A和B和两对引物，但具有靶B特有的可变浓度的探针(P_B)。

线道1代表只从通用报告物162检测的信号(探针B不存在)。包含 仅仅靶A(A)、仅仅靶B(B)或靶A和B(AB)的分块群体具有增加 的信号振幅，且从阴性分块()充分分离。然而，这三个靶-阳性群体彼此 不分辨开。

线道2-5代表从使用增加的浓度的探针B执行的分析检测的信号。靶 A的带的位置可以不改变，但每个B阳性带在具有探针B的增加的浓度的 曲线中向上迁移，以产生B阴性和B阳性群体的清楚分离。相应地，线道 4或线道5的数据可用来准确地确定靶A和B的浓度。可使用等式20只 从数据的子集、即从阴性带()的分块计数和仅A带(A)确定靶A的浓 度。可使用等式21从在任一线道中的所有带的分块计数确定靶B的浓度。

图15是来自使用两个检测通道和三个未链接的靶(A-C)执行的示例 性多重数字分析的分块280的示意图。图15的多重分析配置与图13的分 析配置有关，除了对另一不相关的靶(C)的分析被执行以外(靶的模板 282的拷贝存在于分块280中)。靶C用靶C特定引物(F_C和R_C)扩增， 且扩增由用荧光团148标记的靶C特异性探针(P_C)报告。簇的确切数量 和布置将取决于各种参数，例如限制每个扩增反应的条件、用于检测的通 道、每个报告物的有效浓度、每个报告物的频谱特征等。参数的任何适当 组合可被调节以实现允许准确的浓度确定的簇布置。

图16是从图15的多重数字分析收集的扩增数据的示意性散布图。在 每个分块的每个通道中检测的荧光强度(FL.INT.)值关于每个通道轴被 绘制。染料162和荧光团148(靶C)实质上排他地在通道1中被检测到， 且荧光团242(靶B)实质上排他地在通道2中被检测到。分块的荧光强 度数据创建六个不同的簇，其顺序地被编号(为0、1、2、3、4和5)并 邻近每个簇根据靶内容在括号中进行标识。簇2代表对靶C为阳性的分块， 即只包含靶C的分块的群体290和包含靶A和C的分块的另一群体292。 簇5代表对靶B和C为阳性的分块，即只包含靶B和C的分块的群体294 和包含所有三个靶的分块的另一群体296。然而，群体290、292和群体 294、296并不被很好地分辨，且因此不能提供每个单独群体的准确的分块 计数。然而，可使用簇计数的适当组合和排除来计算靶A、B和C的浓度。

靶A的浓度可被计算如下：

λ_A＝ln(N₀+N₁)-ln(N₀)(22)

可选地，可通过包括簇3和4并排除所有C阳性簇来计算靶A的浓度：

λ_A＝ln(N₀+N₁+N₃+N₄)-ln(N₀+N₃)(23)

可使用来自所有分块的计数如下计算靶B的浓度：

λ_B＝ln(N_tot)-ln(N₀+N₁+N₂)(24)

可选地，可通过排除来自所有C阳性簇的计数(即通过排除N₂和N₅)来 计算靶B的浓度：

λ_B＝ln(N₀+N₁+N₃+N₄)-ln(N₀+N₁)(25)

簇2和5可从计算排除，因为每个被预期与共同被考虑的所有分块具 有A阳性分块的相同分数。然而，通常，使用更多的数据用于计算是合乎 需要的，如果准确度不受损害。

可通过排除来自所有B阳性簇的计数(即通过排除N₃、N₄和N₅)来 计算靶C的浓度：

λ_C＝ln(N₀+N₁+N₂)-ln(N₀+N₁)(26)

可选地，可使用来自所有分块的计数如下计算靶C的浓度：

λ_C＝ln(N_tot)-ln(N₀+N₁+N₃+N₄)(27)

图17示出从图15的多重数字分析收集并如在图16中的绘制的扩增 数据的另一示意性散布图，除了簇3(B)和簇4(AB)合并以形成新簇3 以外，且簇5被重命名为簇4。

在这里，再次，可计算所有靶的浓度。可使用等式22计算靶A的浓 度。可使用来自所有分块的计数使用等式24来计算靶B的浓度。可选地， 可通过排除来自所有C阳性簇的计数(即通过排除N₂和N₄)来计算靶B 的浓度：

λ_B＝ln(N₀+N₁+N₃)-ln(N₀+N₁)(28)

可使用等式26通过排除所有B阳性簇(即通过排除N₃和N₄)来计算 靶C的浓度。可选地，可使用来自所有分块的计数如下计算靶C的浓度：

λ_C＝ln(N_tot)-ln(N₀+N₁+N₃)(29)

图18示出从图15的多重数字分析收集的扩增数据的又一示意性散布 图。关于每个通道轴绘制在每个分块的每个通道中检测的荧光强度(FL. INT.)值。通用报告物162在通道1和2中被检测到，荧光团148(靶C) 实质上排他地在通道1中被检测到，而荧光团242(靶B)实质上排他地 在通道2中被检测到。分块的荧光强度数据创建五个不同的簇，其顺序地 被编号(为0、1、2、3和4)并邻近每个簇根据靶内容在括号中进行标 识。图18的簇相应于图17的簇；用于计算靶A-C的浓度的图17的策略 可应用于图18的簇计数。

V.实例

本章描述与多重数字分析有关的本公开的选定方面和实施方式。分析 可涉及靶掩蔽的任何组合、用于至少一个靶水平的计算的数据排除、在同 一多重分析中的至少两个靶的相同通用报告物的使用和/或同一多重分析 的特异性报告物和通用报告物的使用等。这些实例仅为了说明而设计且不 应限制或限定本公开的整个范围。

实例1.库质量的分析

这个实例描述在液滴中的多重数字分析的使用以测量库的空和填充 成员的水平，其中在液滴中的空库成员的存在掩蔽在同一液滴中的填充成 员的存在；见图19和20。

图19示出来自确定库例如Ion库的质量的示例性多重数字分 析的分块300的示意图。库可以是通过将适应物(“A”)的拷贝附着到感 兴趣的片段的群体的每端来在活体内构造的下一代基因测序(NGS)库。 库的成员可包括由一对适应物拷贝在反转方向上结扎到彼此而产生的空 成员302，而没有介入的插入物。空成员302不提供有用的序列信息，且 因此是库的不希望有的组成部分。库构造的靶是产生填充成员例如成员 304的高复杂性群体，每个包含感兴趣的片段之一作为以适应物的附着的 拷贝作为侧面的插入物。

NGS库的质量特征可在于多重数字分析。库的成员可在分块例如液滴 的不全占位下分布。液滴可包含使库的成员扩增的一个或多个引物(F) 和报告扩增的适应物特异性探针(P)。在这里，相同的引物(F)可以起 正向引物和反向引物的作用，用于通过特别结合到适应物的两个拷贝来扩 增。

图20示出从在液滴中执行的图19的多重分析收集的扩增数据的图 表。用FAM染料标记探针。从FAM染料测量的荧光强度被绘制为事件(或 液滴)数的函数。非常短的空库成员(A-A)非常有效地扩增并产生比填 充库成员强的信号，其掩蔽来自填充库成员的信号，如果存在于同一液滴 中。相应地，空和填充库成员的浓度可以如对图3所述的被计算。特别是， 可使用来自所有液滴的计数计算占优势/掩蔽的空库成员的浓度，且可通过 排除空库成员的计数来计算被掩蔽的填充库成员的浓度。下面为四个库示 出使用这种方法所获得的示例性浓度：

在通过引用被并入的2012年7月30提交的美国专利申请序列号 13/562,198中描述了通过数字分析的库构造和特征化的另外的方面。

实例2.拼接和未拼接RNA水平的测量

这个实例描述在液滴中的多重数字分析的使用以测量在样本中的未 拼接和拼接转录本的水平；见图21-24。

图21示出来自量化样本中的拼接和未拼接物种的示例性多重数字分 析的分块320的示意图。分块320包含未拼接物种(外显子-内含子-外显 子)和拼接物种(外显子-外显子)的拷贝。每个物种用同一对正向和反向 引物(F和R)扩增。扩增经由来自染料162的光发射被报告，染料162 非特异地结合到由来自两个模板的靶的扩增产生的扩增子。

图22示出从在具有引物到GAPDH的外显子7和8以及作为染料162 的Green的液滴中执行的图21的多重分析收集的扩增数据的图 表。预期扩增子尺寸对于内含子被移除的拼接物种是64bp。具有更高强 度信号的额外液滴对可从不成熟的mRNA分子产生的257bp的扩增子尺 寸是可见的，其中内含子还没有被切除。64bp物种在竞争中胜过257bp 物种并掩蔽它的信号。注意信号的反转，因为染料是嵌入的并产生与扩增 子长度成比例的信号(也见图4和7)。为257bp物种计算的浓度使用内 含子引物在分析中被确认以扩增内含子，而没有来自更短的拼接物种的竞 争。

图23示出来自量化样本中的拼接和未拼接物种的另一示例性多重数 字分析的分块340。分块包含未拼接物种342(外显子-内含子-内含子-外 显子)和两个不同的拼接物种344、346(外显子-X-外显子和外显子-外显 子)的拷贝。每个物种可用同一对正向和反向引物(F和R)扩增。每个 物种的扩增由同一染料162报告。

图24示出从在具有引物到肌动蛋白的外显子3和4的液滴中执行的 图23的多重分析收集的扩增数据的图表。在这里，不同长度(76bp、117 bp和517bp)的三个扩增子是可见的。最短的扩增子在竞争中胜过较长的 扩增子，且中间扩增子在竞争中胜过最长的扩增子。这三个靶的浓度可以 如在第II章中所述的被计算。

在通过引用并入本文的2012年8月23日提交的美国临时专利申请序 列号61/692,635中描述了对插入和删除的多重分析的另外方面。

实例3.使用报告物较少的靶的多重数字分析

本实例描述了在分块中执行以测量一对靶的水平并使用结合到靶中 的仅仅一个的单个报告物的多重数字分析；见图25和26。

图25示出来自第一靶(靶A)和第二靶(靶B)的示例性多重数字分 析的示例性分块360。分块360可以是具有随机地分布在分块当中的靶A 和靶B的拷贝的一组分块的成员。只有分块的子集每个包含靶A的至少一 个拷贝。只有分块的不同子集每个包含靶B的至少一个拷贝。分块的又一 不同的子集每个包含靶A的至少一个拷贝和靶B的至少一个拷贝，图25 所示的分块360作为例子。

每个分块可包括或是混合物的隔离部分。混合物可包含靶A和B(例 如分别由模板362和364提供)，并且也可包含足以在适当的环境条件或 操纵(例如加热、循环加热和冷却等)下扩增每个靶的试剂。

任何适当的试剂可包括在混合物中且因此在每个分块360中。试剂可 包括用于靶A的扩增的正向和反向引物(F_A和R_A)和用于靶B的扩增的 正向和反向引物(F_B和R_B)。试剂也可包括特异性报告物(例如探针P_A， 包括标签、荧光粉366)。报告物特异地结合到靶A(和/或到由靶A的扩 增形成的扩增子的区)。然而，混合物并不包含结合到靶B或对靶B的扩 增敏感的报告物，除了间接地以外。更具体地，靶B的存在经由探针P_A可检测，作为探针信号中的变化，只有当靶A和B都在同一分块中例如在 包含每个靶的拷贝的分块360中被扩增时。在不存在分块中的靶A的情况 下，靶B保持对分块是不可见的和检测不到的。

图26示出可从图25的多重数字分析中的分块收集的扩增数据(荧光 强度)的示意性散布图。该图示出在两个通道中收集的数据，但探针A的 荧光粉366只在通道1中可检测到。在其它情况下，数据可被绘制为相对 于时间或事件数的强度。在任何情况下，分块的三个簇是可区分的并被顺 序地编号(0、1和2)并邻近每个簇根据靶内容进行标识。

簇0具有在通道1中的最低强度，因为簇0的每个分块对靶A是阴性 的。因为靶A不存在，未探测到的靶B的扩增变得未检测到。因此，关于 被共同考虑的在所有簇中的分块，靶B在大约相同的平均浓度(每液滴拷 贝)下分布在簇0的分块当中。簇0的任何给定分块对靶B可以是阳性的 或阴性的。

簇2具有在通道1中的最高强度且只包含靶A。靶A的扩增出现的簇 2的分块中而没有来自靶B的竞争，这导致靶A的更有效的扩增和因而来 自探针的更强信号。

簇1具有在通道1中的中间强度。簇1的每个分块使靶A和靶B扩增。 A和B扩增反应为了有限的试剂而彼此竞争，这导致靶A相对于簇2的分 块的较不有效的扩增。作为结果，探针对簇1比对簇2产生更小强度的信 号。

N₀、N₁和N₂分别是簇0、1和2中的分块的数量(分块计数)。靶A 的浓度(每液滴拷贝)然后可如下被计算：

λ_A＝ln(N₀+N₁+N₂)-ln(N₀)(30)

在等式30中，通过将所有三个簇的分块数量求和来提供分块的总数， 且只通过对在簇0中的分块的数量求和来提供对靶A为阴性的分块的数量 (也见上面的等式5)。

靶B的浓度(每液滴拷贝)可如下被计算：

λ_B＝ln(N₁+N₂)-ln(N₂)(31)

在等式31中，通过将簇1和2的分块数量求和来确定分块的总数，且通 过对在簇2中的分块的数量求和来确定对靶B为阴性的分块的数量(也见 上面的等式5)。可从靶B浓度的计算中排除簇0，因为总体上看，在簇0 中的靶B的浓度被预期与在簇1和2中的相同(没有统计误差)。

实例4.选定实施方式I

本实例描述被呈现为一系列编号的段落的用通用报告物执行的多重 数字分析的选定实施方式。

1.一种执行多重数字分析的方法，该方法包括：(A)提供在不全占 位下包含第一靶和第二靶的分块；(B)扩增分块中的靶；(C)从包括结合 到代表这两个靶的扩增子的通用报告物的一个或多个报告物收集关于在 分块中的第一靶和第二靶的扩增的数据；以及(D)基于数据确定第一靶 和第二靶的浓度。

2.段落1的方法，其中多个分块每个包含这两个靶的拷贝。

3.段落1或2的方法，其中从选择性地排除对第二靶为阳性的分块 的数据的仅仅子集确定第一靶的浓度。

4.段落1到3中的任一项的方法，其中至少一个相同引物用于这两 个靶的扩增。

5.段落4的方法，其中每个靶的扩增使用同一对引物被执行。

6.段落1到3中的任一项的方法，其中每个靶的扩增使用一对引物 被执行，其中只有一个引物结合到另一靶或这两个引物都不结合到另一 靶。

7.段落1到6中的任一项的方法，其中通用报告物包括结合到双链 核酸的染料。

8.段落7的方法，其中染料的多个拷贝与双链核酸的长度直接有关 地结合到双链核酸。

9.段落7或8的方法，其中染料是嵌入染料。

10.段落7到9中的任一项的方法，其中当结合到双链核酸时染料变 得更发光。

11.段落1到10中的任一项的方法，其中分块是液滴。

12.段落1到11中的任一项的方法，其中一个或多个报告物包括结 合到第二靶而不是第一靶的探针。

13.段落12的方法，其中数据包括通过检测由探针发射的光创建的 信号。

14.段落1到13中的任一项的方法，其中从数据的仅仅第一子集确 定第一靶的浓度，以及其中从数据的仅仅不同的第二子集或使用所有数据 确定第二靶的浓度。

15.段落1到14中的任一项的方法，其中一个或多个报告物包括第 三靶的探针，以及其中数据包括用于在分块中的第三靶的扩增的数据。

16.段落15的方法，其中收集数据的步骤包括在同一光学通道中检 测从通用报告物和从探针发射的光的步骤。

17.段落1的方法，其中所有数据代表由通用报告物发射的光。

18.段落1的方法，其中第一靶的扩增只被检测为由通用报告物发射 的光。

19.一种执行多重数字分析的方法，该方法包括：(A)提供在不全占 位下包含第一靶和第二靶的分块，每个分块包含结合到代表这两个靶的扩 增子的通用报告物，多个分块每个包含这两个靶的拷贝；(B)扩增分块中 的靶；(C)从通用报告物收集关于在分块中的第一靶和第二靶的扩增的数 据；以及(D)从选择性地排除对第二靶为阳性的分块的数据的仅仅子集 确定第一靶的浓度。

20.一种执行多重数字分析的方法，该方法包括：(A)提供在不全占 位下包含第一靶和第二靶的分块，每个分块包含结合到代表这两个靶的扩 增子的通用报告物和特异地结合到代表第二靶的扩增子的探针，多个分块 每个包含这两个靶的拷贝；(B)扩增分块中的靶；(C)至少部分地通过检 测由通用报告物和探针发射的光，收集关于在分块中的第一靶和第二靶的 扩增的数据；以及(D)从选择性地排除对第二靶为阳性的分块的数据的 仅仅子集确定第一靶的浓度。

21.段落20的方法，其中收集数据的步骤包括收集数据分块中的第 三靶的扩增的数据，该方法还包括确定第二靶和第三靶的浓度。

22.段落21的方法，其中数据的子集也选择性地排除对第三靶为阳 性的分块。

23.段落21或22的方法，其中数据的子集包括对第三靶为阳性的分 块。

24.段落21到23中的任一项的方法，其中每个分块包括特异地结合 到代表第三靶的扩增子的探针。

25.段落24的方法，其中特异地结合到代表第三靶的扩增子的探针 不结合到代表第一靶的扩增子且不结合到代表第二靶的扩增子。

26.段落21到25中的任一项的方法，其中收集数据的步骤在代表光 的不同波段的第一和第二光通道中被执行，其中第三靶的扩增在第一光通 道中可检测到，以及其中第二靶的扩增在第二通道中可检测到。

27.段落20到26中的任一项的方法，其中探针包括发光团，其中收 集数据的步骤在代表发射光的不同波段的第一和第二光通道中被执行，其 中由通用报告物发射的光至少实质上排他地在第一光通道中被检测到，以 及其中由发光团发射的光至少实质上排他地在第二光通道中被检测到。

28.段落20到27中的任一项的方法，其中通用报告物包括嵌入染料。

29.段落20到26或28中的任一项的方法，其中探针包括发光团， 以及其中收集数据的步骤包括检测在同一波段中由通用报告物和探针发 射的光。

实例5.选定实施方式II

本实例描述被呈现为一系列编号的段落的各自用特异性报告物和通 用报告物执行的多重数字分析的选定实施方式。

1.一种执行多重数字分析的方法，该方法包括：(A)提供分块，每 个分块包括同一混合物的一部分，混合物包含第一靶和第二靶且也包含对 任一靶的扩增敏感的通用报告物和对第二靶的扩增特异地敏感的特异性 报告物，其中只有分块的第一子集每个包含第一靶的至少一个拷贝，且分 块的仅仅不同的第二子集每个包含第二靶的至少一个拷贝；(B)扩增在分 块中的第一靶和第二靶；(C)从存在于多个分块中的通用报告物和特异性 报告物收集扩增数据；以及(D)基于扩增数据计算每个靶的水平。

2.一种执行多重数字分析的方法，该方法包括：(A)提供分块，每 个分块包括同一混合物的一部分，混合物包含第一靶和第二靶且也包含通 用报告物和特异性报告物，其中只有分块的子集每个包含第一靶的至少一 个拷贝，其分块的仅仅另一子集每个包含第二靶的至少一个拷贝；(B)扩 增在分块中的靶以产生相应于第一靶的第一扩增子和相应于第二靶的第 二扩增子，其中通用报告物结合到第一扩增子和第二扩增子，以及其中特 异性报告物结合到第二扩增子而不是第一扩增子；(C)通过检测由通用报 告物和特异性报告物的至少一个发光团发射的光从多个分块收集扩增数 据；以及(D)基于扩增数据计算每个靶的水平。

3.段落1或2的方法，其中分块的不同的第三子集的每个分块包含 这两个靶的至少一个拷贝。

4.段落3的方法，其中在扩增数据中，第三子集的分块不与第一子 集或第二子集的分块可靠地区分开。

5.段落3或4的方法，其第三子集的分块有助于为至少一个靶计算 的水平。

6.段落3到5中的任一项的方法，其中至少一个靶的水平的计算只 使用选择性地排除第三子集的分块的扩增数据的一部分被执行。

7.段落1到6中的任一项的方法，其中在大约相同的温度下从多个 分块收集所有数据。

8.段落1到7中的任一项的方法，其中水平是浓度。

9.段落1到8中的任一项的方法，还包括基于每个靶的水平确定靶 之一的拷贝数变化的步骤。

10.段落9的方法，其中所提供的分块包含来自基因组的核酸，其中 第一和第二靶中的一个是具有在基因组中的已知拷贝数的参考靶，以及第 一和第二靶中的另一个是具有在基因组中的未知拷贝数的感兴趣靶。

11.段落1到10中的任一项的方法，其中混合物包括用于每个靶的 扩增的引物。

12.段落1到11中的任一项的方法，其中混合物包含一组完整的试 剂以支持每个靶的扩增。

13.段落1到12中的任一项的方法，其中特异性报告物具有完整的 形式和一个或多个降解的形式，其中一个或多个降解的形式在第二靶的扩 增期间从完整的形式产生，以及其中收集扩增数据的步骤包括从特异性报 告物的一个或多个降解的形式收集数据。

14.段落1到13中的任一项的方法，其中收集扩增数据的步骤在至 少第一光通道和第二光通道中被执行，以及其中第一光通道检测与在第二 光通道中检测的光在光谱上不同的光。

15.段落14的方法，其中由通用报告物发射的光相对于第二光通道 至少占优势地只在第一光通道中被检测到，以及其中由特异性报告物的至 少一个发光团发射的光相对于第一光通道至少占优势地只在第二光通道 中被检测到。

16.段落14的方法，其中由通用报告物发射的光在第一光通道和第 二光通道中的每个中被检测到，以及其中由特异性报告物的至少一个发光 团发射的光相对于第一光通道至少占优势地只在第二光通道中被检测到。

17.段落1到16中的任一项的方法，其中第二扩增子包括一对互补 链，以及其中特异性报告物结合到互补链中的仅仅一个的区。

18.段落1到17中的任一项的方法，其中靶中的一个的水平从选择 性地排除测试为对靶中的另一个为阳性的分块的扩增数据的仅仅子集计 算。

19.段落1到18中的任一项的方法，其中分块是液滴。

20.段落1到19中的任一项的方法，其中通用报告物包括嵌入染料。

21.段落1到20中的任一项的方法，其中在扩增的端点对每个靶被 到达之后收集扩增数据。

22.段落1到21中的任一项的方法，其中计算水平的步骤包括标绘 扩增数据以产生具有第一轴和第二轴的散布图的步骤，其中每个轴代表在 不同的光通道中检测的光的强度的范围，以及其中散布图包括数据点的至 少两个簇，每个簇代表对至少一个靶为阳性的分块。

23.段落22的方法，其中计算每个靶的水平的步骤包括使用排除至 少一个簇的数据的仅仅子集来计算至少一个靶的水平的步骤。

24.段落1到23中的任一项的方法，其中第一靶和第二靶在大部分 分块中不共价地链接到彼此。

25.段落24的方法，其中第一靶和第二靶在分块中不共价地链接到 彼此。

26.段落1到25中的任一项的方法，其中在低于每个扩增子的熔化 温度的温度下从分块收集所有数据。

27.段落1到26中的任一项的方法，其中数据从多个分块被收集， 同时在多个分块的至少子集中的第一扩增子的拷贝和第二扩增子的拷贝 保持在至少部分双链形式中。

28.段落1到27中的任一项的方法，其中使用在双链形式中的第一 扩增子的至少一部分和第二扩增子的至少一部分来收集所有数据。

29.段落1到28中的任一项的方法，其中在低于大约50摄氏度的温 度下从分块收集所有数据。

30.段落1到29中的任一项的方法，其中特异性报告物包括特异地 结合到第二扩增子的核酸。

31.段落1到30中的任一项的方法，还包括基于扩增数据对于至少 一个靶将单独的分块分类为阳性或将单独的分块分类为阴性的步骤。

32.段落31的方法，还包括确定对于靶中的一个靶被分类为阳性或 被分类为阴性的分块的数量的步骤，以及其中计算一个靶的水平的步骤基 于被分类为阳性或被分类为阴性的分块的数量。

33.一种用于执行多重数字分析的成分，包括：(A)布置在同一连续 相中的多个液滴，液滴每个包括同一混合物的一部分，其中混合物包含第 一靶、第二靶、对任一靶的扩增敏感的通用报告物和对第二靶的扩增特异 地敏感的特异性报告物，其中多个液滴的仅仅第一子集每个包含第一靶的 至少一个拷贝，以及多个液滴的仅仅不同的第二子集每个包含第二靶的至 少一个拷贝，以及其中混合物包括用于每个靶的扩增的完整的一组试剂。

34.段落33的成分，其中连续相包括油。

35.段落34的成分，其中油包括氟油、硅油和这两者。

36.段落33的成分，其中连续相在室温下是液体。

37.段落36的成分，其中连续相在90摄氏度下是液体。

38.段落33的成分，其中液滴的第三子集每个包含每个靶的至少一 个拷贝。

39.段落33的成分，其中完整的这组试剂包括dNTP、用于扩增每个 靶的引物和热稳定多聚酶。

实例6.选定实施方式III

本实例描述被呈现为一系列编号的段落的多重数字分析的选定实施 方式。

1.一种执行多重数字分析的方法，该方法包括：(A)提供在不全占 位下包含第一靶和第二靶的分块，多个分块每个包含这两个靶的拷贝；(B) 执行相应于分块中的每个靶的反应；(C)对于每个反应从至少一个报告物 收集数据；以及(D)从选择性地排除对第二靶为阳性的分块的、所述数 据的仅仅子集确定第一靶的浓度。

2.段落1的方法，其中分块是液滴，其中收集数据的步骤由检测组 件执行，其中确定的步骤使用数据处理器来执行，或其任何组合。

3.段落2的方法，其中提供分块的步骤包括形成包含第一靶和第二 靶的液滴的步骤。

4.段落1到3中的任一项的方法，其中提供分块的步骤包括形成包 括包含第一靶和第二靶的样本的分块的步骤。

5.段落1到4中的任一项的方法，其中第一靶和第二靶每个包括核 苷酸的序列。

6.段落1到5中的任一项的方法，其中当分块被提供时，多个分块 每个包含第一靶的单个拷贝，且多个分块每个包含第二靶的单个拷贝。

7.段落1到6中的任一项的方法，其中相应于每个靶的反应扩增核 酸。

8.段落1到7中的任一项的方法，其中相应于每个靶的反应由至少 一种酶催化。

9.段落8的方法，其中至少一种酶包括多聚酶、连接酶或这两者。

10.段落8的方法，其中至少一种酶包括连接到特异地结合到靶之一 的寡核苷酸的酶。

11.段落1到10中的任一项的方法，其中每个反应的至少一个报告 物包括结合到核酸的报告物。

12.段落11的方法，其中至少一个反应的报告物是包括寡核苷酸的 标记探针。

13.段落12的方法，其中执行反应的步骤产生相应于第一靶的第一 扩增子和相应于第二靶的第二扩增子，其中相应于第一靶的反应的报告物 结合到第一扩增子和第二扩增子。

14.段落13的方法，其中相应于第二靶的反应的报告物是相对于第 一扩增子特异地结合到第二扩增子的特异性报告物，或其中数据从仅仅一 个报告物收集。

15.一种执行多重数字分析的方法，该方法包括：(A)扩增在不全占 位下包含每个靶的分块中的第一靶和第二靶；(B)收集用于第一靶和第二 靶的扩增的数据，对包含每个靶的拷贝的多个分块，在所述数据中，第二 靶至少部分地掩蔽第一靶的存在；以及(C)从选择性地排除对第二靶为 阳性的分块的数据的仅仅子集确定第一靶的浓度。

16.段落15的方法，其中分块是液滴。

17.段落15或16的方法，其中每个靶以每分块小于五个拷贝的平均 数存在于分块中。

18.段落15到17中的任一项的方法，其中多个分块中的每个不包含 任一靶的拷贝。

19.段落15到18中的任一项的方法，其中浓度是第一靶的每分块拷 贝的平均数量。

20.段落15到19中的任一项的方法，其中确定的步骤基于由数据的 子集表示的分块的总数的值。

21.段落15到20中的任一项的方法，其中确定的步骤基于表示对第 一靶为阴性的数据的子集中的分块的总数的值或基于表示对第一靶为阳 性的数据的子集中的分块的总数的值。

22.段落15到21中的任一项的方法，其中确定的步骤基于泊松统计。

23.段落15到22中的任一项的方法，还包括基于数据的至少子集来 确定第二靶的浓度的步骤。

24.段落23的方法，其中扩增和收集的步骤对第三靶执行，以及其 中第二靶的浓度从排除对第三靶为阳性的分块的数据的仅仅子集确定。

25.段落15到24中的任一项的方法，其中，在包含每个靶的拷贝的 分块中，第二靶的扩增抑制第一靶的扩增。

26.段落15到25中的任一项的方法，其中至少一个相同的引物用于 第一靶和第二靶的扩增。

27.段落26的方法，其中同一对正向和反向引物用于第一靶和第二 靶的扩增。

28.段落26或27的方法，其中第一靶和第二靶的扩增产生相应的第 一和第二扩增子，以及其中第一扩增子实质上比第二扩增子长，反之亦然。

29.段落28的方法，其中第二扩增子比第一扩增子长至少25％、50％ 或100％，反之亦然。

30.段落15到29中的任一项的方法，还包括从数据识别对第二靶为 阳性的分块的至少一个簇的步骤，其中确定的步骤在至少一个簇被排除的 情况下被执行。

31.段落30的方法，还包括产生数据的至少一个图表的步骤，其中 识别的步骤基于至少一个图表来执行。

32.段落15到31中的任一项的方法，还包括基于比较每个分块的一 个或多个信号值与一个或多个阈值或范围来识别数据的子集的步骤。

33.段落32的方法，其中一个或多个信号值表示发射光的检测到的 强度。

34.段落15到33中的任一项的方法，其中第一靶和第二靶的扩增产 生相应的第一和第二扩增子，以及其中每个分块包含结合到第一扩增子和 第二扩增子的相同报告物。

35.段落34的方法，其中相同报告物是结合到双链核酸的染料。

36.段落34或35的方法，其中相同报告物结合到第一和第二扩增子 而没有实质的序列特异性。

37.段落34的方法，其中相同报告物是特异地结合到第一和第二扩 增子的探针。

38.段落15到37中的任一项的方法，其中扩增的步骤也扩增第三靶， 其中所收集的数据也用于在分块中的第三靶的扩增，其中对包含第二和第 三靶中的每个的拷贝的分块，第三靶至少部分地掩蔽第二靶的存在，该方 法还包括从选择性地排除对第三靶为阳性的分块的数据的仅仅子集确定 第二靶的浓度的步骤。

39.段落38的方法，其中，对包含第一和第三靶中的每个的拷贝的 分块，在数据中，第三靶至少部分地掩蔽第一靶的存在。

40.段落38或39的方法，其中确定第一靶的浓度的步骤使用选择性 地排除对第二靶为阳性的分块和选择性地排除对第三靶为阳性的分块的 数据的仅仅子集来执行。

41.段落15到40中的任一项的方法，其中第一靶的浓度从其确定的 数据的子集排除对第二靶为阳性的分块的至少大部分。

42.段落41的方法，其中数据的子集排除测试为对第二靶为阳性的 所有分块。

43.一种执行多重数字分析的方法，该方法包括：(A)提供在不全占 位下包含第一靶和第二靶的分块，多个分块每个包含这两个靶的拷贝；(B) 扩增分块中的靶；(C)收集用于第一靶和第二靶的扩增的数据，数据是可 标绘的以产生数据点的三个或三个以上簇，每个簇代表分块中的靶的至少 一个不同的组合；以及(D)从排除一个或多个簇的数据的仅仅子集确定 第一靶的浓度。

44.段落43的方法，其中三个或三个以上簇之一代表对这两个靶为 阴性的分块。

45.段落43或44的方法，其中三个或三个以上簇之一代表对第一靶 为阳性和对第二靶为阴性的分块。

46.段落43到45中的任一项的方法，其中三个或三个以上簇之一代 表对第二靶为阳性的分块而不考虑分块对第一靶为阳性还是为阴性。

47.段落43到46中的任一项的方法，还包括标绘数据以形成簇的步 骤。

48.段落47的方法，其中数据被标绘为作为事件数的函数的光致发 光强度。

49.段落47的方法，其中数据被标绘以产生具有第一轴和第二轴的 二维散布图，以及其中每个轴代表光的不同波段的强度。

50.段落43到49中的任一项的方法，其中三个或三个以上簇之一包 括代表靶的不同组合的一对子簇，以及其中子簇彼此重叠。

实例7.选定实施方式IV

本实例描述被呈现为一系列编号的段落的多重数字分析的选定实施 方式。

1.一种执行多重数字分析的方法，该方法包括：(A)提供包括多个 靶和对每个靶的扩增足够的试剂的混合物，其中多个靶包括第一靶；(B) 形成分块，每个分块包括混合物的一部分；(C)扩增在分块中的多个靶； (D)从多个分块收集关于多个靶中的每个靶的扩增的数据；(E)识别数 据中的分块群体，每个分块群体具有多个靶的不同靶内容；以及(F)从 数据的仅仅一部分计算第一靶的水平，其中数据的该部分从多个分块的仅 仅子集被收集，其中分块的子集排除两个或两个以上分块群体，以及其中 两个或两个以上被排除的分块群体包括在数据中彼此不分辨开的至少一 对被排除的分块群体。

2.段落1的方法，其中彼此不分辨开的至少一对被排除的分块群体 包括对第一靶为阳性的第一分块群体和对第一靶为阴性的第二分块群体。

3.段落1或2的方法，其中识别分块群体的步骤包括标绘数据以形 成数据点的三个或三个以上簇的步骤，其中每个簇代表至少一个分块群 体，其中数据的部分排除一个或多个簇，以及其中一个或多个被排除簇包 括由代表具有彼此不同的靶内容的分块群体的至少两组重叠的数据点组 成的异质簇。

4.段落3的方法，其中每个数据点代表从多个分块的每个分块检测 的光的一个或多个强度值，以及其中标绘数据的步骤包括关于至少一个强 度轴标绘数据的步骤。

5.段落4的方法，其中标绘数据的步骤包括关于至少两个强度轴标 绘数据的步骤。

6.段落1到5中的任一项的方法，其中收集数据的步骤包括得到多 个分块中的每个分块的至少一个值的步骤，以及其中识别的步骤基于比较 至少一个信号值与多个分块中的每个分块的至少一个阈值或范围。

7.段落1到6中的任一项的方法，其中多个靶包括第二靶，以及其 中数据的部分排除测试为对第二靶为阳性的每个分块。

8.段落7的方法，其中扩增的步骤使用第一靶和第二靶的同一对引 物被执行。

9.段落7或8的方法，其中多个分块的子集每个包含第一靶的至少 一个拷贝和第二靶的至少一个拷贝，以及其中，在每个分块包含第一靶和 第二靶的拷贝的分块中，第二靶的扩增减小第一靶的扩增。

10.段落7到9中的任一项的方法，其中多个靶包括第三靶，该方法 还包括基于排除测试为对第三靶为阳性的分块的数据的仅仅一部分来计 算第二靶的水平的步骤。

11.段落1到10中的任一项的方法，其中该水平是在分块的子集中 的第一靶的每分块拷贝的平均数，以及其中，总体上看，在没有统计误差 的情况下，平均数被预期与在两个或两个以上被排除的分块群体中的第一 靶的每分块拷贝的平均数相同。

12.段落1到11中的任一项的方法，其中识别分块群体的步骤包括 识别测试为对多个靶中的每个为阴性的分块群体的步骤。

13.段落12的方法，其中分块的子集不包括测试为对多个靶中的每 个为阴性的分块群体。

14.段落1到13中的任一项的方法，其中识别分块群体的步骤包括 识别在数据的图表中彼此不分辨开的至少一对分块群体的步骤。

15.段落14的方法，其中分块的子集不包括在数据的图表中彼此不 分辨开的至少一对分块群体。

16.段落1到15中的任一项的方法，其中多个分块的仅第一子集每 个包含第一靶的至少一个拷贝，其中多个分块的仅仅不同的第二子集每个 包含多个靶的第二靶的至少一个拷贝，以及其中多个分块的第三子集每个 包含第一靶和第二靶的至少一个拷贝。

17.段落1到16中的任一项的方法，还包括从分块的子集得到第一 分块计数和第二分块计数的步骤，其中计算水平的步骤使用第一分块计数 和第二分块计数来执行。

18.段落17的方法，其中第一分块计数是在分块的子集中的分块的 总数，以及其中第二分块计数是在分块的子集中对第一靶为阳性的分块的 数量或在分块的子集中对第一靶为阴性的分块的数量。

19.段落1到18中的任一项的方法，其中形成分块的步骤包括形成 液滴的步骤。

20.段落1到19中的任一项的方法，其中多个靶的每个靶包括核苷 酸序列。

21.段落1到20中的任一项的方法，其中混合物包括至少一个报告 物，以及其中收集数据的步骤包括检测来自至少一个报告物的光的步骤。

22.段落21的方法，其中至少一个报告物包括对多个靶的第一靶和 第二靶的扩增敏感的相同报告物。

23.段落22的方法，其中相同报告物是通用报告物。

24.段落23的方法，其中通用报告物结合到双链核酸而没有实质的 序列特异性。

25.段落21到24中的任一项的方法，其中至少一个报告物包括特异 地仅结合到多个靶中的第一靶的标记探针。

26.段落1到25中的任一项的方法，其中计算水平的步骤包括计算 第一靶的浓度的步骤。

27.段落26的方法，其中计算第一靶的浓度的步骤包括计算每分块 第一靶的拷贝的平均数的步骤。

28.段落1到27中的任一项的方法，其中计算水平的步骤基于泊松 统计。

29.段落1到28中的任一项的方法，其中扩增第一靶的步骤产生扩 增子，以及其中分块不包括结合到第一靶、扩增子或第一靶和扩增子的报 告物。

30.段落1到29中的任一项的方法，其中多个靶包括第二靶，以及 其中分块包括相对于在分块中的第一靶和第二靶的扩增对分块中的第二 靶的扩增有差别地敏感的报告物。

31.一种执行多重数字分析的方法，该方法包括：(A)提供包括多个 靶和对每个靶的扩增足够的试剂的混合物，其中多个靶包括第一靶和第二 靶；(B)形成分块，每个分块包括混合物的一部分；(C)扩增在分块中的 多个靶；(D)从多个分块收集关于多个靶中的每个靶的扩增的数据，数据 是可标绘的以形成数据点的三个或三个以上簇，每个数据点代表分块，以 及每个簇具有多个靶的不同内容；以及(E)从排除数据点的至少一个簇 的数据的仅仅一部分计算第一靶的水平，其中至少一个被排除簇包括由代 表至少两个被排除的分块群体的数据点的重叠组组成的异质被排除簇，其 中至少一个被排除的分块群体对第一靶是阳性的，以及其中至少一个被排 除的分块群体对第一靶是阴性的。

32.段落31的方法，还包括标绘数据以形成数据点的三个或三个以 上簇的步骤。

33.段落31或32的方法，还包括根据簇的靶内容识别每个簇的步骤。

34.段落33的方法，其中数据的该部分排除至少一对异质簇。

35.段落31到34中的任一项的方法，其中多个靶包括第二靶，以及 其中数据的该部分排除测试为对第二靶为阳性的分块的数据点。

36.段落31到35中的任一项的方法，其中数据的该部分排除测试为 对多个靶中的每个为阴性的分块的数据点。

37.一种执行多重数字分析的方法，该方法包括：(A)提供包括第一 靶、第二靶和对每个靶的扩增足够的试剂的混合物；(B)形成分块，每个 分块包括混合物的一部分；(C)扩增在分块中的第一靶和第二靶；(D)从 多个分块收集关于第一靶和第二靶的扩增的数据；以及(E)从排除测试 为对第二靶为阳性的每个分块的数据的仅仅一部分计算第一靶的水平。

38.段落37的方法，其中第一靶未链接到混合物中的第二靶，且当 形成分块的步骤被执行时未链接到第二靶。

39.段落37或38的方法，其中数据收集自包括标记探针的至少一个 报告物。

40.段落39的方法，其中标记探针具有完整形式和一个或多个降解 的形式，以及其中收集数据的步骤包括从探针的一个或多个降解的形式收 集数据的至少部分的步骤。

41.段落37到40中的任一项的方法，其中，对于每个分块包含每个 靶的至少一个拷贝的多个分块，在数据中，第二靶的存在至少部分地掩蔽 第一靶的存在。

42.段落37到41中的任一项的方法，其中数据的该部分收集自多个 分块的仅仅子集，其中计算水平的步骤基于在分块的子集中的分块的总数 并基于分块的子集中对第一靶为阴性或对第一靶为阳性的分块的数量。

43.一种执行多重数字分析的方法，该方法包括：(A)扩增在不全占 位下包含每个靶的分块中的第一靶和第二靶；(B)收集关于第一靶和第二 靶的扩增的数据，在每个分块包含每个靶的至少一个拷贝的多个分块的数 据中，第二靶至少部分地掩蔽第一靶的存在，；以及(C)从选择性地排除 测试为对第二靶为阳性的分块的数据的仅仅一部分计算第一靶的浓度。

44.段落43的方法，其中计算的步骤基于由数据的该部分代表的分 块的总数的值。

45.段落44的方法，其中计算的步骤基于在数据的该部分中的测试 为对第一靶为阴性的分块的数量的值或基于在数据的该部分中的测试为 对第一靶为阳性的分块的数量的值。

46.段落43到45中的任一项的方法，还包括基于数据的至少一部分 来计算第二靶的水平的步骤。

47.段落43到46中的任一项的方法，其中扩增和收集数据的步骤对 第三靶执行，该方法还包括从排除测试为对第三靶为阳性的分块的数据的 仅仅一部分计算第二靶的水平的步骤。

48.段落43到47中的任一项的方法，其中，在每个分块包含每个靶 的拷贝的分块中，第二靶的扩增减小第一靶的扩增。

49.段落43到48中的任一项的方法，还包括从数据识别对第二靶为 阳性的分块的至少一个簇的步骤，其中计算的步骤在至少一个簇被排除的 情况下被执行。

50.一种执行多重数字分析的方法，该方法包括：(A)提供包括多个 靶和对每个靶的扩增足够的试剂的混合物，其中多个靶包括第一靶和第二 靶；(B)形成分块，每个分块包括混合物的一部分，只有分块的第一子集 包含第一靶，且只有分块的不同的第二子集包含第二靶，以及分块的不同 的第三子集每个包含第一靶和第二靶中的每个的至少一个拷贝；(C)扩增 在分块中的多个靶；(D)从多个分块收集关于多个靶中的每个靶的扩增的 数据，数据是可标绘的以产生数据点的三个或三个以上簇，每个簇代表未 由三个或三个以上簇中的任何其它簇代表的至少一个靶组合；以及(E) 从排除一个或多个簇的数据的仅仅一部分计算第一靶的水平，其中一个或 多个被排除簇包括相对于第一靶是异质的被排除簇(即只有簇的子集对第 一靶是阳性的)。

51.段落50的方法，其中至少一个靶组合包括一种组合，其中多个 靶中的每个缺乏。

52.段落50或51的方法，其中至少一个靶组合包括一种组合，其中 多个靶中的仅仅一个靶存在。

53.段落50到52中的任一项的方法，其中至少一个靶组合包括一种 组合，其中第一靶缺乏而第二靶存在。

54.段落50到53中的任一项的方法，其中从计算水平的步骤排除了 包含第二靶的每个簇。

55.段落50到54中的任一项的方法，其中水平是浓度，其中浓度是 每分块拷贝的平均数，以及其中总体上看，在没有统计误差的情况下，平 均数被预期与在一个或多个被排除簇中的第一靶的每分块拷贝的平均数 相同。

56.段落50到55中的任一项的方法，其中计算水平的步骤使用由数 据的该部分表示的分块的总数的值，以及其中一个或多个簇的分块不包括 在分块的总数中。

57.段落50到56中的任一项的方法，其中三个或三个以上簇之一包 括对第一靶和第二靶为阴性的分块的数据点。

58.段落50到57中的任一项的方法，其中三个或三个以上簇之一包 括对第一靶为阳性和对第二靶为阴性的分块的数据点。

59.段落50到58中的任一项的方法，其中相对于第一靶是异质的被 排除簇包括对第一靶为阳性的分块的数据点和对第一靶为阴性的分块的 数据点。

60.段落50到59中的任一项的方法，还包括标绘数据以形成簇的步 骤。

61.段落60的方法，其中数据被标绘为作为事件数的函数的光致发 光强度。

62.段落60的方法，其中数据被标绘以产生具有第一轴和第二轴的 二维散布图，以及其中每个轴代表光的不同波长或波段的检测到的强度。

上面阐述的本公开可包括具有独立效用的多个不同的发明。虽然这些 发明中的每个在其优选形式中被公开，如在本文公开和示出的其特定实施 方式不应在限制性的意义上被考虑，因为很多变化是可能的。发明的主题 包括本文公开的各种元件、特征、功能和/或特性的所有新颖和非显而易见 的组合和子组合。下面的权利要求特别指出被视为新颖和非显而易见的某 些组合和子组合。体现在特征、功能、元件和/或特性的其它组合和子组合 中的发明可在从这个或相关申请要求优先权的申请中被主张。这样的权利 要求不管目的是否在于不同的发明或同一发明以及在范围上是否比原始 权利要求更宽、更窄、相等或不同也都被视为包括在本公开的发明的主题 内。此外，所识别的元件的序数指示符例如第一、第二或第三用于区分开 元件且并不指示这样的元件的特定位置或顺序，除非另外特别规定。