一类核苷类抗生素及其在制备抗菌药物中的应用

技术领域：

本发明属于天然产物和海洋微生物代谢工程领域，具体涉及一类核苷类抗生素及其在制备抗菌药物中的应用。

背景技术：

在过去的十年间，海洋放线菌已成为新颖生物活性天然产物发现的新源泉。例如，Salinispora属放线菌，可产生多种结构新颖和生物活性广泛的化合物，如海洋放线菌Salinisporatropica可产生化合物salinosporamideA，作为高效的蛋白酶体抑制剂该化合物已经进入癌症治疗的临床试验了。本研究单位(中国科学院南海海洋研究所)从中国南海北部深海海沟的沉积土里分离得到一个放线菌新属菌种MarinactinosporathermotoleransSCSIO00652，该菌株生产核苷类抗生素A201A，对革兰氏阳性菌具有显著抑制作用。

与抗生素生物合成相关的基因往往成簇排列，包括自我抵抗基因、转运基因和调控基因。抗生素生物合成基因簇成功克隆后，可利用分子生物学基础上的组合生物合成(combinatorialbiosynthesis)和代谢工程(metabolicengineering)技术来定向创造新结构、新活性化合物，这无疑将大大丰富已有的资源，从而为解决或部分解决临床上病原微生物的耐药性日益严重的问题。

近年来发展起来的PCR-Targeting技术和接合转移技术已在多种链霉菌中成功应用。PCR-Targeting技术是以RED重组技术为基础的，RED同源重组系统由源于λ噬菌体的exo、bet、gam基因组成，在这3个基因产物的作用下，该系统能介导36bp以上的同源片段产生同源重组。接合转移技术是发生在大肠杆菌与链霉菌之间，可以避开胞外核酸酶的影响，使DNA免遭核酸酶的降解，在某种程度上可以克服宿主对外源DNA的限制性修饰从而提高转化效率，而且操作程序简单，因此应用较为广泛。PCR-Targeting技术和接合转移技术为通过基因工程对链霉素中抗生素生物合成基因簇进行遗传改造提供了一种方便而有效的途径。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供一类具有抑菌作用的核苷类抗生素。

本发明的核苷类抗生素或其药用盐，其结构式如式(Ⅰ)或式(Ⅱ)所示：

式(Ⅰ)中，化合物1：R1＝H，R2＝OMe，R3＝OMe，R4＝H，X＝H；化合物2：R1＝Me，R2＝OH，R3＝OMe，R4＝H，X＝H；化合物3：R1＝Me，R2＝OMe，R3＝OH，R4＝H，X＝H；化合物4：R1＝Me，R2＝OMe，R3＝OMe，R4＝OH，X＝H；化合物5：R1＝Me，R2＝OMe，R3＝OMe，R4＝H，X＝F；化合物6：R1＝Me，R2＝OMe，R3＝OMe，R4＝H，X＝Cl；

式(Ⅱ)中，化合物7：R＝OMe；化合物8：R＝OH。

本发明的第二个目的是提供上述核苷类抗生素或其药用盐在制备抗菌药物中的应用。

一种抗菌药物，其特征在于，包括有效量的作为活性成份的上述核苷类抗生素或其药用盐，和药学上可以接受的载体。

优选，所述的抗菌药物为抗金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌的药物。

进一步优选，当为化合物5或6时，所述的抗菌药物为抗金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌的药物。

M.thermotoleransSCSIO00652突变株00652-Δ1在制备化合物1中的应用，所述的M.thermotoleransSCSIO00652突变株00652-Δ1是mtdM1基因失活的M.thermotoleransSCSIO00652。

M.thermotoleransSCSIO00652突变株00652-Δ2在制备化合物2中的应用，所述的M.thermotoleransSCSIO00652突变株00652-Δ2是mtdM2基因失活的M.thermotoleransSCSIO00652。

M.thermotoleransSCSIO00652突变株00652-Δ3在制备化合物3中的应用，所述的M.thermotoleransSCSIO00652突变株00652-Δ3是mtdM3基因失活的M.thermotoleransSCSIO00652。

M.thermotoleransSCSIO00652突变株00652-Δ4在制备化合物4中的应用，所述的M.thermotoleransSCSIO00652突变株00652-Δ4是mtdH基因失活的M.thermotoleransSCSIO00652。

M.thermotoleransSCSIO00652突变株00652-Δ5在制备化合物5和/或6中的应用，所述的M.thermotoleransSCSIO00652突变株00652-Δ5是mtdV基因失活的M.thermotoleransSCSIO00652。

M.thermotoleransSCSIO00652突变株00652-Δ7在制备化合物7中的应用，所述的M.thermotoleransSCSIO00652突变株00652-Δ7是mtdW基因失活的M.thermotoleransSCSIO00652。

M.thermotoleransSCSIO00652突变株00652-Δ8在制备化合物8中的应用，所述的M.thermotoleransSCSIO00652突变株00652-Δ8是mtdW基因和mtdM4基因失活的M.thermotoleransSCSIO00652。

本发明提供了一类具有抗菌活性的核苷类抗生素化合物1-8，从而为研制新的抗菌药物提供了新的先导化合物，对开发中国海洋药物资源具有重要的意义。

用于本发明的M.thermotoleransSCSIO00652已经在专利号：ZL201110340905.X，发明名称为一种核苷类抗生素A201A高产菌株及其构建方法中公开了。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：M.thermotoleransSCSIO00652突变株00652-Δ1等突变株的构建

M.thermotoleransSCSIO00652能够产生核苷类抗生素A201A，A201A生物合成基因簇的DNA序列已储存在GenBank中，其注册号为JN651966。

突变株是采用了λ-RED介导的PCR-Targeting技术和接合转移技术。构建M.thermotoleransSCSIO00652突变株00652-Δ1的流程如下：

1.从基因组文库中筛选包含核苷类抗生素A201A生物合成基因的克隆，其中编号为142H的克隆包含核苷类抗生素A201A全部的基因簇序列，被用于突变株的构建。

2.将142H粘粒转化入E.coliBW25113/pIJ790中，由此得到细胞命名为：BW25113/pIJ790/142H。

3.以EcoRI和HindIII双酶切过的pIJ773质粒为模板，用mtdM1基因突变引物(M1dF：5’-gccacggaggtcatggcgtcggcccttccctaccctgtcATTCCGGGGATCCGTCGAC-3’；M1dR：5’-gtccccggccagccgttccagcagcgcgccgtcggcgagTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’，小写字母代表与mtdM1基因同源)进行PCR扩增反应，切胶回收阿普拉霉素(Apramycin，Apr)抗性片段并转化BW25113/pIJ790/142H细胞中，用LB+Kan(终浓度50μg/mL)+Apr(终浓度50μg/mL)筛选阳性克隆，得到筛选到的重组粘粒。

4.筛选到的重组粘粒用验证引物(M1tF：5’-AGTACGACACCCGATCACGA-3’；M1tR：5’-GAGCTGGTGCGGATGATGGT-3’)进行PCR进行验证，如能够扩增出1905bp片段则为正确。随后，将验证过的重组粘粒转化E.coliET12567/pUZ8002，得到包含重组粘粒的菌株E.coliET12567/pUZ8002。

5.接合转移：将野生型M.thermotoleransSCSIO00652的菌丝体在TSB培养液中，28℃震荡培养1～2天，累计生物量；将包含重组粘粒的菌株E.coliET12567/pUZ8002在含有卡那霉素(Kan，终浓度50μg/mL)、氨苄青霉素(Amp,终浓度100μg/mL)、氯霉素(Cml,终浓度25μg/mL)和Apr(终浓度50μg/mL)的LB培养液中培养至光密度值OD＝0.6，离心收集细胞，用不添加抗生素的LB培养基洗涤两次，然后与离心后收集的野生型M.thermotoleransSCSIO00652菌丝体进行混合，混合液平铺在加有10mMMgSO4的M-ISP4固体培养基(在ISP4培养基上加有0.1％蛋白胨、0.05％酵母提取物和3％海盐)上；在28℃生长20小时后，每个固体培养基平板上涂布800μL加有抗生素药物的无菌水，其中含抗生素药物：甲氧苄氨嘧啶(Tmp,50mg/mL)30μL，Apr(50mg/mL)20μL；让其在37℃培养箱下生长2-4天，直到接合子出现；接合子在不加抗生素的M-ISP4固体培养基平板上连续传代3代后，挑选表型为Kan^SApr^R(即耐受Apr，不耐受Kan)的接合子，提取基因组DNA，用验证引物(M1tF和M1tR)进行PCR，如PCR产物仅有1905bp突变带，而无野生带则表明接合子即为mtdM1被突变的突变株00652-Δ1，由此得到MtdM1基因失活的M.thermotoleransSCSIO00652突变株00652-Δ1。

本发明中的其他突变株的构建方法与M.thermotoleransSCSIO00652突变株00652-Δ1类似，突变引物和验证引物见表1。

由此得到M.thermotoleransSCSIO00652突变株00652-Δ1(对mtdM1基因进行突变，使其失活，该mtdM1基因的核苷酸序列已经存入GenBank，其是登陆号为：JN651966的12136-12840位碱基所示)、M.thermotoleransSCSIO00652突变株00652-Δ2(对mtdM2基因进行突变，使其失活，该mtdM2基因的核苷酸序列已经存入GenBank，其是登陆号为：JN651966的31045-32109位碱基所示)、M.thermotoleransSCSIO00652突变株00652-Δ3(对mtdM3基因进行突变，使其失活，该mtdM3基因的核苷酸序列已经存入GenBank，其是登陆号为：JN651966的32814-33542位碱基所示)、M.thermotoleransSCSIO00652突变株00652-Δ4(对mtdH基因进行突变，使其失活，该mtdH基因的核苷酸序列已经存入GenBank，其是登陆号为：JN651966的12910-13974位碱基所示)、M.thermotoleransSCSIO00652突变株00652-Δ5(对mtdV基因进行突变，使其失活，该mtdV基因的核苷酸序列已经存入GenBank，其是登陆号为：JN651966的32106-32666位碱基所示)、M.thermotoleransSCSIO00652突变株00652-Δ7(对mtdW基因进行突变，使其失活，该mtdW基因的核苷酸序列已经存入GenBank，其是登陆号为：JN651966的34906-36495位碱基所示)和M.thermotoleransSCSIO00652突变株00652-Δ8(对mtdW基因和mtdM4基因进行突变，使两者失活，该mtdW基因的核苷酸序列已经存入GenBank，其是登陆号为：JN651966的34906-36495位碱基所示，该mtdM4基因的核苷酸序列已经存入GenBank，其是登陆号为：JN651966的36503-37225位碱基所示)。

表1本发明中构建突变株所用的突变引物和验证引物

注：对验证引物而言，小写字母表示与目的基因的序列同源，大写字母表示与aac(3)IV+oriT片段同源

实施例2：突变株的发酵、化合物的分离和提纯流程

1.培养种子液

突变株在M-ISP4固体培养基上培养5～10天后，刮取适量菌丝体接入到M-ISP4液体培养基中，在200rpm、28℃条件下、摇床培养36～48小时得种子液。M-ISP4培养基配方如下：按质量分数计，包括可溶性淀粉1％、酵母提取粉0.05％、胰蛋白胨0.1％、NaCl0.1％、K₂HPO₄0.1％、MgSO₄·7H₂O0.1％、(NH₄)₂SO₄0.2％、海盐3％、CaCO₃0.2％，加CaCO₃之前调pH7.2～7.4，余量为水，灭菌备用。

2.放大培养

经过36～48h培养的50mL种子液转接到1000mL三角瓶(含200mLM-ISP4液体培养基)中继续培养，培养条件为：转速200rpm、温度28℃，培养时间7～9天。

需要特别说明的是，为获取化合物5和6，M.thermotoleransSCSIO00652突变株00652-Δ5在转接后继续培养1天后，需分别加入终浓度0.2mg/mL的3F-对羟基苯甲酸和3Cl-对羟基苯甲酸。3F-对羟基苯甲酸和3Cl-对羟基苯甲酸分别溶解于二甲基亚砜，然后再添加到培养基中。

3.提取分离

以3600rpm的转速离心收集发酵产物，上清液用等体积丁酮萃取3次，丁酮萃取液在低于40℃减压浓缩得发酵液浸膏。该浸膏用100-200目硅胶分离，先采用氯仿/甲醇(100/0,98/2,96/4，94/6,92/8,90/10,80/20,v/v)梯度洗脱顺序得8个组分。HPLC检测各组分，将含有A201A同系物的馏分合并，再次用100-200目硅胶分离，氯仿/甲醇(100/0,98/2,96/4，94/6,92/8,90/10,80/20,v/v)梯度洗脱，TLC分析A201A同系物所在馏分，合并。最后，以275nm波长做检测、采用2.5ml/min的流速、在30min内，以20/80-11/89(水/乙腈，v/v)用反相柱YMC-PackODS-Acolumn(250×10mm,5μm)进行梯度半制备高压液相分离(SP-HPLC)洗脱，得到化合物。HPLC检测纯度。HPLC流动相组成：A相(15％乙腈+85％水+0.1％冰乙酸)和B相(85％乙腈+15％水+0.1％冰乙酸)。流速设定为1mL/min，紫外检测波长275nm。HPLC程序如下：0～80％流动相B0～20min；80-100％流动相B20-25min；100％B相25～30min。根据HPLC检测结果，化合物1，2，3，4，5，6，7和8保留时间分别为8.0min、8.34min、8.9min、8.9min、10.27min、10.87min、9.4min和8.3min。化合物1-8的核磁数据见表2和3。

表2化合物1-4在甲醇中的¹H(500MHz)和¹³CNMR（125HMz）数据

注：*表示信号重叠

表3化合物5-8在甲醇中的¹H(500MHz)和¹³CNMR(125HMz)数据

注：*表示信号重叠

化合物1-8的结构式如式(Ⅰ)和式(Ⅱ)所示。

实施例3：化合物1-8的抑菌实验

用金黄色葡萄球菌(StaphyloccocusaureusATCC29213)，藤黄微球菌(Micrococcusluteus)，枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌做为测试细菌，运用微孔板法对化合物1-8进行抑菌活性测试。具体流程如下：

1)细菌培养：以Mueller-Hinton(MH)肉汤培养基培养实验菌，当其生长8-12h至约0.5个Mcfarland浓度(1×10⁸CFU)时备用。

2)配置样品与稀释菌液。将样品(化合物1、2、3、4、5、6、7或8)配置成3200μg/mL，均以DMSO溶解。将菌液合理稀释，保证最终测试浓度约为5×10⁴CFU。

3)加MH肉汤。用排枪往96孔板中加MH肉汤，第1列加92μL、第12列加100μL无菌MH肉汤，其余各列加入50μL无菌MH肉汤，第11列和第12列分别作为阳性和阴性对照。

4)加样品(药品)：吸取8μl事先配好的样品溶液或阳性对照溶液(也以DMSO溶解)，加入第1列。将排枪体积设置为50μL，将第1列的测试药物小心上下吸取4-5次，以混合均匀，期间要防止用力过猛溅出。

5)混匀样品(药品)。用排枪从第一列中吸取50μL，加入到对应的第二列中，上下吸取小心4-5次，混匀后再吸取50μL加入第三排。依次类推，直到稀释至第10列，从第10列中取出50μL弃掉。

6)活性测试。向1-11列每孔加入50μl稀释的实验菌液。此时，第1列至第10列药物浓度分别为128，64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/mL。盖上盖子，轻微震荡，置于37℃培养箱培养12-18小时，第11列做阳性对照，第12列做空白对照，确定出每个样品的MIC值。每个样品做3个平行。实验结果见表4。

表4化合物1-8的MIC(μg/mL)测试结果

由表2可见，化合物1-8对金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌有显著的抑菌活性，在8个化合物中，以化合物5和6抑菌活性最强。

综上所述，本发明为研制新的抗菌药物提供了新的先导化合物，对开发中国海洋药物资源具有重要的意义。