视网膜色素上皮细胞上皮－间充质转换模型及其应用

技术领域

本发明涉及一种细胞模型，尤其是涉及一种视网膜色素上皮细胞上皮－间充 质转换模型及其应用。

背景技术

增生性玻璃体视网膜病变(proliferativevitreoretinopathy，PVR)是导致孔源性视 网膜脱离手术失败的最主要的原因，因其难治性与复发性一直是各国学者研究的热 点，PVR的发生率是5％-20％。PVR属于增生性疾病。PVR的基本病理过程是视 网膜出现裂孔之后，血—视网膜屏障破坏，玻璃体中蛋白质和活性介质(如 transforminggrowthfactor(TGF)-β,andfibroblastgrowthfactor(FGF))释放，视网 膜色素上皮细胞(retinalpigmentepithelial，RPE)暴露，与光感受器接触丧失， RPE游离、移行，细胞因子刺激RPE增殖，细胞表型发生改变，分泌多种炎性因 子如白细胞介素-1、-2(IL-1，IL-2)，单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)，肿瘤坏死因 子(TNF)等，趋化胶质细胞、成纤维细胞和巨噬细胞等浸润，这些细胞通过旁分 泌和自分泌大量细胞因子，如肝细胞生长因子(hepatocytegrownfactor,HGF)、血 小板源性生长因子(plateletderivedgrowthfactor,PDGF)、转化生长因子(transfer growthfactor.TGF)、血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF) 等，然后联合胶原等细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)、纤维连接蛋白共同刺 激RPE细胞、成纤维细胞等发生分裂、增殖，最后在视网膜表面或玻璃体内形成 增生膜，RPE正是增生膜的主要细胞成分。最终由于增生膜的收缩导致牵拉性视 网膜脱离，诱发PVR证实。

目前已发现的与PVR相关的细胞有5种：RPE、Muller细胞、巨噬细胞、成 纤维细胞和神经胶质细胞。在PVR的早期，发挥主要作用的是RPE细胞和成纤维 细胞，在后期，发挥作用的细胞发生了改变，由成纤维细胞发挥主要作用，偶尔可 见RPE细胞，mvller和胶质细胞则是在后期负责牵拉视网膜脱离的感受器细胞。 因其基本病理过程归因于RPE细胞发生了上皮-间充质细胞转换 (epithelial-mesenchymaltransition，EMT)的转变，进而移行、增生而形成增生膜， 并成为增生膜的主要细胞成分，所以RPE是PVR形成过程中最重要的细胞。

Dunn证实RPE细胞(ARPE-19)具有活体内RPE细胞所特有的结构和功能特 点。因此，可用于体外实验。

EMT转化的机制多种多样的，但是它们都有两个共同的特征，一是通过各种 信号通路使细胞间的连接减弱，二是使上皮细胞表型发生转变，获得间质细胞表型， 通常转为成纤维细胞和肌成纤维细胞。在EMT的过程中，上皮细胞失去了它的极 性和细胞间的连接，失去了它的相关的表型而获得了间质细胞和类似间质细胞的可 以移动和侵入的能力，导致细胞本身周围的细胞相脱离、迁移，远离原来的位置， 而不再是连接紧密的不可移动的上皮细胞。目前已有研究表明，在诱导人类RPE 细胞EMT的过程中会导致一些基因(如TGF-β1、n-cadherin等)的表达的上调， 抑制这些基因的表达也会使EMT的发展受到限制，在有PVR的患者的视网膜前 膜可以检测到这些基因的表达。

根据已有的文献报道，在RPE发生EMT过程有5条信号通路被激活：玻璃 体内容物介导的TGF-β1通路、Wnt通路、STAT通路、MAPK通路、Notch通路。 如果对RPE发生EMT早期事件进行干预，早期激活的信号通路进行阻滞，将对预 防治疗PVR提供了新的策略。

目前，已有的ARPE19脱分化的细胞模型有两种，一种为TGF-β1和玻璃体 共同诱导；另一种为采用EGTA直接诱导，也有用TGFbeta2诱导。这三种细胞模 型都因其实验条件复杂、难以控制、重复率不高等缺点导致应用率较低。

联合TGF-β1和玻璃体共同诱导RPE细胞的EMT转变是最早的方法，这个 模型先后分别用TGF-β1和玻璃体处理RPE细胞，通过检测磷酸化的smad-2， smad-3，smad-4或核内定位smad-2，smad-3，smad-4来表明玻璃内有TGFβ样活 动。结果证实：(1)玻璃体处理的RPE细胞表现出明显的纺锤样改变和增强的能 动性和迁移能力，但因玻璃体诱导的能动性和迁移能力的增加又依赖于TGF-β的 存在，抑制TGF-β可以减弱但因玻璃体诱导的能动性和迁移能力的增加；(2)TGF- β处理的细胞在形态学上弱于玻璃体处理时的纺锤样改变，没有显示出能动性和迁 移能力的改变，向间质细胞分化的基因(α-SMA和CTGF)的表达可以因TGF- β的刺激而上调，却被玻璃体的刺激而下调；(3)SB431542作为TGF-β1通路的 抑制剂，单独存在时对RPE细胞的形态没有影响，可以减弱因TGF-β的处理引起 的EMT样形态学改变，不能阻止玻璃体诱导引起的RPE细胞在形态学上的EMT 改变，甚至有促进的作用，但降低了玻璃体处理引起的的的能动性和迁移能力的增 加。所以，从EMT相关基因(α-SMA和CTGF)的表达上，TGF-β1和玻璃体 存在相互抑制和促进共存在这个模型内，造成了建模时TGF-β1和玻璃体成分的 剂量难以控制，难以使其恰巧处于平衡状态；但从形态学、能动性和迁移能力上， 两者又必须共存。因此，这个细胞模型的重复性较差、条件难以控制。

采用EGTA直接诱导RPE细胞的EMT转变是目前已知的第二种方法。该模 型用2mMEGTA处理RPE细胞48小时，打断了细胞间连接后，发现边缘的细胞 具有了能动性和迁移能力，形态学上也向着间质细胞样发展，但缺点在于中央的细 胞间连接很难被破坏，因此没有发生EMT转变。因此这个细胞模型也不能很广泛 的被应用。

因此建立简便、稳定、易控制的模拟PVR的模型极为重要。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种简便、稳定、 易控制的视网膜色素上皮细胞上皮－间充质转换模型及其应用。通过本模型的建 立，对其机制进行深入的研究，通过干预该模型激活的信号通路或特殊的细胞因子， 有效地抑制RPE的EMT过程，为人类预防治疗PVR提供新的途径和方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种视网膜色素上皮细胞上皮－间充质转换模型：将ARPE-19细胞用胰酶消 化后，再转入无血清含N2和非必需氨基酸的DMEM-F12培养基中，并在陪替氏 培养皿中培养，即得视网膜色素上皮细胞上皮－间充质转换模型。

本发明选用的细胞为体外培养的RPE细胞(ARPE-19)，其具有活体内RPE细 胞所特有的结构和部分功能特点(不表达RPE65)，可用于体外实验。

所述的N2在DMEM-F12培养基中含量为1wt.％，所述的非必需氨基酸在 DMEM-F12培养基中含量为1wt.％。

所述的非必需氨基酸为市售的含有12种非必需氨基酸的标准添加剂。

所述的N2与非必需氨基酸都是购自lifetechonology公司的常规添加剂。N2 的货号为17502-048，lifetechnology，非必需氨基酸货号为11140lifetechnology。

在培养皿中，所述的ARPE-19细胞的密度为0.5×10⁷～1×10⁷cells/培养皿。 细胞密度的重要性在于ARPE19发生EMT有密度要求，如果密度太高，EMT过程 受到抑制。

培养设定时间后收集细胞样本或溶于trizol中，通过显微照相、基因芯片、荧 光定量PCR、Westernblot或ELISA实验方法证实ARPE-19确实经历了上皮－间 充质转换。

上述视网膜色素上皮细胞上皮－间充质转换模型的应用：该模型用于研究视网 膜色素上皮细胞发生上皮－间充质转换的分子机制及寻找上皮－间充质转换的干 预靶向。

先在细胞皿中将P-STAT3-TA-LUC报告基因的质粒用lipofectaminer2000转染 到ARPE-19中，48小时后将细胞转入无血清含N2和非必需氨基酸的DMEM-F12 培养基中在细菌皿中培养，分别于12h、24h、36h、48h、72h后收集细胞样本，蛋 白裂解后常规BCA蛋白定量，并用Luciferase检测信号传导和转录激活因子3的 表达。

该模型用于研究mir-24对ARPE-19发生上皮－间充质转换时的抑制作用。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

1、本发明模拟RPE发生EMT的两个必备条件：一是细胞间紧密连接破坏， 二是RPE脱离Bruch膜。本发明采用消化RPE细胞为单细胞，将分散的单细胞转 入无血清含N2和NEAA的培养液中在陪替氏培养皿上培养，RPE在陪替氏培养 皿的生长出现典型的EMT病理过程，该方法简单易行、重复性好。

2、本发明建立的RPE的EMT模型，模拟了增生性玻璃体视网膜病变(PVR) 的发病机制；并通过实验证实在该细胞模型中stat3信号通路早期明显激活，继而 通过对stat3信号通路的简单干预或Mir-24的干预明显抑制了RPE的EMT转变； 本发明建立的体外RPE的EMT模型，为研发抑制EMT的药物筛选提供一个工具， 并为探索新的药物靶点奠定基础。同时本发明也为治疗以EMT为主要病理过程的 RPE相关的疾病，如增殖性玻璃体视网膜病变(PVR)提供有益的依据，为PVR 的治疗提供新的策略，也为以EMT为主要病理过称的肿瘤转移的治疗提供借鉴。

附图说明

图1：ARPE-19在无血清含N2和NEAA的细菌培养皿中的形态改变(放大 100倍，scalebar:10um.)：(A)正常的ARPE-19；(B)N2和NEAA的细菌培养皿 中，24h；(C)N2和NEAA的细菌培养皿中，36h；(D)N2和NEAA的细菌培养 皿中，48h；(E)N2和NEAA的细菌培养皿中，72h；(F)N2和NEAA的细菌培 养皿中，96h；(G-H)吉姆萨染色，正常的ARPE-19；(I-J)N2和NEAA的细菌 培养皿中，36h。

图2：Westernblot和Luciferase共同证实stat3通路在ARPE-19的EMT模型 中被激活。(A)Westernblot显示将ARPE-19放入无血清含N2和NEAA的细菌培 养皿中36小时后，Pstat3蛋白的水平显著上升；(B)Luciferase显示将ARPE-19 放入无血清含N2和NEAA的细菌培养皿中stat3的表达显著上升。NC:正常未处 理ARPE-19,12h,24h,36h,48h,72h代表ARPE-19细胞在细菌培养皿中萜壁的时间。*： p<0.05vs.正常对照组ARPE-19。

图3：Stat3信号通路抑制剂(S3I)和MAPK信号通路抑制剂U0126对ARPE-19 的EMT过程的抑制作用。(A)正常的ARPE-19；(B)N2和NEAA的细菌培养皿 中,24h；(C)N2和NEAA的细菌培养皿中,48h；(D)N2和NEAA的细菌培养皿中,72h； (E)N2和NEAA的细菌培养皿中,Stat3inhibitor(S3I)；(F)N2和NEAA的细菌培养皿 中,MAPKinhibitor(U0126).放大倍数：100倍。Scalebar:10um.

图4：Westernblot证实ARPE-19的EMT转变及Stat3信号通路抑制剂(S3I)和 MAPK信号通路抑制剂U0126的抑制作用。ARPE-19发生EMT后，与EMT相关 的蛋白(N-Cadherin,VimentinandCD44)表达上调，加入S3I和U0126后，表达 下调。内参为actin.*：p<0.05vs.正常对照组ARPE-19.

图5：ELISA证实ARPE-19的EMT转变及Stat3信号通路抑制剂(S3I)和MAPK 信号通路抑制剂U0126的抑制作用。ARPE-19发生EMT后，与EMT相关的蛋白 (TGF-β,EGF,Collagentype1,GDNF,1L-15)表达上调,加入S3I和U0126后，表达 下调。*：p<0.05vs.正常对照组ARPE-19.

图6：mir-24抑制了ARPE-19在形态学上的EMT样改变。(A)正常对照 mir-24-ARPE-19，celldish；(B)建模后，24h，petridish；(C)建模后，48h， petridish；(D)建模后，72h，petridish；(E)建模后，96h，petridish；(F)建模 后，100h，petridish；Scalebar:10μm，放大倍数：100倍。

图7：mir-24抑制了ARPE-19在EMT过程中相关蛋白的上调水平及stat3信 号通路的激活。(A,B)通过westernblot比较mir-24－ARPE-19和ARPE-19两种细 胞分别在建模后p-stat3和vimentin蛋白的表达。(C)Luciferase检测在mir-24－ ARPE-19的EMT模型中stat3信号通路的激活水平。和fig2中luciferase的结果相 比，mir24显著抑制了stat3上调的幅度。每组数据都是均数±标准误，*代表与正 常对照组相比有统计学意义(P＜0.05＝)。

图8：mir-24抑制了ARPE-19的迁移和增殖能力。(A)细胞划痕24h,48hand72h 后，可见ARPE-1逐渐移行至初始划痕处，划痕面积逐渐减小，其速率明显高于 mir-24-ARPE-19.(B)分别将100个ARPE-19和mir24-ARPE-19细胞接种于10cm的 细胞培养皿中，2、3周后经吉姆萨染色后拍照。结果显示ARPE-19细胞克隆的大 小明显大于mir-24-ARPE-19.(G-I,K-M是第3w拍照的结果，J和N是2w拍照结 果)Magnification,×100.Scalebar:10μm.*代表有统计学意义。

图9：targetscan提示mir-24和炎症因子CHI3L1的靶向作用。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

细胞培养：

ARPE-19细胞的培养分为在细胞皿和在EMT模型中两个部分。在细胞皿培养 时，置于含10％的胎牛血清(FBS)和1％青－链霉双抗的DMEM-F12培养基培养。 每皿细胞(10cm的培养皿，细胞密度为1×107cells/dish)。在做EMT模型时，将 ARPE-19细胞用胰酶消化后，再将细胞培养于无血清含N2和非必需氨基酸 (NEAA)的DMEM-F12培养基中在细菌皿中，分别于12h、24h、36h、48h、72h 后收集细胞样本或溶于trizol中，Q-PCR、ELISA、Westernblot等方法检测。其中 两皿细胞于第24h分别加入S3I(Stat3抑制剂)和U0126，第48h收样。在检测 stat3激活的实验中，先将P-STAT3-TA-LUC报告基因的质粒用lipofectaminer2000 转染到ARPE-19中，48小时后将细胞转入无血清含N2和NEAA的DMEM-F12 中在细菌皿中培养，分别于12h、24h、36h、48h、72h后收集细胞样本用Luciferase 检测stat3的表达。

1、用倒置荧光显微镜(Olympus)观察ARPE-19发生EMT后形态学的改变， 或经吉姆萨染色后观察其形态的改变。

如图1所示，ARPE-19为单层贴壁细胞，未融合时呈卵圆形、多角形或短梭 形，胞质中有显著可见的色素颗粒，其生长迅速，长至融合后，逐渐呈现RPE细 胞形态特征：细胞境界清晰，近似六角形，呈现“鹅卵石”样外观，长时间培养的 融合细胞内色素逐渐增多，胞质逐渐深暗。多次传代后上述形态无明显变化。

将ARPE-19转入无血清含N2和NEAA的细菌培养皿后，其形态发生明显的 改变，从传统的鹅卵石样的六角形转变为类似成纤维细胞的长梭型。为了可以更加 清楚的显示EMT发生的程度，接着做了吉姆萨染色，以显示ARPE细胞发生EMT 的一个标志性的标记物透明质酸的沉积。

2、验证ARPE-19的EMT转变和stat3信号通路激活

基于形态学上的改变，为进一步说明ARPE-19发生了EMT的转变，继续做了 基因芯片分析，芯片结果提示很多与EMT相关的基因的表达量明显上升，相关上 调或下调的信号通路列出。并采用q-pcr验证基因差异表达。结果显示很多与EMT 相关的基因的表达量的确明显上调，同时，用Wsternblot验证了与EMT相关的蛋 白，如图2所示，结果显示蛋白的表达量也明显上升(CD44,Viminten,N-Cardherin)， 而且在培养36小时stat3的磷酸化蛋白(p-stat3)的表达显著上升，stat3信号通路 在这个ARPE-19的EMT模型中被激活。

为了明确stat3信号通路是否被ARPE-19的EMT模型激活，将报告基因质粒 P-STAT3-TA-LUC用Lipofectaminer2000转染到ARPE-19细胞中，48小时后再进 行ARPE19悬浮培养，并于12小时、24小时、36小时、48小时、72小时收取细 胞样本，常规BCA蛋白定量，然后用Luciferase检测stat3的表达，如图2所示， 结果证实stat3的表达明显上升。因此，stat3信号通路确实被ARPE-19的EMT模 型激活。

3、S3I和U0126对ARPE-19的EMT的抑制

在形态学上，stat3信号通路抑制剂(S3I)和MAPK(丝裂原激活蛋白激酶) 通路中ERK的抑制剂(U0126)抑制了ARPE-19细胞的形态向间质细胞的转变。

如图3所示，Q-PCR结果显示，ARPE-19的EMT模型建立后，一些与EMT 相关的基因(A)(TGF-β1,S100A4,Vimentin,ICAM1, CD23,CD46,CD164,ELOVL5)、生长因子(B)(EGF,GDNF)、炎症因子(C)(IL-6, IL-15,IL-33,IFITM,IFIT2,DVL3,IFI44L,CXCL3,CXCL5,IL-11RA)上调，加入S3I 和U0126后，其上调的幅度被减弱，EMT受到抑制。因此，Q-PCR证实ARPE-19 的EMT转变及Stat3信号通路抑制剂(S3I)和MAPK信号通路抑制剂U0126的抑制 作用。

接下来，为了与验证EMT相关的蛋白水平是否有变化，做了Westernblot来 检测N-Cadherin,Vimentin和CD44的蛋白水平，如图4所示，结果显示建模后其 表达明显上调，加入S3I和U0126后，其上调的幅度被减弱，EMT受到抑制。因 此，Westernblot证实ARPE-19的EMT转变及Stat3信号通路抑制剂(S3I)和MAPK 信号通路抑制剂U0126的抑制作用。

如图5所示，ELISA结果显示，在建模后，与EMT相关的TGF-β1,EGF,Collagen type1,GDNF,1L-15的蛋白表达上调，抑制剂S3I和U0126减弱了上述5种蛋白表 达上调的幅度。因此，ELISA证实ARPE-19的EMT转变及Stat3信号通路抑制剂 (S3I)和MAPK信号通路抑制剂U0126的抑制作用。

通过以上内容可知，本实施例建立了简单、稳定的体外模拟PVR的细胞模型。 通过显微照相、基因芯片、荧光定量PCR、Westernblot、ELISA等实验方法证实 ARPE-19在无血清含N2和NEAA的细菌培养皿中确实经历了EMT的转变。同 时，证实了stat3信号通路在ARPE-19的EMT模型被激活，通过抑制stat3信号通 路，可以有效地抑制ARPE-19的EMT的转变。

并且通过抑制MAPK信号通路(u0126)，可以有效的抑制ARPE-19EMT的 转变，因而在这个细胞模型中，MAPK信号通路也被激活。

实施例2

探讨mir-24对ARPE-19发生EMT时的抑制作用。

1、细胞培养

细胞培养的主体为mir-24-ARPE-19细胞，具体分为两个部分，其中之一是验 证mir-24对ARPE-19细胞的EMT、增殖和迁移的影响，以及stat3信号通路的影 响。一部分是明确mir-24与炎症因子CHI3L1的靶向作用。

具体如下：验证mir-24对ARPE-19细胞的EMT的影响:在无血清含N2和 NEAA的DMEM/F12中培养，petridish。验证mir-24对ARPE-19细胞的增殖和 迁移的影响：培养于10％胎牛血清的DMED/F12培养液，celldish，24h后划痕， 换无血清的培养液继续培养。验证mir24对ARPE-19细胞EMT过程中stat3信号 通路的影响:培养于10％胎牛血清的DMED/F12培养液，celldish，转染报告基因 质粒P-STAT3-TA-LUC48h后转入在无血清含N2和NEAA的DMEM/F12中培 养，petridish。明确mir-24与炎症因子CHI3L1的靶向作用：10％胎牛血清的 DMED/F12培养液，celldish。

为了明确mir-24对于ARPE-19细胞脱分化过程的影响，先将病毒载体mir-24 感染入ARPE-19细胞，经流式筛选得到阳性细胞，待细胞稳定遗传后，重复 ARPE-19细胞的EMT模型。如图6所示，发现，从形态学上，mir-24-ARPE-19 没有像间质细胞转变。

继续做Westernblot对比mir-24-ARPE-19和ARPE-19在这个EMT模型中 P-stat3和Vimentin蛋白的表达量，如图7所示，结果显示mir24显著减弱了这两 种蛋白在EMT过程中的上。紧接着，为了验证mir-24对stat3信号通路的抑制作 用，做了transfection-Luciferase实验，将含有报告基因pstat3的质粒转染入 mir-24-ARPE-19，48小时后重复EMT模型，根据timecourse收样做Luciferase检 测。

如图8所示，为了探究mir-24对ARPE-19细胞迁移、增殖能力的影响，做了 以下两种实验：一是划痕试验，结果显示划痕48h后，可见ARPE-19逐渐移行至 初始划痕后，72h后划痕面积明显缩小，统计72h细胞移行率，明显比 mir-24-ARPE-19细胞高。二是经细胞计数后，分别将100个mir-24-ARPE-19和 ARPE-19接种于10cm的细胞培养皿，3周后吉姆萨染色显示，ARPE-19细胞克隆 的直径明显大于mir-24-ARPE-19。这两种实验表明mir24抑制了ARPE-19细胞的 迁移和增殖能力。

本实施证实mir-24对ARPE-19细胞的EMT过程有明显的抑制作用。此外， 通过细胞划痕实验发现：mir-24可以抑制ARPE-19细胞的迁移；通过吉姆萨染色 发现：mir-24可以抑制ARPE-19细胞的增殖及透明质酸的沉积。现在，越来越多 的学者将研究重点放在抑制RPE细胞的增殖和迁移能力上，因为，在正常情况下， RPE细胞处于G0期，没有增殖和迁移活性，当PVR发生、发展时，RPE细胞获 得增殖和迁移的活性，其增殖和迁移能力的变化是PVR病程种的共性，在PVR发 生过程中起了重要的作用。抑制细胞增殖和迁移能力就可以很大程度上阻止或延缓 PVR、AMD的发生、发展过程。因此，mir24在很大程度上可以阻止或延缓PVR 的发生、发展过程。

Mir-24的引入，是由于在基因芯片的结果中，炎症因子CHI3L1在24h时上调 了近900倍，在36h时上调了1622倍，通过生物信息学分析，targetscan预测mir-24 能够靶向CHI3L1的3‘UTR区，mir24可以通过调控FAF1的开放阅读窗(ORF)来 调控细胞的凋亡(图9)。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发 明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此 说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限 于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改 进和修改都应该在本发明的保护范围之内。