公开/公告号CN105136875A
专利类型发明专利
公开/公告日2015-12-09
原文格式PDF
申请/专利权人 江苏巨珩新材料科技有限公司;
申请/专利号CN201510464904.4
申请日2015-07-31
分类号G01N27/26(20060101);
代理机构宜兴市天宇知识产权事务所(普通合伙);
代理人李妙英
地址 214212 江苏省无锡市宜兴市万石镇工业集中区
入库时间 2023-06-18 22:35:31
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2018-03-20
授权
授权
2016-01-06
实质审查的生效 IPC(主分类):G01N27/26 申请日:20150731
实质审查的生效
2015-12-09
公开
公开
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体涉及一种利用超级三明治核酸探针纳米孔道 传感器高灵敏高特异性检测Zn2+的方法。
背景技术
锌是人体必需的微量元素之一，是维持有机体正常生长发育、新陈代谢的重 要物质。科学研究表明，锌离子是组成三百多种生物酶活性催化中心的重要金属 离子之一；它可以作为金属蛋白酶的结构因子或转录因子；同时，锌离子在调控 离子通道，参与神经传导过程和中枢神经系统中都扮演着十分重要的作用。然而， 当锌离子在人体中过量存在时，则会使得人的免疫力下降，可诱发体内血液、肾 和肝内的铁含量降低，铜离子缺乏，从而引起多种疾病的产生。因此，实时跟踪 和监测生物体重的锌离子具有重要的科学价值。
目前对Zn2+的检测方法有很多，其中最为常见的是荧光探针法。虽然荧光 探针法检测具有操作简单、快速等优点，但是在检测过程中，所使用荧光染料的 合成和修饰，却是个复杂的过程，制备成本比较高。且这种方法依然要依赖于仪 器进行，从而限制了该方法的使用范围。有必要利用生物传感器，发展一种快速 快速、准确、实时的锌离子检测方法，使其具有检测成本低、灵敏度高、特异性 强等特点。
发明内容
发明目的：本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种利用超级三明 治核酸探针纳米孔道传感器高灵敏高特异性检测Zn2+的方法。
技术方案：为了达到上述目的，本发明具体是这样来实现的：利用超级三明治核 酸探针纳米孔道传感器高灵敏高特异性检测Zn2+的方法，其特征在于，包括以下 步骤：
(1)高分子纳米孔道的制备
将有重离子轰击径迹的高分子聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜，首先在紫外 灯下正反面各辐照一小时，使其在化学刻蚀中有更好的稳定性；刻蚀时，将辐照 过的PET膜浸没在6M/L的NaOH溶液中，并维持温度在50±5℃，间隔不同 的时间取出PET膜，并用去离子水冲洗表面的NaOH溶液，然后浸泡在去离子 水中4h以除去孔道内和表面残留的NaOH，便得到刻蚀好的含有纳米孔道阵列 的PET膜；当刻蚀时间为5min，通过扫描电镜对纳米孔道进行表征，得到柱形 的纳米孔道，经过对相同条件下50个孔道孔径的统计，得到所构筑的纳米孔道 孔径为34±3nm；
(2)具有对Zn2+特异识别作用的超级三明治核酸探针的设计：
在传统三明治的基础上，通过设计增加两条辅助探针，使其自组装成超级三明治 结构，同时底物探针能够与DNA酶形成特殊的，对离子Zn2+具有特异识别作用的 结构，当有Zn2+在体系中存在时，这种特殊结构就会被剪切，超级三明治结构随 之解开；
(3)纳米孔道的功能化修饰：
经过刻蚀的PET膜，孔道内富含羧基，含有氨基的捕获探针能够经过碳二亚胺盐 酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺活化，形成过渡态的酯，修饰在纳米孔道的内表 面，然后通过碱基互补配对原则，加入其它的核酸探针，自组装形成超级三明治 结构，构筑了纳米孔道传感器件；
(4)对Zn2+进行定量检测：
采用有机玻璃电解槽用于离子响应性实验的测试，电解槽由两个腔室组成， 具有功能性纳米孔道的膜被固定在两个腔室中间，腔室横截面上的孔和膜的接 触，离子可以穿过孔道进行检测，膜电流测试装置为双电极体系，离子响应性测 试中采用的是Ag/AgCl电极，仪器的操作系统为KeithleyInstrumentsExceLINX softwarefortheModel6487软件，根据特殊实验要求，用-2V-+2V的扫场电 压，检测跨膜电流变化。测试的所用的电解液为Tris缓冲溶液(pH＝7.5，100mM NaCl10mMMgCl2)。将超级三明治结构核酸探针在纳米孔道组装10h，然后加入 不同浓度的Zn2+(从1nM到1mM)反应1h，检测电流变化。将1mM的Zn2+、 Pb2+、Cu2+、Hg2+分别用超级三明治结构的纳米孔道传感器进行检测。实验结果 证实，该传感器实现了对Zn2+实时的高灵敏高特异性检测。这一检测方法具有操 作简便、消耗费用低、稳定性好，且通过探针的设计可以适用于其他不同离子的 检测，应用范围广等优点。
有益效果：本发明与传统技术相比，具有如下优点：
1.本发明利用超级三明治结构的核酸探针修饰的纳米孔道传感器，用于Zn2+的检测，提高了检测Zn2+的灵敏度和特异性，最低可以检测出1nM；
2.该检测方法中所用到的传感器，不仅具有信号放大机制，且信号开的机 制也使得其具有很好的稳定性；
3.通过对该传感器中超级三明治结构中核酸探针的设计，可以适用于检测 其他不同的目标分子，具有普适性，更利用推广使用。
附图说明
图1为本发明的原理示意图；
图2为对Zn2+检测的灵敏度结果图；
图3为对Zn2+检测的特异性结果图。
具体实施方式
实施例：
(1)高分子纳米孔道的制备
将有重离子轰击径迹的高分子聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜，首先在 紫外灯下正反面各辐照一小时，使其在化学刻蚀中有更好的稳定性。刻蚀时，将 辐照过的PET膜浸没在2M/L的NaOH溶液中，并维持温度在50±5℃，间隔 不同的时间取出PET膜，并用去离子水冲洗表面的NaOH溶液，然后浸泡在去 离子水中4h以除去孔道内和表面残留的NaOH，便得到刻蚀好的含有纳米孔道 阵列的PET膜。当刻蚀时间为6min，通过扫描电镜对纳米孔道进行表征，得到 柱形的纳米孔道。经过对相同条件下对孔道孔径的统计，得到所构筑的纳米孔道 孔径约为80nm。
(2)具有对Zn2+特异识别作用的超级三明治核酸探针的设计：
在传统三明治的基础上，通过设计增加两条辅助探针，使其自组装成超级三 明治结构。同时底物探针能够与DNA酶形成特殊的，对离子Zn2+具有特异识别作 用的结构，当有Zn2+在体系中存在时，这种特殊结构就会被剪切，超级三明治结 构随之解开。体系中自组装的核酸探针、DNA酶的浓度均为1uM。所设计的核酸 探针序列购买于宝生物工程(大连)有限公司，分别为：
捕获探针：5’-CAGTGTGGAAAATCTCTAGC-(CH2)6-NH2-3’
底物探针：5’-GCTAGAGATTTTCCACACTGATGCAGACGTTGAAGGATTATCTACTA AAAGGGTCTGAGGG-3’
辅助探针1：5’-TACTCCCCCAGGTGCCCCTCAGACCCTTTTAGT-3’
辅助探针2：5’-GCACCTGGGGGAGTAACTAAAAGGGTCTGAGGG-3’
DNA酶：5’-AGATAATCTAGTTGAGCTGTCTGCAT-3’
(3)纳米孔道的功能化修饰：
经过刻蚀的PET膜，孔道内富含羧基-COOH。因此，含有氨基的捕获探针能 够经过碳二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺活化，形成过渡态的酯，最后 通过两步化学反应修饰在纳米孔道的内表面。然后通过碱基互补配对原则，加入 其它的核酸探针，自组装形成超级三明治结构，构筑了纳米孔道传感器件。
(4)对Zn2+进行定量检测：
自制跨膜电流测试装置为双电极体系，离子响应性测试中采用的是Ag/AgCl 电极。仪器的操作系统为KeithleyInstrumentsExceLINXsoftwareforthe Model6487软件。根据特殊实验要求，用-2V-+2V的扫场电压，检测跨膜电流变 化。测试的所用的电解液为Tris缓冲溶液(pH＝7.5，100mMNaCl10mMMgCl2)。 将超级三明治结构核酸探针在纳米孔道组装10h，检测体系中的跨膜电流明显降 低。将此时的电流值设为起点，然后加入不同浓度的Zn2+(从1nM到1mM)反应 1h，检测跨膜电流变化，呈现信号逐步增加的趋势。将1mM的Zn2+、Pb2+、Cu2+、 Hg2+分别用超级三明治结构的纳米孔道传感器进行检测。
机译： 利用中心卫星纳米结构的等离子共振的高灵敏度重金属检测传感器及其检测方法，即使在非常高的灵敏度下也能检测到痕量的重金属离子
机译： 纳米和非特异性核酸结合剂的高灵敏核酸检测方法
机译： 使用纳米孔和非特异性核酸结合剂的高灵敏核酸检测方法
