裂果薯总皂苷在抗细胞微管作用中的应用

技术领域

本发明属于医药领域，涉及裂果薯与裂果薯总皂苷在制备以细胞微管为靶点的药物中的应用。

背景技术

微管是一种具有极性的细胞骨架。微管是由α，β，γ等类型的微管蛋白亚基形成的微管蛋白聚合体。微管在细胞中有着重要的功能：1、支架作用，细胞中的微管起到支撑作用，在神经细胞的轴突和树突中，微管束沿长轴排列，起支撑作用，在胚胎发育阶段微管帮助轴突生长，突入以细胞核为中心向外放射状排列的微管纤维；2、细胞内运输，在周围组织与成熟的轴突中，微管起到物质运输的作用，与微管结合的驱动蛋白在消耗ATP的情况下能在细胞内运输小泡；3、形成纺锤体，在分裂细胞中牵引染色体到达分裂极，而微管的动态聚合与解聚过程是细胞分裂中的重要环节，任何于扰这一过程的药物都可能影响肿瘤细胞生长；4、细胞迁移与形变等运动。

无限制的快速增殖是肿瘤细胞的重要特点,而微管的动态聚合与解聚过程是细胞分裂中的重要环节,任何于扰这一过程的药物都可能影响肿瘤细胞生长。多数抑制微管活性的化合物都对肿瘤细胞生长有不同程度的抑制作用。此外,以微管为靶点的药物在肿瘤临床治疗中的成功应用,说明微管是抗癌药物的有效靶点。

目前的研究表明，微管蛋白聚集抑制剂结合于秋水仙碱结合域或长春碱结合域，抑制血管内皮细胞的生长，选择性地阻断已形成的血管、抑制血流，从而实现抗血管生成的作用，在血管类药物中有一定的应用。

神经细胞轴突生长过程中，生长锥内肌动蛋白丝与微管相互作用，改变微管与肌动蛋白丝的动态性，影响它们之间的相互作用，从而影响生长锥的行为。肌动蛋白丝与微管之间的动态协调作用，在轴突延伸与转向过程中具有重要意义，可以此为靶点来选择药物调控神经细胞的生长。

微管作为重要的细胞调控与结构部分，已成为药物研发的热点，目前已上市的针对微管蛋白的药物有紫杉醇，长春新碱等。裂果薯，百合纲，百合目，蒟蒻薯科，裂果薯属植物，拉丁学名：SchizocapsaplantagineaHance，别名：屈头鸡、水狗仔、长须果、冬叶七、黑冬叶、箭根薯、客妈连、客妈七、马老头、米荷瓦、曲头鸡、水槟榔、水鸡仔、水萝卜、水三七、水田七、水虾公、田螺七、土贝母、土三七、小田螺七。多生于水沟边、田埂草地上。分布于江西、湖南、广东、广西及贵州等省区。以块茎入药，主治咽喉肿痛，急性肠胃炎，泌尿道感染，牙痛，慢性胃炎，胃、十二指肠溃疡，风湿性关节炎，月经不调，疟疾，跌打损伤；外用治疮疡肿毒，外伤出血。中国专利ZL201310072951公开了裂果薯总皂苷在治疗癌症方面的应用,并公开了其制备方法；但目前尚未有裂果薯皂苷作用于微管方面的报道。

发明内容

本发明的目的是公开一种从广西特色植物裂果薯的块茎中提取出的总皂苷在制备以细胞微管为靶点的药物中的应用。

本发明提供了一种新的抗微管作用的物质，该物质为裂果薯（拉丁学名：SchizocapsaplantagineaHance）中提取的总皂苷成分和包含的各总皂苷单体化合物成分在制备以细胞微管为靶点的药物中的应用。

本发明中，将裂果薯总皂苷用于对SMMC-7721细胞迁移能力的影响实验，结果显示裂果薯总皂苷对细胞的迁移有抑制作用，该效应通过作用于微管蛋白实现。

本发明中，将裂果薯总皂苷用于对细胞克隆增殖的抑制作用的实验。细胞的增殖与集落形成能力与微管相关，微管蛋白调控剂可通过调节微管功能降低细胞的增殖与集落形成能力；实验结果显示：裂果薯总皂苷加药组细胞克隆数显著低于空白对照组，且呈剂量依赖性。说明裂果薯总皂苷能够抑制肿瘤细胞的增殖与分裂，该效应通过作用于微管微管蛋白实现。

本发明中，进行了免疫荧光观察裂果薯总皂苷对微管形态的影响的实验，结果显示：与空白对照组相比，裂果薯总皂苷作用后的SMMC-7721细胞微管皱缩于细胞核周围，细胞呈圆形或梭形，正常细胞的微管以细胞核为中心向外伸展平铺；可见裂果薯总皂苷可以调控微管蛋白的功能。

本发明中，进行了微管聚合实验观察裂果薯总皂苷对微管蛋白聚合的影响；结果显示：裂果薯总皂苷具有干扰微管聚合与抗微管解聚的作用，裂果薯总皂苷对微管蛋白具有调控作用。

裂果薯总皂苷对细胞的迁移有抑制作用，能够抑制肿瘤细胞的增殖与分裂，裂果薯总皂苷具有干扰微管聚合与抗微管解聚的作用，对微管蛋白具有调控作用。裂果薯总皂苷的作用在肿瘤与血管、神经药物中有广泛的应用，是一种非常有价值的药物靶点；而且裂果薯总皂苷的植物来源为广西本地特有的植物品种，有较大的开发利用价值，有一定种植规模，廉价易得。

附图说明

图1为裂果薯总皂苷对细胞划痕恢复的影响，图1中可见裂果薯总皂苷高剂量组相比空白对照组，划痕无法愈合且相比24h前更宽；说明裂果薯总皂苷对细胞的迁移有抑制作用，该效应通过作用于微管蛋白实现。

图2为裂果薯总皂苷对细胞集落形成能力的影响，由图2可见，裂果薯总皂苷加药组细胞克隆数显著低于空白对照组，且呈剂量依赖性；说明裂果薯总皂苷能够抑制肿瘤细胞的增殖与分裂，该效应通过作用于微管微管蛋白实现。

图3为免疫荧光观察裂果薯总皂苷对微管蛋白的作用，由图3可见与空白对照组相比，裂果薯总皂苷作用后的SMMC-7721细胞微管皱缩于细胞核周围，细胞呈圆形或梭形，正常细胞的微管以细胞核为中心向外伸展平铺；可见裂果薯总皂苷可以调控微管蛋白的功能。

图4为微管聚合实验观察裂果薯总皂苷对微管蛋白聚合与解聚的影响；由图4可见，微管蛋白的吸光度-时间曲线在37℃上升直到稳定，冰浴后又降低到0点。作用于微管蛋白的药物可破坏这一过程，图4中紫杉醇的曲线可见冰浴后OD值下降很慢，是因为紫杉醇具有抗微管蛋白解聚的作用，因此在冰浴中微管蛋白仍保持聚合状态。相比空白组与紫杉醇，裂果薯总皂苷在开始孵育时曲线上升较慢，冰浴后出现与紫杉醇类似的效应，说明裂果薯总皂苷具有干扰微管聚合与抗微管解聚的作用，证明裂果薯总皂苷对微管蛋白具有调控作用。

具体实施方式

1．裂果薯总皂苷对SMMC-7721细胞迁移能力的影响

1.1实验方法

将人肝癌细胞SMMC-7721培养于含15%胎牛血清的DMEM培养基中，置于CO2培养箱（37℃，5%CO2，饱和湿度）中培养。待细胞为对数生长期时以0.25%胰蛋白酶将细胞消化，以5*10⁶个/孔浓度接种于6孔板中，置CO2培养箱（37℃，5%CO2，饱和湿度）继续培养12小时让细胞完全贴壁。用10微升灭菌移液枪枪头在细胞密度为5*10⁶个/孔的六孔板细胞孔中直线匀速轻轻划过，显微观察可见宽度均匀的细胞划痕。拍照记录划痕后在各孔中分别加入含0.01~100μg/ml裂果薯总皂苷的培养基2ml，并设空白对照孔，24h后观察划痕变化情况并拍照记录；

1.2实验结果

细胞的迁移与扩散运动与微管蛋白的聚合解聚已及微管蛋白的形态维持相关，调控微管蛋白的药物通过影响微管的功能降低细胞的迁移能力。图1中可见裂果薯总皂苷高剂量组相比空白对照组，划痕无法愈合且相比24h前更宽。说明裂果薯总皂苷对细胞的迁移有抑制作用，该效应通过作用于微管蛋白实现。

2.裂果薯总皂苷对细胞克隆增殖的抑制作用

2.1实验方法

将对数生长期的SMMC-7721消化稀释至200个/ml，每孔2ml接种于六孔板中，37℃、5%CO2培养箱中培养48h，换入含有0.01~100μg/ml裂果薯总皂苷的培养基2ml，并设空白对照孔，每剂量组设3个平行孔，培养4h后吸走含药培养基，PBS洗2次后加入普通培养基2ml继续培养，每2d换液一次，6d后以吉姆萨染色法进行染色观察并对细胞集落计数，细胞数小于200的集落不记入集落数中，相连的集落按1个集落计数；

2.2实验结果

细胞的增殖与集落形成能力与微管相关，微管蛋白调控剂可通过调节微管功能降低细胞的增殖与集落形成能力。由图2与表1可见，裂果薯总皂苷加药组细胞克隆数显著低于空白对照组，且呈剂量依赖性。说明裂果薯总皂苷能够抑制肿瘤细胞的增殖与分裂，该效应通过作用于微管蛋白实现。

3.免疫荧光观察裂果薯总皂苷对微管形态的影响

3.1实验方法

SMMC-7721细胞调整细胞密度约为3*10⁵个/ml，每孔2ml接种于6孔板中，培养24h后弃去原培养基，加入含有0.01~100μg/ml裂果薯总皂苷的培养基2ml，并设空白对照组，继续培养24h，弃去培养基，PBS洗2次每次5min，加入1ml4%多聚甲醛固定30min，PBS洗2次每次5min，加入1ml0.5%TritonX-100（PBS配制）室温通透20min，PBS洗3次每次3min，吸干PBS后滴加山羊血清封闭液室温封闭30min，按博士德试剂盒操作说明滴加一抗Tubulin-α鼠抗人多克隆抗体(1：50)，4℃孵育过夜，PBST洗涤3次，滴入二抗荧光(FITC)标记(1∶64)，37℃孵育1h，PBST洗3次每次3min，抗荧光淬灭剂封片，避光，在荧光显微镜下观察细胞并拍照；

3.2实验结果

微管蛋白的正常形态是细胞功能的保证，微管蛋白调控剂可影响微管的功能使细胞形态发生改变，微管蛋白的分布出现异常。由图3可见与空白对照组相比，裂果薯总皂苷作用后的SMMC-7721细胞微管皱缩于细胞核周围，细胞呈圆形或梭形，正常细胞的微管以细胞核为中心向外伸展平铺。可见裂果薯总皂苷可以调控微管蛋白的功能。

4.微管聚合实验观察裂果薯总皂苷对微管蛋白聚合的影响

4.1微管蛋白的分离纯化

取SD大鼠（280±20g）,迅速断头取脑，除去脑膜剪碎，MES缓冲液(MES0.1mol/L,EGTA0.1mmol/L,MgCl₂0.1mol/L,ATP1.0mmol/L,pH6.5)洗2次，4℃玻璃匀浆器匀浆，4℃，10500g离心1h，取上清，加入等体积聚合缓冲液(MES0.1mol/L,EGTA1.0mmol/L,MgCl₂0.5mmol/L,丙三醇8.0mol/L,ATP1.0mmol/L,pH6.5),置于37℃水浴内保温30min，同时振摇，再以26℃，10500g离心1h，取沉淀，加入1/10匀浆体积的冷MES缓冲液搅拌置冰浴30min，重复上诉低、高温离心各一次。Lowry’s法测定蛋白含量；

4.2裂果薯总皂苷对微管蛋白活性的作用

将微管蛋白放冰浴用MES缓冲液稀释加入96孔板中，加入裂果薯总皂苷或紫杉醇，对照组不加药物；紫杉醇与裂果薯总皂苷终浓度均为2μg/ml，微管蛋白终浓度为2.5mg/ml，每孔终体积为200μL；加药后从冰浴上取出，迅速在酶标仪350nm处调定为0点，然后将96孔板置于37℃水浴保温,于不同时间点测定OD值，25min后，将比色杯置冰浴，随时测定OD值。比较37℃保温20min时OD值与冰浴10min后OD值；

4.3实验结果

微管蛋白在由ATP供能的情况下，可在37℃发生聚合进而使吸光度增大，当从37℃转移至冰浴时，微管蛋白聚合体可发生解聚使吸光度减小。正常的微管蛋白可完全的反复进行这一过程，由图4可见，微管蛋白的吸光度-时间曲线在37℃上升直到稳定，冰浴后又降低到0点。作用于微管蛋白的药物可破坏这一过程，图4中紫杉醇的曲线可见冰浴后OD值下降很慢，是因为紫杉醇具有抗微管蛋白解聚的作用，因此在冰浴中微管蛋白仍保持聚合状态。相比空白组与紫杉醇，裂果薯总皂苷在开始孵育时曲线上升较慢，冰浴后出现与紫杉醇类似的效应，说明裂果薯总皂苷具有干扰微管聚合与抗微管解聚的作用，证明裂果薯总皂苷对微管蛋白具有调控作用。