一种副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌的检测引物组、检测试剂盒和检测方法

技术领域

本发明属于水产养殖动物病原菌检测领域，具体涉及一种副溶血弧菌、美人 鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌的检测引物组、检测试剂盒和检测方法。

背景技术

副溶血弧菌(VibrioParahaemolyticus)、美人鱼发光杆菌(Photobacterium damsel)和鰤诺卡氏菌(Nocardiaseriolae)是三种常见的水产病原菌，其中副溶血弧 菌和美人鱼发光杆菌属于革兰氏阴性菌，而鰤诺卡氏菌属于革兰氏阳性菌，这三 种菌在海洋环境及水产养殖环境中广泛分布，可引起多种水产养殖动物大量死亡， 造成严重的经济损失。

副溶血弧菌具有嗜盐性，可经粪-口途径传播。食用生鲜或未加工的海产食 品，尤其是牡蛎，非常容易患由副溶血弧菌引起的急性肠胃炎。副溶血弧菌的爆 发往往集中在沿海地区的夏季和初秋，因为这个时间段水温较高进而细菌含量更 高。我们最常食用的海鲜包括乌贼、鲭鱼、金枪鱼、沙丁鱼、蟹、虾、牡蛎和蛤 蚌等都容易携带副溶血弧菌。美人鱼发光杆菌具有嗜盐性，其重要致病因子是胞 外蛋白酶类、胞外溶血素和细胞溶素等，现已从多种鱼类、爬行动物、软体动物 和甲壳动物中分离到美人鱼发光杆菌，此菌严重威胁水产养殖重要经济品种。诺 卡氏菌为属兼性细胞内病原，广泛分布在土壤、活性污泥、水、动植物和人的组 织中，以腐生为主，可引发人、牛、猫、犬等哺乳动物及多种水产养殖动物疾病， 已经成为一种引人注目的人-兽-鱼共患病病原。

凡纳滨对虾以其肉味鲜美，适应性强、生长迅速和抗病力强等优点，成为当 今世界养殖产量最高的对虾养殖品种之一。2013年我国海水养殖虾类产量约为 108万吨，其中南美白对虾产量约为81万吨，占总产量75％。然而随着养殖密度 的增加及养殖环境的恶化，对虾病害日益严重。2014年对虾肝胰腺坏死症 (AHPNS)席卷全球对虾产区，根据实验表明，每一尾病虾会吸引57尾健康虾 的蚕食，疾病1传57，致死率可达100％。研究发现AHPNS并不是单一某种细菌 造成的，而是由综合细菌引起的，并且与副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和诺卡氏 菌有着密切的关联。目前养殖户采用混养模式来预防AHPNS病害，通过凡纳滨 对虾与不同鱼类混养的方式，利用它们在食物链中的不同作用，及时清理病虾和 死虾，降低病原传播、减少病害发生，提高养殖成功率及产量。然而这种方法并 没有能从本质上去判断对虾是否患有AHPNS疾病，采用这种方法降低病原传播 的概率并不高，仍可能遗漏一些患病的对虾在水域中而未被鱼类所清理，进而仍 存在对其他健康对虾的传染性隐患，而且该方法存在对虾和鱼交叉感染的概率， 因此存在着一些不足。

PCR技术是一种通过体外酶促反应放大扩增特定的基因的技术，该技术能 将微量的DNA大幅增加，具有检测灵敏度高的特点，而多重PCR方法是PCR 技术的重要分支，可检测多种特异性基因片段。三重PCR在普通PCR的基础上， 在同一反应体系中加入三对引物，进而同时特异性扩增出三种目的基因片段，这 样操作节省时间和成本。如何建立三重PCR方法用于快速检测副溶血弧菌、美 人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌具有重要的实际意义和应用价值。

发明内容

针对现有技术存在的上述不足，本发明所要解决的技术问题是：如何提供一 种副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌的检测引物组，使其可用于三重 PCR检测方法中，用以检测样品是否感染有副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺 卡氏菌。

本发明所要解决的技术问题还有：如何提供一种检测试剂盒和检测方法，用 以直接检测样品是否感染有副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌，且具有 精确度高、检测方便的特点。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种副溶血弧菌、美人 鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌的检测引物组，包括引物对V.pa、引物对N.se和引物对 P.da；其中，所述引物对V.pa包括核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的V.pa-F和核 苷酸序列如SEQIDNO.2所示的V.pa-R；所述引物对N.se包括核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示的N.se-F和核苷酸序列如SEQIDNO.4所示的N.se-R；所述引物对 P.da包括核苷酸序列如SEQIDNO.5所示的P.da-F和核苷酸序列如SEQIDNO.6 所示的P.da-F。

一种副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌的检测试剂盒，包括上述检 测引物组。

采用上述检测试剂盒进行检测的方法，包括如下步骤：

1)取待检测样品50～100mg并加入500～550μL的TE缓冲液，用玻璃匀浆器 充分匀浆后，于12000r/min离心10min；

2)步骤1)离心后去除沉淀，取上清备用；

3)向步骤2)上清溶液中加入30μL质量浓度为10％的SDS溶液和15μL 20mg/mL的蛋白酶K，并于37℃温育1h；

4)向步骤3)温育后的溶液中加入100μL5mol/L的NaCl溶液,充分混匀后再 加入80μLCTAB的NaCl溶液，65℃温育20min；

5)向步骤4)温育后的溶液中加入与温育后的溶液等体积的酚-氯仿-异戊醇 混合溶液混匀，12000g/min离心4～5min；

6)将步骤5)离心后的上清转入一只新管中，加入上清液0.6～0.8倍体积的异 丙醇，12000g/min离心4～5min；

7)步骤6)离心后去上清，沉淀用1mL的体积浓度为70％的乙醇洗涤后，12000 g/min离心4～5min；

8)步骤7)离心后去上清，沉淀常温干燥5～10min，重溶于30～50μLTE缓冲 液，即为样品DNA模板；

9)样品组三重PCR反应体系包括：12.5μL2×PCRDsMix、0.8μL引物V.pa-F、 0.8μL引物V.pa-R、1.2μL引物N.se-F、1.2μL引物N.se-R、1.6μL引物P.da-F、1.6 μL引物P.da-R、3μL步骤8)得到的样品DNA模板和2.3μL无菌水；

10)阳性对照组三重PCR反应体系包括：12.5μL2×PCRDsMix、0.8μL引物 V.pa-F、0.8μL引物V.pa-R、1.2μL引物N.se-F、1.2μL引物N.se-R、1.6μL引物P.da-F、 1.6μL引物P.da-R、3μL阳性对照品和2.3μL无菌水；

11)将步骤9)制得的样品组和步骤10)制得的阳性对照组分别混匀后12000 g/min离心10s，置于PCR仪中，分别于94℃预变性5min，94℃变性30s、55℃ 退火30s、72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min，进行PCR反应；

12)对步骤11)PCR反应结果进行电泳检测，分别设置样品孔、阳性对照孔 和参比孔；所述样品孔取步骤11)样品组PCR反应产物5μL与6×LoadingBuffer 1μL混合，加入到1％琼脂糖凝胶点样孔中；所述阳性对照孔取步骤11)阳性对照 组PCR反应产物5μL与6×LoadingBuffer1μL混合，加入到1％琼脂糖凝胶点样孔 中；所述参比孔取5μLDL2000DNAMarker加入到1％琼脂糖凝胶点样孔中；以 140V电压分别对所述样品孔、所述阳性对照孔和所述参比孔进行电泳20min后， 于凝胶成像系统下观察结果；若样品孔电泳条带出现与阳性对照孔相同大小的条 带，则说明待测样品中含有相对应的细菌。

相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

1、本发明引物组具有高特异性，可以根据是否扩增就能判断目标基因的存在 与否，从而能够确定样品是否含有副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌或鰤诺卡氏菌， 能够实现对副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌进行检测。

2、采用本发明检测试剂盒可以同时对三种病原菌进行检测，即进行一次实验 就可以得到三种病原菌的检测结果，并且在5个小时左右完成检测。相比传统检 测方法，不仅节约了成本和时间，也减少了劳动力的支出。

3、本发明的副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌三重PCR检测方法， 不但使得南美白对虾养殖水体病原检测更加快速，而且可用于南美白对虾混养过 程中各时期跟踪检测中，可以对病害的爆发进行及时预警，避免病原菌传播流行， 减少对虾和鱼交叉感染的概率，降低对虾及其混养鱼类疾病爆发的风险，提高科 学管理效率，具有很高的实用价值，有利于增加养殖效益。

4、本发明的检测操作简单，不需要使用复杂仪器，也不需要特殊试剂，只 需常规PCR仪即可，对检测人员的技术素质要求较低，只需进行简单培训即可。

5、本发明应用范围广泛。本发明不仅可以检测南美白对虾养殖水体中的副 溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌，也可针对其他环境或患病动物进行快 速检测。

6、本发明检测试剂盒制备成本低廉，制备工艺简单，容易实现工业化大生 产，具有广阔的市场前景。

附图说明

图1为实施例2中三重PCR扩增产物及单一PCR扩增产物检测结果电泳图；

图2为实施例5中养殖水体样品检测结果电泳图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和说明书附图对本发明作进一步详细说明。本实施案例 在以本发明技术为前提下进行实施，现给出详细的实施方式和具体的操作过程， 但本发明的保护范围不限于以下的实施例。

实施例1细菌基因组DNA的提取

分别取副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌(南海水产研究所渔业 生物病害研究室自存)，采用如下步骤进行DNA提取：

(1)用500-550μL的TE缓冲液重悬细菌；

(2)向步骤(1)重悬后的溶液中加入30μL质量浓度为10％的SDS溶液 和15μL的蛋白酶K(20mg/mL)，混合均匀并于37℃温育1h；

(3)向步骤(2)温育后的溶液中加入100μL5mol/L的NaCl溶液，充 分混匀后再加入80μLCTAB的NaCl溶液溶液(将CTAB溶于0.5mol/L的N aCl溶液中，CTAB和所述NaCl溶液的质量体积比为1:20)，于65℃温育20mi n；

(4)向步骤(3)温育后的溶液中加入与步骤(3)温育后的溶液等体积的 酚-氯仿-异戊醇(酚、氯仿和异戊醇的体积比为25:24:1)的混合溶液混匀，120 00g/min离心4-5min；

(5)将步骤(4)离心后的上清转入一只新管中，加入上清液0.6-0.8倍体 积的异丙醇，12000g/min离心4-5min；

(6)步骤(5)离心后去上清，沉淀用1mL的体积浓度为70％乙醇洗涤后， 12000g/min离心4-5min；

(7)步骤(6)离心后去上清，沉淀常温干燥5-10min，重溶于30-50μL TE缓冲液，备用。

实施例2副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌三重PCR检测引物 组的设计和有效性检测

1、分别选取副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌的特异性基因 (GI:6714616、GI:2988378、GI:696553489)，采用PrimerPremier5.0软件分 析设计出相应的引物对，各引物对能分别各自专一性鉴别上述细菌的特异性，引 物序列如下所示：

2、有效性检测：

(1)合成上述设计的引物组，用引物组的引物分别对实施例1提取的副溶血 弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌的DNA进行单一PCR验证，其中单一PCR 反应体系如下：

(2)同时对副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌进行三重PCR验证， 采用如下三重PCR反应体系：

(3)采用如下PCR反应程序，对上述PCR反应体系进行PCR反应：

1)94℃预变性5min。

2)94℃变性30s。

55℃退火30s。

72℃延伸1min。

共计35个循环。

3)72℃延伸10min。

上述PCR反应结束后，分别取各组PCR反应产物5μL与6×LoadingBuffer1 μL混合，分别加入到质量浓度为1％的琼脂糖凝胶点样孔中，同时在样品孔旁添 加对照组，对照组琼脂糖凝胶点样孔中加入5μLDL2000DNAMarker作对照，以 140V电压进行电泳，约20min后于凝胶成像系统下观察结果。

3、检测结果：

检测结果如图1所示，图1中泳道M为MarkerDL2000；泳道1为副溶血弧菌 单一PCR的扩增结果，目的扩增片段长度为464bp；泳道2为副溶血弧菌单一PCR 的阴性对照；泳道3为鰤诺卡氏菌单一PCR的扩增结果，目的扩增片段长度为690 bp；泳道4为鰤诺卡氏菌单一PCR的阴性对照；泳道5为美人鱼发光杆菌单一PCR 的扩增结果，目的扩增片段长度为954bp；泳道6为美人鱼发光杆菌单一PCR的 阴性对照；泳道7为三种病原菌三重PCR的扩增结果，从下到上依次为副溶血弧 菌、鰤诺卡氏菌和美人鱼发光杆菌；泳道8为三种病原菌三重PCR的的阴性对照； 从图1可以看出单一PCR检测相应的单一条带及三重PCR检测相应的3条单一条 带，分别与副溶血弧菌、鰤诺卡氏菌和美人鱼发光杆菌的扩增片段长度分别为464、 690和954bp相吻合，即说明本发明的副溶血弧菌、鰤诺卡氏菌和美人鱼发光杆 菌检测用引物组可以准确、特异性地检测出副溶血弧菌、鰤诺卡氏菌和美人鱼发 光杆菌。

实施例4检测试剂盒

本实施例的检测试剂盒可用于三重PCR快速诊断样品中是否含有副溶血弧 菌、鰤诺卡氏菌和美人鱼发光杆菌，该检测试剂盒由副溶血弧菌、鰤诺卡氏菌和 美人鱼发光杆菌的检测用引物组、蛋白酶K、SDS溶液、酚-氯仿-异戊醇混合溶 液、异丙醇、体积浓度为70％的乙醇、TE缓冲液、CTAB的NaCl溶液、阳性对照 品和PCRDsMix组成，其中：

(1)副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌检测用引物组：1管内装副 溶血弧菌引物V.pa-F及V.pa-R，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2 所示；2管内装美人鱼发光杆菌引物N.se-F及N.se-R，其核苷酸序列分别如SEQID NO.3和SEQIDNO.4所示；3管内装鰤诺卡氏菌引物P.da-F及P.da-R，其核苷酸序 列分别如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示；以上引物浓度分别为10μM。

(2)蛋白酶K(20mg/mL)，置于容器，1管；

(3)质量浓度为10％SDS，置于容器，1管；

(4)酚-氯仿-异戊醇混合溶液(体积比25:24:1)，置于容器，1管；

(5)异丙醇，置于容器，1管；

(6)制备体积浓度为70％乙醇，置于容器，1管；

(7)制备TE缓冲液(10mMTris-HCl,0.1mMEDTA，pH8.0)，置于容器， 1管；

(8)制备CTAB的NaCl溶液(5gCTAB溶于100mL0.5MNaCl溶液中)，置 于容器，1管；

(9)制备阳性对照品：提取副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌的 基因组DNA，等体积混合，置于容器，1管；

(10)2×PCRDsMix，置于容器，1管；

(11)一块泡沫板，将上述13个小管分别对应放置于泡沫板的孔内，装于盒 中即制备得到本实施例的检测试剂盒。

本实施例中各试剂管制备后均经过抽样质检，对其质量进行监控。

实施例5利用实施例4制得的试剂盒进行检测的方法

1、本实施例采用实施例4制备所得试剂盒，采用三重PCR对凡纳滨对虾养 殖水体样品是否含有副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌进行快速检测， 其具体步骤如下：

(1)取待检测水体样品50ml于12000r/min离心10min；

(2)步骤1)离心后去上清，加入500-550μL的TE缓冲液重悬沉淀，备用；

(3)向步骤(2)重悬后的溶液中加入30μL质量浓度为10％的SDS溶液和 15μL的蛋白酶K(20mg/mL)，并于37℃温育1h；

(4)向步骤(3)温育后的溶液中加入100μL5mol/LNaCl,充分混匀后 再加入80μLCTAB的NaCl溶液，65℃温育20min；

(5)向步骤(4)温育后的溶液中加入与温育后的溶液等体积的酚-氯仿- 异戊醇混合溶液混匀，12000g/min离心4min；

(6)将步骤(5)离心后的上清转入一只新管中，加入上清液0.6倍体积的 异丙醇，12000g/min离心4min；

(7)步骤(6)离心后去上清，沉淀用1mL的体积浓度70％乙醇洗涤后， 12000g/min离心4min；

(8)步骤(7)离心后去上清，沉淀常温干燥10min，重溶于30-50μLTE 缓冲液，即为样品DNA模板；

(9)样品组三重PCR反应体系包括：12.5μL2×PCRDsMix、0.8μL引物 V.pa-F(10μM)、0.8μL引物V.pa-R(10μM)、1.2μL引物N.se-F(10μM)、1.2μL 引物N.se-R(10μM)、1.6μL引物P.da-F10μM)、1.6μL引物P.da-R(10μM)、3μL 步骤(8)得到的样品DNA模板和2.3μL无菌水；

(10)阳性对照组三重PCR反应体系包括：12.5μL2×PCRDsMix、0.8μL 引物V.pa-F(10μM)、0.8μL引物V.pa-R(10μM)、1.2μL引物N.se-F(10μM)、 1.2μL引物N.se-R(10μM)、1.6μL引物P.da-F10μM)、1.6μL引物P.da-R(10μM)、 3μL阳性对照品和2.3μL无菌水；

(11)将步骤9)制得的样品组和步骤10)制得的阳性对照组分别混匀后 12000g/min离心10s，置于PCR仪中，分别94℃预变性5min，(94℃变性30s、55℃ 退火30s、72℃延伸1min)35个循环，72℃延伸10min，进行PCR反应；

(12)对步骤11)PCR反应结果进行电泳检测，分别设置样品孔、阳性对照 孔和参比孔；所述样品孔取步骤11)样品组PCR反应产物5μL与6×LoadingBuffer 1μL混合，加入到1％琼脂糖凝胶点样孔中；所述阳性对照孔取步骤11)阳性对照 组PCR反应产物5μL与6×LoadingBuffer1μL混合，加入到1％琼脂糖凝胶点样孔 中；所述参比孔取5μLDL2000DNAMarker加入到1％琼脂糖凝胶点样孔中；以 140V电压分别对所述样品孔、所述阳性对照孔和所述参比孔进行电泳约20min 后，于凝胶成像系统下观察结果；若样品电泳条带出现与阳性对照相同大小的条 带(副溶血弧菌464bp、鰤诺卡氏菌690bp、美人鱼发光杆菌954bp)，则说明 待测样品含有相对应的细菌。

2、检测结果：

检测结果如图2所示，图2中泳道M为MarkerDL2000；泳道1为三种病原菌三 重PCR阴性对照；泳道2为三种病原菌三重PCR阳性对照；泳道3为含有三种病原 菌养殖水体样品的三重PCR扩增结果；泳道4为不含有三种病原菌养殖水体样品 的三重PCR扩增结果；从图2可以看出含有三种病原菌养殖水体样品检测出相应 的3条条带，并且与阳性对照条带大小相同，不含有三种病原菌养殖水体样品并 未检测出条带，即说明本发明的副溶血弧菌、鰤诺卡氏菌和美人鱼发光杆菌检测 用引物组可以准确、特异性地检测出养殖水体中是否含有副溶血弧菌、鰤诺卡氏 菌和美人鱼发光杆菌。

上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本 发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方 案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖 在本发明的权利要求范围当中。