作为HSP27突变型（S135F）携带者的Charcot-Marie-Tooth病的动物模型

技术领域

本发明涉及HSP27突变(S135F)介导的Charcot-Marie-Tooth病的动物模型。

背景技术

对于开发新药和新的治疗方法来说，在以人为目标的研究中，使用动物模型的实验是不可避免的，并且必须在对人进行治疗之前完成。但是，考虑到人疾病的数量很大，而能够复制这样的人疾病的动物模型的数量非常小，这对新药和新的疾病治疗技术的开发而言是很大的障碍。可根据使用目的，构建具有不同特征和作用的多种动物模型。迄今已知的用于构建疾病动物模型的方法可分为三组。第一组方法是使用天然突变型形式作为动物疾病模型的方法；第二组方法是通过给予化学品或移植经操作的细胞系来诱导疾病的实验方法；以及，最新的方法是通过从分子遗传学途径快速发展出的基因移植进行的转染。对于开发新药和新治疗方法的研究，基于用于稳固动物模型的各种不同研究方法及它们的协作来建立有效的动物模型构建系统非常重要。

遗传性周围神经病变主要分为三类：遗传性运动感觉神经病变(HMSN)、遗传性运动神经病变(HMN)和遗传性感觉神经病变(HSN)。其中，大多数患者为遗传性运动感觉神经病变，其也被称为Charcot-Marie-Tooth病(CMT)。Charcot-Marie-Tooth病由法国科学家Charcot和Marie以及英国人Tooth于1886年首次鉴定。此后，该病以他们名字的首字母命名为CMT。Charcot-Marie-Tooth病是在运动神经元和感觉神经元中具有缺陷的所有遗传性疾病的总称，并且在罕见疾病中发病率最高(1/2500)。过去，该疾病被过于简单地理解为由远端下肢中的肌肉萎缩引起的疾病。由于肌肉萎缩，患有该病的患者具有倒立的香槟酒瓶状的腿。然而，该病现在被公认是综合征，而不是单一疾病。最近关于CMT的发病机制已经有新的发现，这不仅对病理生理学研究有很大帮助，而且对复杂的临床类型和基因型的分类有很大帮助。

在过去几年的研究中，已通过基因克隆技术鉴定出关于遗传性运动感觉神经病变的至少40个基因座，并且还已鉴定出至少20个致病基因。然而，经确认，许多遗传性运动感觉神经病变患者与上述所鉴定出的基因座并不相关，这表明存在至少50个以上HMSN致病基因。因此，对形成各种不同神经组织的成分均进行了鉴定。同样，预计可能存在多种类型的遗传性神经病变，因为存在多种遗传性肌肉营养不良(musculardystrophies)。作为CMT1A(HMSN的最常见类型)的潜在的合理药物疗法，奥那司酮(onapriston)、抗坏血酸和NT-3(神经营养蛋白-3)在诊断和治疗方面引起了我们的关注。

热休克蛋白(HSP)作为分子伴侣和抗细胞凋亡蛋白众所周知，在大多数细胞中表达并在其中保存完好。根据氨基酸序列和分子量，热休克蛋白分为五组：100-110kDa家族、83-90kDa家族、66-78kDa家族、60kDa家族以及15-30kDa家族。HSP27属于小热休克蛋白家族，在哺乳动物组织(包括肌肉组织和神经组织)中表达。HSP27广泛分布于运动神经元和感觉神经元中。

HSP27是在细胞中以多种方式起作用的低分子量蛋白。该蛋白自身形成集落以自卫抵御外界环境刺激(例如自由基或毒素)。

本发明人试图开发出用于Charcot-Marie-Tooth病的疾病定制医学技术。结果，本发明人从CMT患者来源的样品分离出成纤维细胞，由此构建出表达突变型HSP27(S135F)蛋白(其中，第135位的丝氨酸被替换为苯丙氨酸)的表达载体。在将所述表达载体注射入接合子(zygote)后，本发明人将所述接合子植入到代孕母体中。然后，选择在基因组DNA中携有所述表达载体的小鼠。结果，在携有表达突变型HSP27(S135F)蛋白的表达载体的小鼠中确认了Charcot-Marie-Tooth病的表型。此后，本发明人确认了该Charcot-Marie-Tooth病动物模型可有效地用于CMT治疗药物开发的前体筛选，从而完成了本发明。

发明内容

技术问题

本发明的目的是提供HSP27突变(S135F)介导的Charcot-Marie-Tooth病动物模型、其制备方法、以及使用所述动物模型进行的Charcot-Marie-Tooth病治疗药物候选物的筛选方法。

技术方案

为了实现上述目的，本发明提供了Charcot-Marie-Tooth病(CMT)小鼠模型的接合子，所述接合子引入有表达突变型HSP27蛋白(其中，从N末端起第135位的氨基酸丝氨酸被替换为苯丙氨酸)的表达载体。

本发明还提供了通过将本发明的接合子植入到代孕母体的子宫中而获得的转基因小鼠。

本发明进一步提供了用于制备Charcot-Marie-Tooth病小鼠模型的方法，所述方法包括以下步骤：

1)构建能够表达突变型HSP27蛋白的表达载体，在所述突变型HSP27蛋白中，从N末端起第135位的氨基酸丝氨酸被替换为苯丙氨酸；

2)将步骤1)的表达所述突变型HSP27的所述表达载体引入小鼠的接合子中；以及

3)通过将步骤2)中制备的所述接合子植入到代孕母体的子宫中，获得转基因小鼠。

另外，本发明提供了Charcot-Marie-Tooth病的预防性和治疗性物质候选物的筛选方法，所述筛选方法包括以下步骤：

1)将样品给予本发明的转基因小鼠；

2)对步骤1)的用所述样品处理的所述转基因小鼠中的突变型HSP27基因或蛋白的表达水平进行测量；以及

3)选择相比未经所述样品处理的对照组而言能够显著降低突变型HSP27基因或蛋白的表达的样品。

具体实施方式

在下文中，对本发明进行详细说明。

本发明提供了Charcot-Marie-Tooth病(CMT)小鼠模型的接合子，所述接合子引入有表达突变型HSP27蛋白(其中，从N末端起第135位的氨基酸丝氨酸被替换为苯丙氨酸)的表达载体。

所述突变型HSP27蛋白(其中，从N末端起第135位的氨基酸丝氨酸被替换为苯丙氨酸)优选包含由SEQ.ID.NO:1所表示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，但不总限于此。为了获得所述突变型，将HSP27基因中编码所述丝氨酸的密码子TCC优选替换为编码苯丙氨酸的密码子TTC或TTT。在本发明的优选实施方式中，编码所述丝氨酸的密码子更优选被替换为TTC，但不总限于此。

本发明还提供了通过将本发明的接合子植入到代孕母体的子宫中而获得的转基因小鼠。

所述转基因小鼠通过将本发明的接合子植入到代孕母体的子宫中而获得，所述接合子表达突变型HSP27蛋白(其中，从N末端起第135位的氨基酸丝氨酸被替换为苯丙氨酸)，并且，该小鼠模型优选具有诱发的Charcot-Marie-Tooth病，但不总是限于此。本发明的转基因小鼠可通过常规的转基因小鼠制备方法来构建。

在本发明的优选实施方式中，本发明人从CMT患者样品中得到HSP27mRNA。通过PCR对所得到的HSP27mRNA进行扩增，以制备S135F突变型(参见图1A)。将扩增的HSP27(S135F)蛋白克隆进表达载体(参见图1C)，并对其进行DNA测序。结果，确认了第135位的氨基酸丝氨酸被替换为苯丙氨酸(参见图1D)。将所述HSP27(S135F)表达载体引入用于转染的细胞系，随后对HSP蛋白的表达进行调查(参见图1E)。

将构建的HSP27(S135F)表达载体注射入小鼠的接合子，并将所述接合子移植到代孕母体的子宫中。选择确认了HSP27(S135F)表达载体的表达的小鼠(参见图2)。然后，进行旋转杆测试和握力测试。结果，确认了所构建的HSP27(S135F)突变型小鼠相比野生型对照组而言，显示出显著下降的下肢力量(参见图5、图6和图8)，这表明在所述突变型小鼠中确认了Charcot-Marie-Tooth病的表型。

因此，确认了本发明的HSP27(S135F)介导的CMT动物模型可有效地用于Charcot-Marie-Tooth病的预防性和治疗性药剂的筛选。

本发明进一步提供了用于制备Charcot-Marie-Tooth病小鼠模型的方法，所述方法包括以下步骤：

1)构建能够表达突变型HSP27蛋白的表达载体，在所述突变型HSP27蛋白中，从N末端起第135位的氨基酸丝氨酸被替换为苯丙氨酸；

2)将步骤1)的表达所述突变型HSP27的所述表达载体引入小鼠的接合子中；以及

3)通过将步骤2)中制备的所述接合子植入到代孕母体的子宫中，获得转基因小鼠。

步骤1)的所述突变型HSP27蛋白(其中，从N末端起第135位的氨基酸丝氨酸被替换为苯丙氨酸)优选包含由SEQ.ID.NO:1所表示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，但不总限于此。为了获得所述突变型，将HSP27基因中编码所述丝氨酸的密码子TCC优选替换为编码苯丙氨酸的密码子TTC或TTT。在本发明的优选实施方式中，编码所述丝氨酸的密码子更优选被替换为TTC，但不总限于此。

本文中的表达载体优选含有CMV启动子，并优选为哺乳动物表达载体，但不总限于此。

在本发明的优选实施方式中，本发明人确认了本发明的HSP27(S135F)介导的Charcot-Marie-Tooth病动物模型可有效地用于Charcot-Marie-Tooth病的预防性和治疗性药剂的筛选。

另外，本发明提供了Charcot-Marie-Tooth病的预防性和治疗性物质候选物的筛选方法，所述筛选方法包括以下步骤：

1)将样品给予本发明的转基因小鼠；

2)对步骤1)的用所述样品处理的所述转基因小鼠中的突变型HSP27基因或蛋白的表达水平进行测量；以及

3)选择相比未经所述样品处理的对照组而言能够显著降低突变型HSP27基因或蛋白的表达的样品。

步骤1)的样品优选选自于由如下样品所组成的组：肽、蛋白、非肽化合物、活性化合物、发酵产物、细胞提取物、植物提取物、动物组织提取物和血浆，但不总是限于此。

步骤1)的转基因小鼠通过将本发明的接合子植入到代孕母体的子宫中而获得，所述接合子表达突变型HSP27蛋白(其中，从N末端起第135位的氨基酸丝氨酸被替换为苯丙氨酸)，并且，该小鼠模型优选具有诱发的Charcot-Marie-Tooth病，但不总是限于此。本发明的转基因小鼠可通过常规的转基因小鼠制备方法来构建。

在步骤2)中，基因表达水平优选通过选自于由如下方法所组成的组中的方法进行测量：RT-PCR、实时RT-PCR、微阵列、Northern印迹、SAGE(基因表达系列分析)和RNase保护分析，但不总限于此。蛋白表达水平优选通过选自于由如下方法所组成的组中的方法进行测量：蛋白质印迹、酶联免疫吸附分析(ELISA)、免疫组织化学染色、免疫沉淀和免疫荧光，但不总限于此。

在本发明的优选实施方式中，本发明人确认了本发明的HSP27(S135F)介导的Charcot-Marie-Tooth病动物模型可有效地用于Charcot-Marie-Tooth病的预防性和治疗性药剂的筛选。

有益效果

本发明涉及HSP27突变(S135F)介导的Charcot-Marie-Tooth病(CMT)的动物模型。具体而言，将表达突变型HSP27蛋白(其中，第135位的丝氨酸被置换为苯丙氨酸)的载体注射进小鼠接合子中，然后选择携有所述表达载体的小鼠。确认了所选小鼠显示出Charcot-Marie-Tooth病表型，从而预计该动物模型能够有效地用于CMT治疗药物开发的前体筛选。

附图说明

参考附图来更好地理解本发明的优选实施方式的应用，其中：

图1为说明用于制备表达突变型HSP27(S135F)蛋白的表达载体的方法的图。

A：通过PCR扩增CMT患者样品中的HSP27蛋白；

B：将扩增的HSP27蛋白克隆进pGEM-T载体；

C：将克隆进pGEM-T载体中的HSP27蛋白克隆进pcDNA3.1(+)；

D：确认插入表达载体的突变型HSP27蛋白中的S135F突变；以及

E：确认HSP27(S135F)蛋白的表达(-1：克隆1；-3：克隆3；-4：克隆4)。

图2为说明选择携有HSP27(S135F)表达载体的小鼠的图。准确地说，对从引入有HSP27(S135F)表达载体的接合子发育而来的小鼠进行调查，如果在其基因组DNA中确认了该表达载体，则选择该小鼠。

图3为说明表达HSP27(S135F)蛋白的小鼠的图。

图4为说明旋转杆测试(rotarodtest)过程的图。

图5为说明通过旋转杆测试评价第一代小鼠(雄性和雌性皆有)的下肢力量的图。

图6为说明通过旋转杆测试评价第一代小鼠的幼崽的下肢力量的图。

图7为说明握力测试过程的图。

图8为说明通过握力测试评价本发明中所选的第一代小鼠的幼崽的下肢力量的图。

如下列实施例中所示的，本发明的实用和目前优选的实施方式是说明性的。

然而，可以理解的是，在考虑本公开的基础上，本领域技术人员可在本发明的精神和范围内进行修改和改进。

实施例

实施例1：HSP27(S135F)表达载体的构建

<1-1>表达HSP27蛋白的S135F突变型形式的表达载体的构建

构建了表达突变型HSP27蛋白(可引起Charcot-Marie-Tooth病)的表达载体。

具体而言，根据制造商的说明书，通过使用RNeasyminikit(QIAGEN，Germany)从获得自CMT患者的成纤维细胞中提取mRNA，通过使用Superscript逆转录酶试剂盒(Invitrogen，USA)从所述mRNA合成cDNA。通过使用下述引物，用合成的cDNA作为模板进行PCR(94℃30秒，60℃30秒，72℃30秒，35个循环)(图1A)。将PCR产物克隆进pGEM-TEasy载体(Promega，USA)(图1B)。

正向(SEQ.ID.NO：2)：5′-atgaccgagcgccgcgtccccttct-3′，和

反向(SEQ.ID.NO:3)：5′-ttacttggcggcagtctcatcgg-3′。

对HSP27基因的S135F突变型形式的序列进行了确认，随后通过使用限制性酶EcoRI将其克隆进含有CMV启动子的pcDNA3.1(+)(Invitrogen，USA)中(图1C)，从而构建了pcDNA3.1(+)HSP27(S135F)表达载体。

结果，如图1D中所示，确认了HSP27第135位的氨基酸丝氨酸(S)被替换为苯丙氨酸(F)(图1D)。

<1-2>HSP27(S135F)蛋白的表达

进行蛋白质印迹以确认通过实施例<1-1>的方法构建的HSP27(S135F)的表达。

具体而言，用实施例<1-1>中构建的HSP27(S135F)表达载体[pcDNA3.1(+)HSP27(S135F)]转染HEK293细胞系(ATCC)。24小时后，将细胞用PBS洗涤，随后用1×RIPA进行裂解。通过BCA法对提取的蛋白进行定量。通过电泳对等量的蛋白进行分离，并将所述蛋白转移到硝酸纤维素膜(AmershamBiosciences，英国)上。为了防止蛋白的非特异性结合，向含有0.1％吐温20的PBS中添加5％脱脂奶粉。用抗HSP27抗体(SantaCruzBiotechnology，USA)作为一抗对膜进行处理，随后在4℃下反应过夜。然后，将细胞以5分钟的间隔洗涤三次。用二抗[抗山羊IgG-HRP(抗山羊IgG-HRP)，SantaCruz，USA]对其进行处理，随后反应1小时。通过ECL法(Pierce，Rockford，IL，USA)将该膜显影。

结果，如图1E中所示，确认了HSP27(S135F)蛋白在HEK293细胞系中显著表达(图1E)。

实施例2：小鼠模型的构建

通过使用由实施例1的方法制备的表达HSP27(S135F)的pcDNA3.1(+)HSP27表达载体和C57BL/6NCrliOri小鼠(OrientBio，韩国)来构建小鼠模型。

具体而言，为了制备接合子，以48小时的间隔，用PMSG和hCG激素注射雌性小鼠以诱导超排卵(super-ovulation)，随后与雄性小鼠交配。次日早晨，检查阴道栓(vaginalplug)以确认交配是否成功。从确认具有阴道栓的雌性小鼠输卵管中获得接合子。在显微镜下，通过使用微移液管，经由透明带和细胞质将表达HSP27(S135F)的表达载体注射到接合子中。在用DNA注射的接合子中，选择存活的接合子并移植到代孕母体的输卵管中。移植后19天，由正常分娩获得共72只小鼠。使用如下引物进行PCR(94℃30秒，60℃30秒，72℃30秒，35个循环)。结果，选择出确认基因组DNA中具有HSP27(S135F)表达载体的小鼠。

正向2(SEQ.ID.NO:4)：5′-gacgtcaatgggagtttgtttt-3′，和

反向2(SEQ.ID.NO:5)：5′-gagatgtagccatgctcgtcct-3′。

如图2中所示，选择了表达HSP27(S135F)的12只小鼠(图2)，并确认所述小鼠患有Charcot-Marie-Tooth病。

实验实验例1：通过表达HSP27的小鼠的行为评价来确认CMT表型

<1-1>通过旋转杆测试测量小鼠的下肢力量

为了确认实施例2中制备的小鼠是否具有Charcot-Marie-Tooth病表型，进行了旋转杆测试(行为评估测试)(图4)。

具体而言，使小鼠位于以2m/s的速度移动的旋转杆上。测量小鼠将其自身维持在旋转杆上的时间。在测试前，允许小鼠练习三次(一周内)以适应。在记录的当天，在测试前允许练习1分钟。每周测量一次持续时间(endurancetime)。时间记录持续直至7分钟。原样记录少于7分钟的时间，如果持续时间少于3分钟，允许共3次尝试并记录最佳记录。

结果，如图5中所示，选择出共12只第一代小鼠用于测试，并将它们按性别分开，当它们5个月大时开始进行测试，每周一次，持续3个月。将记录的时间平均。其中，M11和M26表现出与在CMT患者中观测到的表型相同的CMT表型(图5)。

对于所选的第一代M11和M26小鼠的幼崽，经由旋转杆测试对下肢力量测量10周，每周一次。结果，如图6中所示，与野生型小鼠相比，它们的下肢力量显著下降(图6)。

<1-2>经由握力测试测量小鼠的肌肉力量

为了确认实验实施例<1-1>中所选的M11和M26的幼崽是否具有Charcot-Marie-Tooth病表型，进行了握力测试(行为评估测试之一)(图7)。

具体而言，通过测量仪器在握力测试仪(griptestermachine)上附着的网上感测测试小鼠的四足的瞬间握力，结果以g力单位表示。在测量前给予三个练习期，并在测试当天重复三次进行测试并记录平均值。

结果，如图8中所示，与野生型小鼠相比，HSP27-S135F突变型小鼠的下肢力量显著降低(图8)。这个结果与实验实施例<1-1>中的旋转杆测试结果一致。