一种芽孢杆菌、利用芽孢杆菌生产纤溶酶的方法及纤溶酶在溶栓药物中的应用

技术领域

本发明属于发酵工程和生物制药技术领域，具体地说，涉及一种枯草芽孢杆菌、利用该菌制备纤溶酶的方法及纤溶酶在溶栓药物中的应用。

背景技术

血栓病是一类严重危害人类健康和生命的疾病，据估计，全世界有血栓病患者约1500万人，其中每年死于心脑血栓疾病的就高达1200万人，据世界卫生组织（WHO）统计，由于心肌梗死、脑溢血等血栓性疾病导致的死亡已占到全球总死亡人数的51%，在我国，随着人们生活水平和生活方式的改变，膳食中高脂肪、高蛋白的过量摄取，血栓性疾病已超过癌症和糖尿病成为第一大健康杀手。治疗血栓病的药物根据其不同的作用机制可分为：一、纤溶酶原激活剂，如尿激酶(UK)组织型血纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)等通过激活血液中的纤溶酶原来降解纤维蛋白；二、纤维蛋白酶，如蚓激酶、多种蛇毒抗栓酶等，直接降解血液中的纤维蛋白。微生物一直都是纤溶酶的重要来源，尤其芽孢杆菌属细菌，已经分离到数十种不同类型的纤溶酶，如分离自BacillusSubtilis的NK,分离自Bacillusamyloliquefaciens的DC4等，其他如BacillussubtilisinCarlsberg，Bacilluscereus等细菌均有报道分离到纤溶酶（在Peng,Yong,XiaojuanYang,andYizhengZhang."Microbialfibrinolyticenzymes:anoverviewofsource,production,properties,andthrombolyticactivityinvivo."Appliedmicrobiologyandbiotechnology69.2(2005):126-132有报道），但利用Bacillustequilensis来分离制备纤溶酶却一直未见报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，旨在提供一种新型芽孢杆菌以及利用该芽孢杆菌进行纤溶酶生产的方法，还包括该纤溶酶在在溶栓药物中的应用。

本发明所述芽孢杆菌所采用的技术方案是，该菌株命名为Bacillustequilensis，其保藏编号为：CGMCCNo.11462。

利用上述芽孢杆菌进行纤溶酶生产的方法包括以下步骤：将菌种芽孢杆菌（Bacillustequilensis）（其保藏编号为：CGMCCNo.11462）进行发酵培养，从发酵产物中分离纯化得到芽孢杆菌纤溶酶。

进一步地，所述芽孢杆菌分离自土壤，在完成发酵后，进行如下步骤：

（1）发酵液或固体发酵产物洗脱液中加入75%硫酸铵完全沉淀蛋白；

（2）溶解沉淀，经透析去掉残余硫酸铵分子；

（3）透析结束后以MonoQ强阴离子层析，用NaCl洗脱，收集活性部分；

（4）所得具有活性的纤溶酶经Sepcryal-100凝胶柱层析，收集活性峰，冻干后得到纯度高于90%的纤溶酶，SDS-PAGE电泳呈单一条带。

更进一步地，在发酵过程中，采用的是液体培养基，该液体培养基为：按比例称取大豆及MgCl₂，添加双蒸水，置于200ml烧杯中，121℃,20min灭菌，待冷却得培养基，其中的大豆、MgCl₂及双蒸水的质量/质量/体积比为w/w/v=10:1:5；或者称取蛋白胨:酵母粉:氯化钠:氯化镁（2:1:2:1）的重量溶于100倍体积（w/v）的蒸馏水中，分装在于200ml、1/3装液量的三角瓶中，121℃,20min灭菌，待冷却得培养基。

利用上述方法制备得到的纤溶酶在溶栓药物中的应用，所述纤溶酶在溶栓药物中用于激活血液中的纤溶酶原来讲解纤维蛋白。

本发明的有益效果是：本发明方法制备得到的酶可以直接、迅速降解纤维蛋白，具有良好的血栓溶解作用，分子量较尿激酶小，引发人体免疫反应风险较低，具有开发成临床药物的重要价值。同时，该酶的生产原材料丰富，成本低廉，制备工艺简单，易放大实现工业化生产，是一种可用于膳食补充剂和药物的重要溶栓成分。

附图说明

图1为制备所得高纯度酶经SDS-PAGE电泳后呈单一条带；

图2为使用纤维平板法测定酶活性，经2h后该纤溶酶所产生的纤溶圈。

具体实施方式

下面，以具体的实施例对本发明作更进一步的说明。

（一）芽孢杆菌的分离制备

将采自广东省珠海市的土壤样品，经无菌水稀释，静置取上清，稀释后采用涂板法用纤维蛋白培养基进行筛选分离（每升培养基含蛋白胨：5g,酵母粉：2g，技术琼脂：18g,脱脂牛奶：250ml），能够在纤维蛋白平板上形成透明圈的菌种单独挑出进一步培养。

对于第一步培养的细菌采用改进后的纤维蛋白平板（纤维蛋白原：5g,硫酸铵：2g,CaCl₂：1g,K₂HPO₄：0.1g,KH₂PO₄：0.1g,MgSO₄:0.2g）进行复筛，对于能够在次形成透明圈的菌株进行培养保存。

（二）选取形成透明圈直径最大的菌株，提取其16srDNA进行测序，测序结果在NCBI数据库中进行比对，16srDNA信息为该菌株鉴定的主要依据。其中，在测序中，正向引物为27f：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；反向引物1492r：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。

（三）纤溶酶的制备

实施例一：

称取20克大豆及2gMgCl₂，添加双蒸水10ml，置于200ml烧杯中，121℃,20min灭菌，待冷却后，接种一环Bacillustequilensis菌种。32℃，72h发酵。

发酵完成后将200ml无菌水加入培养基，搅拌0.5h,4层纱布过滤除去菌体及不溶性杂质，其余杂质可使用11500rpm，20min离心除去。缓慢加入112g固体硫酸铵，搅拌均匀，4℃静置1h，待酶完全沉淀。

沉淀加入45mlNa₂CO₃/NaHCO₃(30mMpH9.2)溶液完全溶解，使用分子量为5kDa或8kDa的透析袋在Na₂CO₃/NaHCO₃(30mMpH9.2)溶液中进行透析，每8h更换一次透析液，共三次，去除残留硫酸铵分子。

以2.5ml/min速度用双蒸水平衡MonoQ预装柱（1.6*2.5cmGEHealthcare瑞典）10倍柱体积，然后更换流动相为Na₂CO₃/NaHCO₃(30mMpH9.2流动相A)，以相同流速平衡柱子16倍柱体积，将上一步所制得粗酶液样品加载在柱子上，以流动相A冲洗6倍柱体积，然后在3个柱体积内线性增加流动相B（流动相A含1MNaCl）至100%洗脱，收集有纤溶活性部分。

将上述收集得到的目标酶液使用加载在Sephcryal-100凝胶层析柱上，使用流动相Na₂CO₃/NaHCO₃(30mMpH9.2)以0.5ml/min的速度冲洗，收集活性峰，脱盐冷冻干燥后得高纯度纤溶酶。

实施例二：

称取蛋白胨：酵母粉：氯化钠：氯化镁（2：1：2：1）的重量溶于100倍体积（w/v）的蒸馏水中，分装在于200ml、1/3装液量的三角瓶中，121℃,20min灭菌，待冷却后，每瓶接种一环Bacillustequilensis菌种。35℃，72h发酵。

发酵完成后将发酵4层纱布过滤除去菌体及不溶性杂质，其余杂质可使用11500rpm，20min离心除去。待冷却后缓慢加入每升发酵液加560g无水硫酸铵粉末，搅拌均匀，4℃静置4h，待酶完全沉淀。

沉淀用尽可能少量Na₂CO₃/NaHCO₃(30mMpH9.2)溶液完全溶解，1L发酵液所产沉淀用15ml溶液溶解。使用分子量为5kDa或8kDa的透析袋在Na₂CO₃/NaHCO₃(30mMpH9.2)溶液中进行透析，每8h更换一次透析液，共三次，去除残留硫酸铵分子。

以2.5ml/min速度用双蒸水平衡MonoQ预装柱（1.6*2.5cmGEHealthcare瑞典）10倍柱体积，然后更换流动相为Na₂CO₃/NaHCO₃(30mMpH9.2流动相A)，以相同流速平衡柱子16倍柱体积，将上一步所制得粗酶液样品加载在柱子上，以流动相A冲洗6倍柱体积，然后在3个柱体积内线性增加流动相B（流动相A含1MNaCl）至100%洗脱，收集有纤溶活性部分。

将上述收集得到的目标酶液使用加载在Sephcryal-100凝胶层析柱上，使用流动相Na₂CO₃/NaHCO₃(30mMpH9.2)以0.5ml/min的速度冲洗，收集活性峰，脱盐冷冻干燥后得高纯度纤溶酶。

将所得纯酶使用Edman降解法测定N端氨基酸残基序列，结果显示该酶N端前10个氨基酸序列为：AQSVPYGISQ，将该纤溶酶序列与其他芽孢杆菌产纤溶酶序列进行对比，得到结果为：

表1不同来源纤溶酶N端序列比较

将所得纯酶添加不同种类和浓度金属离子和蛋白酶抑制剂后测定其酶活。

表2蛋白酶抑制剂对该酶活性影响

表3金属离子对该酶影响

由表2可知，纤溶酶的纤溶活性可被PMSF、EDTA、和β-巯基乙醇抑制。由表3可知K⁺,Mg²⁺，Mn²⁺和Ca²⁺都对该纤溶酶活性有较强的促进作用，该结果与其他芽孢杆菌所产的纤溶酶结果一致。

本发明所述纤溶酶具有能直接降解纤维蛋白的纤溶活性，有良好的血栓溶解和显著抑制静脉血栓形成的作用，并且分子量较小，同时，该酶的生产原材料丰富，生产工艺简便，成本低廉，能弥补尿激酶等现有临床药物在生产和治疗方面的不足，具有极大的开发价值。

本发明可应用于发酵工程和生物制药技术领域。

SEQUENCELISTING

<110>辛雄、雷波、蔡宗苇

<120>一种芽孢杆菌、利用芽孢杆菌生产纤溶酶的方法及纤溶酶在溶栓药物中的应用

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<223>反向引物1492r

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<212>DNA

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<223>芽孢杆菌菌株16srDNA序列

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